HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng pps

HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein huyết từ kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP) Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dịng tế bào IR983F, định lượng nồng độ AFP huyết từ 0,5ng/ml Nghiên cứu định lượng AFP 90 mẫu huyết thanh, 35 mẫu huyết người bình thường, 14 mẫu huyết bệnh nhân có HBsAg (+), 16 mẫu huyết bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết bệnh nhân u gan Giá trị AFP tương ứng 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP huyết bệnh nhân u gan > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%) Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP sản xuất từ chuột LOU có khả định lượng AFP huyết từ 0,5-350ng/ml ABSTRACT THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTI-ALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 11 - No - 2007: 208 - 212 Purpose: Set up the system for quantitative determination of alphafetoprotein in serum using monoclonal antibodies Method: Experimental research Results: The test ELISA for quantitative determination of alphafetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%), respectively Conclusion: The system for quantitative determination of alphafetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml ĐẶT VẤN ĐỀ Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng Georges Kohler César Milstein trình bày năm 1975(1), từ kháng thể đơn dòng ứng dụng nhiều lĩnh vực kỹ thuật nhận diện định lượng kháng nguyên * Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP Hồ Chí Minh Alpha-fetoprotein (AFP), glycoprotein, có trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, tổng hợp gan phơi thai túi ối, nồng độ AFP bình thường dịch ối huyết bào thai người cao Tuy nhiên AFP có huyết người sau sinh người trưởng thành thấp, khoảng 3ng/ml(7,9,11) Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát AFP tăng cao, việc định lượng AFP huyết gốp phần chẩn đoán bệnh ung thư gan nguyên phát Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế bào IR983(3), xây dựng hệ thống định lượng AFP huyết người kỹ thuật ELISA(5,10) Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế bào IR983 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm Đối tượng cỡ mẫu nghiên cứu - Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể đơn dịng kháng AFP có gắn men peroxidase - Và 90 mẫu huyết thanh, thu thập Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh Trong 25 mẫu huyết bệnh nhân có siêu âm CT scan phát u gan, 20 nam nữ, 16 mẫu huyết bệnh nhân chẩn đoán viêm gan siêu vi B cấp HBsAg (+), nam nữ, 14 mẫu huyết có HBsAg (+) khơng có biểu lâm sàng, 10 nam – nữ, 35 mẫu huyết người bình thường khỏe mạnh, HBsAg (-) Phương pháp thu thập số liệu - Xác định mối quan hệ tuyến tính hai đại lượng nồng độ AFP giá trị mật độ quang tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA - Xác định mật độ quang tương ứng nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 350, 400, 500 ng/ml Chúng sử dụng AFP tinh chế chuẩn độ Viện Pasteur Tp HCM - Xác định nồng độ AFP thấp định lượng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU: dùng phương pháp ELISA - Xác định mật độ quang tương ứng nồng độ thấp AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; ng/ml Từ xác định nồng độ AFP thấp định lượng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU với phương pháp ELISA - Định lượng AFP mẫu huyết hệ thống định lượng sử dụng kháng thể đơn dòng chuột LOU: dùng phương pháp ELISA Chuẩn bị 90 mẫu huyết đánh số thứ tự từ đến 90, 35 mẫu huyết người bình thường đánh số từ đến 35, 14 mẫu huyết bệnh nhân có HBsAg (+) đánh số từ số 36 đến 49, 16 mẫu huyết bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu huyết bệnh nhân u gan đánh số từ 66 đến 90 Lần mẫu huyết định lượng khơng pha lỗng, lần mẫu huyết có nồng độ 350 ng/ml lần pha loãng với tỉ lệ 1:2 Những mẫu huyết tiếp tục có nồng độ 350ng/ml định lấy kết cuối 500 ng/ml Xử lý số liệu Chương trình Point To Point, chương