Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá ảnh hưởng của điều trị bằng nọc ong lên mediator viêm trên chuột được gây viêm khớp bàn chân. Đối tượng nghiên cứu trên 60 chuột, chia thành 6 nhóm: nhóm chứng, nhóm gây viêm khớp (bằng dung dịch adjuvant complete) điều trị nước muối, nhóm gây viêm điều trị bằng nọc ong và nhóm gây viêm điều trị bằng mobic (liều 1 mg/kg).
Tạp chí y - dợc học quân số 4-2017 ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC MEDIATOR VIÊM TRONG MÁU CỦA CHUỘT ĐƯỢC GÂY MƠ HÌNH GÂY VIÊM KHỚP BÀN CHÂN VÀ ĐIỀU TRỊ BẰNG NỌC ONG Nguyễn Thị Hoa*; Cấn Văn Mão* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá ảnh hưởng điều trị nọc ong lên mediator viêm chuột gây viêm khớp bàn chân Đối tượng phương pháp: tiến hành 60 chuột, chia thành nhóm: nhóm chứng, nhóm gây viêm khớp (bằng dung dịch adjuvant complete) điều trị nước muối, nhóm gây viêm điều trị nọc ong (3 liều khác nhau: 0,5 mg/kg, mg/kg 1,5 mg/kg tiêm vào huyệt Túc tam lý) nhóm gây viêm điều trị mobic (liều mg/kg) Đánh giá mediator viêm thời điểm trước sau điều trị Kết quả: dung dịch adjuvant complete (liều 50 µl, lần) gây tăng nồng độ IL-1, IL-6, TNF-α, giảm nồng độ IL-10 máu Mobic liều mg/kg nọc ong (liều 0,5 mg/kg, mg/kg 1,5 mg/kg) có tác giảm nồng độ IL-1, IL-6, TNF-α tăng nồng độ IL-10 máu sau 21 ngày điều trị Nọc ong liều 1,5 mg/kg có tác dụng mạnh liều lại Kết luận: nọc ong có tác dụng giảm viêm có tác dụng giảm nồng độ IL-1, IL-6, TNF-α tăng nồng độ IL-10 * Từ khóa: Nọc ong; Mediator viêm; Viêm khớp bàn chân Anti-inflammatory Effects of Bee Venom in Experimental Arthritis Rat Summary Objectives: To access the effects of bee venom on inflammatory mediators on the arthritis animals Materials and methods: 60 rats were divided into groups: control group (saline injection), arthritis group (adjuvant injection) with saline treatment, three arthritis groups with bee venom treatments (doses: 0.5 mg/kg, mg/kg and 1.5 mg/kg) respectively and arthritis group with mobic treatment (1 mg/kg), bee venom and mobic were administered in Zusalin acupuncture point in rat’s hind limb Results: Complete adjuvant solution (50 µl) injected in rat’s hind limb (one time) induced increase concentration of IL-6, IL-1 and TNF-α and decrease IL-10 concentration in blood Bee venom (doses: 0.5 mg/kg, mg/kg and 1.5 mg/kg) and mobic (1 mg/kg) reduced concentration of IL-6, IL-1 and TNF-α and raised IL-10 concentration in blood after 21 days treatment The inhibited inflammation mediator effects of 1.5 mg/kg dose is more effective than to other doses Conclusion: Bee venom has anti-inflamation effects due to decrease in IL-1, IL-6, TNF-α concentration and increase in IL-10 concentration in peripheral blood * Key words: Bee venom; Inflammatory mediator; Arthritis ĐẶT VẤN ĐỀ Theo đông y, nọc ong (Bee Venom) từ lâu sử dụng điều trị số bệnh hiệu u bã đậu (mà không cần phẫu thuật), cai nghiện ma túy, viêm khớp…, có nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng chữa bệnh nọc ong sử dụng làm dạng cao xoa giảm đau, * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Cấn Văn Mão (canvanmao2001@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/01/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 18/03/2017 Ngày báo đăng: 27/03/2017 54 T¹p chÝ y - dợc học quân số 4-2017 chng viờm, cho ong đốt trực tiếp vào huyệt tương ứng thể… Hiệu chữa bệnh nọc ong thể người đông vật, số nghiên cứu cho thấy chế chống viêm nọc ong số hợp chất như: enzym A2 (phospholipases, hyaluronidase…), phân tử protein peptid (melittin, secapin…) số chất có phân tử nhỏ (histamine, dopamine, norepinephrine…) [5] Có nhiều mơ hình gây viêm khớp động vật thực nghiệm như: gây viêm khớp adjuvant, carrageenan hay lipopolysaccharide (LPS), mơ hình gây viêm khớp sử dụng dung dịch Freud’s adjuvant nhiều tác giả áp dụng, coi mơ hình gây viêm khớp điển hình [2] Đặc biệt, đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong, mô hình sử dụng rộng rãi [7, 8] Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong nhiều nhà khoa học giới thực với cách thức sử dụng nọc ong khác thực nghiệm như: tiêm da, tiêm bắp, tiêm thủy châm huyệt… Tuy nhiên, số nghiên cứu trước sử dụng nọc ong thủy châm vào huyệt đạo có kết mạnh phương pháp khác [8, 10] Hiện tại, nước chưa thấy có nhiều cơng trình nghiên cứu tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong thực nghiệm lâm sàng Mục đích nghiên cứu: Đánh giá tác dụng nọc ong thủy châm huyệt Túc tam lý (Zusanli) lên biến đổi mediator viêm máu động vật thực nghiệm gây viêm khớp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Chuột cống trắng trưởng thành (cân nặng 150 - 200 g) từ Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp, chia thành nhóm, nhóm 10 - Nhóm chứng: không gây viêm khớp, điều trị dung dịch NaCl 0,9% - Nhóm NaCl: gây viêm khớp, điều trị dung dịch NaCl 0,9% - Nhóm NO.0,5: gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 0,5 mg/kg - Nhóm NO.1: gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều mg/kg - Nhóm NO.1,5: gây viêm khớp, điều trị nọc ong 1,5 mg/kg - Nhóm mobic: gây viêm khớp, điều trị mobic (Boehringer Ingelheim Ellas A.E, Hy Lạp, myloxicam 7,5 mg) liều mg/kg - Nọc ong chiết xuất từ ong mật Apis mellifera, nuôi trang trại ông Lê Minh Điền, ấp Đồng Nhơn, xã Lương Quới, huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre thiết bị thu thập nọc dựa chế sốc điện Chế phẩm tác chiết bảo quản dạng toàn phần, sử dụng theo đưởng tiêm bắp * Hóa chất nghiên cứu: - Dung dịch complete Freund's adjuvant (Sigma Aldrich) - Nọc ong dạng bột - Thuốc mobic (Boehinger Ingelheim), dung dịch NaCl 0,9% 55 T¹p chÝ y - dợc học quân số 4-2017 Thuc mobic Dung dịch complete Freund's adjuvant Hình 1: Thuốc mobic dung dịch complete Freund's adjuvant Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp gây viêm khớp sử dụng thuốc, nọc ong điều trị: - Dung dịch complete Freund's adjuvant (Sigma Aldrich) tiêm liều (50 µl) da