trình dùng cho xử lý số liệu kỹ thuật Elisa để tính kết định lượng nồng độ AFP Chương trình SPSS 11.5 KẾT QUẢ Quan hệ tuyến tính hai đại lượng nồng độ AFP giá trị mật độ quang tương ứng Với kết thu nhận thấy nồng độ AFP tăng DO tăng theo Nhưng đến nồng độ AFP 350, 400, 500 ng/ml DO tăng khơng đáng kể Do ứng dụng định lượng nồng độ AFP huyết đến mức cao 350ng/ml Qua đường cong chuẩn hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU (đồ thị 1), nhận thấy hai đại lượng DO nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận + r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO nồng độ AFP có mối liên hệ thuận chặt chẽ + Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng: y = a + bx, đó: Như phương trình hồi qui tuyến tính là: y = 0,599 + 0,0055x + P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan tuyến tính theo chiều thuận hai đại lượng DO nồng độ AFP rõ rệt, tương quan có ý nghĩa thống kê Đồ thị 1: Đương cong chuẩn hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn giá trị thấp nồng độ AFP Kết nồng độ AFP chuẩn thấp mà hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU định lượng (đồ thị 2) Qua đường biểu diễn ta thấy nồng độ AFP giảm giá trị DO giảm theo, đến nồng độ 0,5 ng/ml đường biểu diễn ngang Do giá trị thấp mà hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dịng kháng AFP chuột LOU định lượng 0,5 ng/ml Kết định lượng nồng độ AFP mẫu huyết hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU Số thứ Số tự mẫu mẫu trị huyết huyết Giá Giá Giá trị nhỏ trị lớn trung bình thanh 1- 35 1,08 7,26 2,7780 35 36- 14 0,91 6,08 3,7993 50- 16 6,2 113,53 32,1806 49 65 Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân u gan (những mẫu huyết từ số 66 đến 90) đa số > 500 ng/ml (76%), mẫu có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%) BÀN LUẬN Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein huyết người phương pháp Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng sản xuất từ tế bào lymphơ B chuột Lou dịng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy độ đặc hiệu cao có khả định lượng AFP nồng độ thấp 0,5ng/ml so với hệ thống định lượng hãng khác Abbott 0,4ng/ml(2) Maxim Biotech 2ng/ml(6), AFP-L định lượng nồng độ AFP cao 350ng/ml so với hãng Abbott 350ng/ml(2) Maxim Biotech 300mg/ml(6) Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao qua thử nghiệm đặc tính định lượng khơng có phản ứng chéo với protein huyết với albumin, protein có trọng lượng phân tử cấu trúc gần giống với AFP Kết định lượng nồng độ AFP 90 mẫu huyết có kết tương đồng với nghiên cứu ngồi nước(2,6,8) Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dịng sản xuất từ chuột Lou có khả định lượng AFP huyết từ 0,5350ng/ml, chúng tơi hy vọng góp phần nhỏ việc sử dụng hệ thống định lượng AFP KẾT LUẬN Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dịng tế bào IR983, định lượng nồng độ AFP huyết từ 0,5ng đến 350ng/ml Mật độ quang nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p = 0,002 (< 0,01), y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x: nồng độ AFP chuẩn) Kết nồng độ AFP định lượng hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU Giá trị trung bình nồng độ AFP người bình thường 2,8 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân có HBsAg(+) 3,8 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp 32,1 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân u gan đa số > 500 ng/ml (76%), mẫu có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%)  ... IR983(3), xây dựng hệ thống định lượng AFP huyết người kỹ thuật ELISA(5,10) Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein. .. diễn ngang Do giá trị thấp mà hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU định lượng 0,5 ng/ml Kết định lượng nồng độ AFP mẫu huyết hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn... nghiên cứu ngồi nước(2,6,8) Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng sản xuất từ chuột Lou có khả định lượng AFP huyết từ 0,5350ng/ml, hy vọng góp phần nhỏ việc sử dụng hệ thống