vào bàn chân sau bên phải (chuột gây mê thiopentan) để gây viêm khớp cổ chân chuột Nhóm chứng tiêm nước muối sinh lý liều tương đương vào vị trí [2] - Nọc ong dạng bột với liều lượng khác (0,5 mg; mg; 1,5 mg) hòa tan nước muối tiêm vào huyệt Zusanli (Túc tam lý, phía gò chày gần khớp gối) - Nước muối sinh lý sử dụng tương ứng với thể tích nọc ong tiêm vào huyệt Zusanli (Túc tam lý) - Nọc ong nước muối sinh lý tiêm vào huyệt Zusanli tuần liên tục (1 lần/ngày) Huyệt Túc tam lý (Zusanli) người chuột cống trắng Trên người: Zusanli Trên chuột cống: ST36 Hình 2: Vị trí huyệt Túc tam lý người chuột cống [6] * Đánh giá mức độ viêm toàn thân định lượng mediator viêm máu: Các cytokine liên quan đến trình viêm gồm: TNF-α, IL-1, IL-6 IL-10 đánh giá máu ngoại vi trước sau 21 ngày điều trị Lấy máu động vật vào thời điểm ngày (8 sáng) bảo quản ống chứa dung dch chng ụng 56 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 4-2017 EDTA Kỹ thuật ELISA định lượng nồng độ mediator viêm (cytokine) theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất, thực Bộ môn Sinh lý Bệnh Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học quân sự, Học viện Quân y * Phương pháp thống kê xử lý số liệu: Số liệu nghiên cứu xử lý thống kê phần mềm Microsoft Excel 2007 phần mềm SPSS version 20 Kết nghiên cứu thơng số mediator viêm nhóm gây viêm khớp điều trị nọc ong mobic so sánh với nhóm chứng nhóm chứng dương gây viêm không điều trị ngày, sử dụng phân tích phương sai chiều (one way ANOVA), KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Biến đổi IL-6 máu 80 (pg/ml) *** 60 ### *** ### *** ### ** Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm NO.1,5 ### 40 20 Nhóm Nhóm chứng Nhóm2 Nhóm NaCl NO.0,5 NO.1 Nhóm Nhóm mobic Hình 3: Biến đổi IL-6 nhóm chuột (***: p < 0,001 **: p < 0,01: so với nhóm chứng, ###: p < 0,001 so với nhóm NaCl) Nồng độ IL-6 máu chuột tăng cao chuột nhóm NaCl (gây viêm khớp điều trị nước muối) so với nhóm khác thời điểm tuần sau tiêm thuốc gây viêm IL-6 sản xuất loạt tế bào, bao gồm tế bào T, B, nguyên bào sợi, tế bào nội mạc, bạch cầu đơn nhân, tế bào sừng số tế bào khối u IL-6 chất trung gian hóa học phản ứng viêm giai đoạn cấp tính, có liên quan đến sinh bệnh học nhiều tình trạng viêm như: viêm khớp hệ thống tự phát thiếu niên, bệnh Castleman bệnh Crohn Khả ức chế hoạt động IL-6 ứng dụng điều trị viêm rối loạn tự miễn dịch Trong viêm khớp, nguồn tạo nên IL-6 từ tế bào giống nguyên bào sợi khoang khớp [7] Kết nghiên cứu cho thấy chuột tiêm dung dịch adjuvant có nồng độ IL-6 máu tăng cao so với nhóm chứng, chứng tỏ q trình viêm xảy sau tuần tiêm 57 T¹p chÝ y - dợc học quân số 4-2017 Mt s tỏc giả trước nhận thấy chất có tác dụng ức chế hoạt động IL-6 đồng thời làm giảm tình trạng sưng đau, giảm phá hủy xương viêm khớp [7, 8] Nghiên cứu chúng tôi, điều trị nọc ong mobic làm giảm nồng độ IL-6 chuột gây viêm khớp bàn chân, chứng tỏ nọc ong mobic có tác dụng chống viêm khớp gây tiêm dung dịch adjuvant Chuột nhóm mobic (gây viêm khớp, điều trị mobic liều mg/kg) có nồng độ độ IL-6 máu thấp nhóm NO.1,5 (gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 1,5 mg/kg) có số thấp nhóm lại Điều chứng tỏ khả chống viêm qua chế ức chế IL-6 mobic (liều mg/kg) mạnh nọc ong liều 1,5 mg/kg cao so với nọc ong liều 0,5 mg/kg mg/kg Biến đổi nồng độ IL-10 máu (pg/ml) 40 ### *** 35 30 ### *** ### ** ### 25 20 *** 15 10 Nhóm Nhóm chứng Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm NO.0,5 NaCl Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm NO.1,5 mobic NO.1 Hình 4: Biến đổi IL-10 nhóm chuột (***: p < 0,001 **: p < 0,01: so với nhóm chứng, ###: p < 0,001 so với nhóm NaCl) Nồng độ IL-10 máu chuột giảm thấp chuột nhóm NaCl (gây viêm khớp điều trị nước muối) so với nhóm khác thời điểm tuần sau tiêm thuốc gây viêm IL-10 cytokine chống viêm, tế bào lympho T, lympho B hoạt hóa tế bào mono tiết [3] IL-10 chứng minh xuất muộn so với TNF-α Chức sinh học IL-10 kích thích tế bào lympho B phát triển sản xuất kháng thể, kích thích tế bào Mast, ức chế hoạt tính tế bào trình diện kháng 58 nguyên, giảm trình diện kháng nguyên Nó có tác dụng ức chế sản xuất cytokine tiền viêm IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α thông qua ức chế tế bào sinh chúng Nghiên cứu số tác giả trước cho thấy chuột khuyết thiếu IL-10, trình viêm khớp tạo dung dịch adjuvant collagen trở nên nặng hơn, có nhiều phá hủy [3] Kết nghiên cứu cho thấy sau tuần gây viêm dung dịch adjuvant gây giảm nồng độ IL-10 nên dẫn đến q trình viêm tiến triển mạnh T¹p chí y - dợc học quân số 4-2017 iu trị nọc ong mobic có tác dụng tăng nồng độ IL-10 chuột gây viêm khớp bàn chân Kết tương tự nghiên cứu Lei Yi CS: tiêm dung dịch adjuvant vào chân chuột sau tuần gây giảm nồng độ IL-10 dịch chiết Aralia chinesis có tác dụng làm tăng nồng độ IL-10, đồng thời làm giảm số viêm khớp bàn chân chuột [9] Kết nghiên cứu cho thấy chuột nhóm mobic (gây viêm khớp, điều trị mobic liều mg/kg) có nồng độ IL-10 máu cao nhất, tương đương với nhóm chứng Nhóm NO.1,5 (gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 1,5 mg/kg) có nồng độ IL-10 cao nhóm lại Điều chứng tỏ khả chống viêm mobic liều mg/kg mạnh nọc ong liều 1,5 mg/kg cao so với nọc ong liều 0,5 mg/kg mg/kg Biến đổi nồng độ IL-1 máu 400 (pg/ml) *** 350 300 250 ### *** 200 150 100 ### 50 Nhóm Nhóm chứng Nhóm Nhóm NaCl Nhóm Nhóm NO.0,53 Nhóm Nhóm NO.1 ### Nhóm Nhóm NO.1,55 ### Nhóm Nhóm mobic Hình 5: Biến đổi IL-1 nhóm chuột (***: p < 0,001: so với nhóm chứng, ###: p < 0,001 so với nhóm NaCl) Nồng độ IL-1 máu chuột tăng cao nhóm NaCl (gây viêm khớp điều trị nước muối) so với nhóm khác thời điểm tuần sau tiêm thuốc gây viêm Nguồn sản xuất chủ yếu IL-1 đại thực bào đơn nhân hoạt hóa Ngồi ra, IL-1 số tế bào khác sản xuất tế bào trung tính, tế bào biểu mơ, tế bào nội mơ Có hai dạng IL-1 gọi IL-1α IL-1β Chức IL-1 làm trung gian cho đáp ứng viêm thể chủ chống lại nhiễm trùng kích thích viêm khác Trong viêm khớp, IL-1 có nồng độ tăng cao máu dịch khớp, gây tình trạng phá hủy sụn khớp Các thuốc có tác dụng làm giảm nồng độ IL-1 cho thấy khả làm giảm triệu chứng viêm khớp Những nghiên cứu trước người động vật thấy IL-1 tăng bệnh nhân viêm khớp động vật gây viêm khớp Điều trị nọc ong mobic có tác dụng giảm nồng độ IL-1 chuột gây viêm khớp bàn chân Như vậy, nọc ong mobic có tác dụng giảm viêm khớp gây bng tiờm 59 Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 4-2017 dung dịch adjuvant Kết tương tự số tác giả: Bendele A dùng chất có tác dụng đối kháng với receptor IL-1 thấy giảm tình trạng viêm khớp gây dung dịch adjuvant [1] Chuột nhóm mobic (gây viêm khớp, điều trị mobic liều mg/kg) có nồng độ IL-1 máu thấp nhất, tương đương với nhóm chứng Chuột thuộc nhóm NO.1,5 (gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 1,5 mg/kg) có nồng độ IL-1 thấp chuột thuộc nhóm lại Điều chứng tỏ khả chống viêm qua chế ức chế IL-1 mobic (liều mg/kg) mạnh nọc ong liều 1,5 mg/kg cao so với nọc ong liều 0,5 mg/kg mg/kg Biến đổi nồng độ TNF-α máu (pg/ml) 400 350 *** 300 250 200 150 ### 100 ### 50 Nhóm Nhóm chứng Nhóm Nhóm NaCl Nhóm3 Nhóm NO.0,5 Nhóm Nhóm NO.1 ### ### Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm mobic NO.1,5 Hình 6: Biến đổi TNF-α nhóm chuột (###: p < 0,001 so với nhóm NaCl) Nồng độ TNF-α máu chuột tăng cao nhóm NaCl (gây viêm khớp điều trị nước muối) so với nhóm khác thời điểm tuần sau tiêm thuốc gây viêm TNF-α sản xuất bạch cầu mono, lympho T, dưỡng bào Ngoài ra, lượng lớn cytokine vi khuẩn Gram âm sản xuất Iterferon γ tế bào T NK sản xuất có tác dụng khuyếch đại sinh tổng hợp TNF-α đại thực bào Chức TNF-α hoạt hóa bạch cầu N M để tiêu diệt vi khuẩn, tạo nên tập trung bạch cầu, tác dụng lên vùng đồi gây sốt, kích thích 60 gan sản xuất protein… Trên bệnh nhân viêm khớp, nồng độ TNF-α tăng cao thuốc ức chế tác dụng TNF-α có tác dụng làm giảm tình trạng viêm khớp [4] Trên mơ hình động vật gây viêm khớp adjuvant có kết tương tự bệnh nhân [1] Kết nghiên cứu chứng tỏ tiêm dung dịch adjuvant sau tuần phản ứng viêm rõ rệt chuột Điều trị nọc ong mobic có tác dụng giảm nồng độ TNF-α chuột gây viêm khớp bàn chân, chứng tỏ nọc ong mobic có tác dụng chống viêm, tương tự nh mt s nghiờn Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 4-2017 cứu tác giả: Hye Ji Park CS thấy nọc ong có tác dụng ức chế hoạt động TNF-α chống viêm khớp [5], Jae Yeong Lee CS thấy tác dụng chống viêm giảm đau nọc ong chuột gây viêm khớp dung dịch adjuvant [6] Chuột nhóm mobic (gây viêm khớp, điều trị mobic liều mg/kg) có nồng độ độ TNF-α máu thấp nhất, tương đương với nhóm chứng Chuột nhóm NO.1,5 (gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 1,5 mg/kg) có nồng độ TNF-α thấp chuột thuộc nhóm lại Điều chứng tỏ khả chống viêm qua chế ức chế TNF-α mobic (liều mg/kg) mạnh nọc ong liều 1,5 mg/kg) cao so với nọc ong liều 0,5 mg/kg mg/kg KẾT LUẬN Dung dịch adjuvant complete (liều 50 µl tiêm bàn chân chuột lần) gây nên tình trạng viêm khớp, tăng mediator viêm (IL-1, IL-6, TNF-α) giảm nồng IL-10 máu Điều trị viêm khớp mobic (liều mg/kg) nọc ong (liều 0,5 mg/kg, mg/kg 1,5 mg/kg) có tác dụng giảm viêm Tác dụng mobic mạnh nhất, tác dụng nọc ong liều 1,5 mg/kg mạnh liều 0,5 mg/kg liều mg/kg chuột sau tuần điều trị TÀI LIỆU THAM KHẢO Alison M Bendele, Elizabeth S Chlipala, Jon Scherrer, Janet Frazier, Gina Sennello, Ưilliam j Rich, Carl k Edwards Combination benefit of treatment with the cytokine inhibitors interleukin-1 receptor antagonist and pegylated soluble tumor necrosis factor receptor type I in animal models of rheumatoid arthritis Arthrtis and Rheumatism 2000, December, Vol 43, No 12, pp.2648-2659 Bendele A Animal models of rheumatoid arthritis J Musculoskel Neuron Interact 2001, (4), pp.377-385 Claire J Greenhill, Gareth W Jones, Mari A Nowell1, Zarabeth Newton1, Ann K Harvey, Abdul N Moideen, Fraser L Collins, Anja C Bloom1, Rebecca C Coll, Avril AB Robertson, Matthew A Cooper, Marcela Rosas, Philip R Taylor, Luke A O’Neill, Ian R Humphreys, Anwen S Williams 1, Simon A Jones Interleukin-10 regulates the inflammasomedriven augmentation of inflammatory arthritis and joint destruction Falah S Manhal Cytokine profile in patients with rheumatoid arthritis Fac Med Baghdad 2009, Vol 51, No 4, pp.433-436 Hye Ji Park, Seong Ho Lee, Dong Ju Son, Ki Wan Oh, Ki Hyun Kim, Ho Sueb Song, Goon Joung Kim, Goo Taeg Oh, Do Young Yoon, Jin Tae Hong Antiarthritic effect of bee venom Arthritis and Rheumatism 2004, Vol 50, No 11, November, pp.3504-3515 Jae Yeong Lee, Seong Soo Kang, Joong-Hyun Kim, Chun Sik BaeE, Seok Hwa Choi Inhibitory effect of whole bee venom in adjuvant-induced arthritis In vivo 2005, 19, pp.801-806 Jean Y Park, Michael H Pillinger Interleukin-6 in the pathogenesis of reumatoid arthritis Bulletin of the NYU Hospital for Joint Diseases 2007, 65, pp.4-10 Jean-Michel Dayer, Ernest Choy Therapeutic targets in rheumatoid arthritis: the interleukin-6 receptor Rheumatology 2010, 49, pp.15-24 Lei Yi, Jianjun Feng, Haiwang Ji, Xuechong Zhang Effect of Aralia Chinesis on serum TNF-α, IL-4 and IL-10 level in rats with adjuvant-induced arthritis Bangladesh J Pharmacol 2012, 7, pp.285-288 10 Seo D.M, Park D.S, Kang S.G The analgesic effect of bee venom aquaacupuncture and its mechanism in the rat model with adjuvant-induced arthritis J Kor Acu Mox Soc 2003, 20, pp.85-97 61 ... khơng gây viêm khớp, điều trị dung dịch NaCl 0,9% - Nhóm NaCl: gây viêm khớp, điều trị dung dịch NaCl 0,9% - Nhóm NO.0,5: gây viêm khớp, điều trị nọc ong liều 0,5 mg/kg - Nhóm NO.1: gây viêm khớp, ... phá hủy xương viêm khớp [7, 8] Nghiên cứu chúng tôi, điều trị nọc ong mobic làm giảm nồng độ IL-6 chuột gây viêm khớp bàn chân, chứng tỏ nọc ong mobic có tác dụng chống viêm khớp gây tiêm dung... chứng viêm khớp Những nghiên cứu trước người động vật thấy IL-1 tăng bệnh nhân viêm khớp động vật gây viêm khớp Điều trị nọc ong mobic có tác dụng giảm nồng độ IL-1 chuột gây viêm khớp bàn chân