Bài viết Phá vỡ escherischia coli tái tổ hợp bằng Lysozym để phân tích các enzym được biểu hiện trình bày việc thu thập protein tái tổ hợp sau khi biến nạp vào Escherichia coli, nhất là những protein có hoạt tính enzym, đòi hỏi một phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym được bảo toàn. Nghiên cứu nhằm sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli,... Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁ VỠ ESCHERISCHIA COLI TÁI TỔ HỢP BẰNG LYSOZYM ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC ENZYM ĐƯỢC BIỂU HIỆN Lê Thị Kim Tuyến1, Bạch Khánh Hòa2 Trường Đại học Thăng Long, 2Trường Đại học Y Hà Nội Việc thu thập protein tái tổ hợp sau biến nạp vào Escherichia coli, protein có hoạt tính enzym, đòi hỏi phương pháp phá vỡ tế bào hợp lý để hoạt tính enzym bảo toàn Nghiên cứu nhằm sử dụng lysozim để phá vỡ Escherichia coli Phương pháp nghiên cứu: chủng tế bào ER 3081 biến nạp với pSAPV6 tái tổ hợp chứa gen enzim hạn chế chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931 Lysozim dùng để phá vỡ tế bào điều kiện thí nghiệm khác đồng thời hoạt tính enzym hạn chế kiểm tra Kết cho thấy phương pháp sử dụng lysozim để phá vỡ vi khuẩn cho phép thu thập enzim hạn chế tái tổ hợp giữ hoạt tính cao Từ khóa: Phá vỡ tế bào - Escherichia coli, protein tái tổ hợp, nguyên sinh chất, lysozim I ĐẶT VẤN ĐỀ không 40°C số hóa chất thích sử dụng nghiên cứu thành phần hợp Những phương pháp thường dùng siêu âm, nghiền nát, áp lực cao sinh tổng hợp tế bào Gần đây, với phát triển ngành sinh học phân tử, vi khuẩn nhiều tác giả nghiên cứu so sánh với [1] Việc dùng máy móc thường tạo hiệu lực dùng làm tế bào chủ cho plasmit tái tổ hợp phương pháp clon gen Phương cao để vỡ màng tế bào ảnh Trong lịch sử, Escherichia coli thường pháp cần thiết cho việc sản xuất loại protein ứng dụng nghiên cứu hưởng khơng đến ngun vẹn protein giải phóng Mặt khác, vách nhiều lĩnh vực đời sống xã hội [2] Việc tế bào vi khuẩn chứa lớp peptidoglycan lysozim enzim có chức phân nghiên cứu protein nguyên sinh chất Escherichia coli đòi hỏi trải qua giai đoạn hủy đặc hiệu peptidoglycan, có vai trò làm phá vỡ vi khuẩn Tuy nhiên, pepti- phá vỡ tế bào vi khuẩn Có nhiều phương pháp vật lý dùng nghiền nát, doglycan thành phần vách tế bào siêu âm nhiệt độ cao để làm vỡ màng vi khuẩn Gram + vi khuẩn Gram có Escherichia coli, lớp peptidoglycan vách tế bào Có phương pháp sử dụng chất hóa học dùng hóa chất kiềm Vấn đề mỏng bị bao phủ lớp màng bên [3] Sử dụng phương pháp enzym đặt lựa chọn phương pháp phù hợp nhằm bảo vệ hoạt tính cao để phá vỡ vi khuẩn tốt để giữ nguyên vẹn protein nguyên sinh chất, thêm protein dễ bị thoái hóa Điều có nghĩa phương pháp sử dụng với nhiệt độ khơng đòi hỏi máy móc Địa liên hệ: Bạch Khánh Hòa, mơn Huyết học Truyền máu, trường Đại học Y Hà Nội, Email: hoa17med@gmail.com Ngày nhận: 08/01/2013 Ngày chấp thuận: 20/6/2013 Đã có quy trình sử dụng lyzozim nhiệt độ cao 100ºC để phá vi khuẩn Escherichia coli trình tách chiết ADN [4] Tuy nhiên, quy trình khơng áp dụng cho việc nghiên cứu protein nhiệt độ cao làm thối hóa hoạt tính protein Vì lý đó, chúng tơi nghiên cứu sử dụng TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC lysozim để phá vỡ vi khuẩn Escherichia coli mM EDTA, 3,3mM Tris HCl pH8, 0,017% SDS nhiệt độ ≤ 40°C nhằm bảo vệ hoạt tính protein Quy trình áp dụng cho việc phân 0,015% bromophenol blue) Sản phẩm phản ứng phân tích gel 1% agarose tích enzym tái tổ hợp biểu nguyên sinh chất với thang ADN chuẩn lambda - Hind III PhiX174 - HaeIII lambda - BstEII II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP pBR322 - MspI [5] Các gel chụp với máy ảnh Canon 50D theo phương pháp Chủng vi khuẩn Sử dụng chủng tế bào ER 3081 (F-λ- fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal attB::(pCD13lysY, lacIq) sulA11 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2 [dcm] R(zgb- 210::Tn10 –TetS) endA1 D Porch T Erpelding J.E [6] Tinh chế enzim cột HeparineSepharose 6B (Pharmacia) Nguyên sinh chất tinh chế qua 1ml cột Heparine-Sepharose 6B cân với (mcrC-mrr)114::IS10) Chủng biến nạp với pSAPV6 [6] tái tổ hợp chứa gen dung dịch đệm phá tế bào có thêm 0,05 M enzym hạn chế chủng Rothia dendocariosa ATCC 17931 đệm phá tế bào chứa 0,05 M NaCl trước NaCl Cột rửa lần với 1ml dung dịch tiến hành loại enzim 10 ml gradient NaCl Phá tế bào 0,1 - 0,9M đệm phá tế bào Thể tích 30 ml huyền dịch tế bào nuôi cấy môi phân đoạn thu 0,3 ml trường LB + Amp 37°C qua đêm ly tâm tuyp Falcon 5', với tốc độ 8000 rpm Cặn tế bào hòa tan 1,5ml dung dịch đệm phá tế bào (20 mM Tris, 1mM DTT, III KẾT QUẢ Quán sát phá vỡ E coli Hình cho thấy hỗn dịch tế bào 0,1 mM EDTA) Nhiều nồng độ tế bào hòa loãng từ 1/1, 1/2, 1/4 1/8 Thêm tuần Escherichia coli dần sau xử lý tự vào ống 20, 10, 2,5 µl dung dịch lysozim 10 mg/ml (Sigma) để có tỷ lệ tế bào bị phân hủy dẫn đến tế bào vi khuẩn tương đương tế bào/lysozim Ủ 4°C Ly tâm 5' 12.000v/p 4°C Phản ứng cắt ADN hạn chế Hoạt tính enzim hạn chế thử nhiều độ pha loãng nước bậc (9, 3, lysozim Điều chứng tỏ peptidoglycan bị phá vỡ, làm giảm độ đục hỗn dịch Cũng quan sát tế bào Escherichia coli bị phá vỡ lysozim sau ly tâm hình 1: Escherichia coli chứng cho thấy vi khuẩn 1, 1/3 µl) đệm phản ứng (NEBuffer 4: 20 mM Tris-acetate, pH 7.9, 10 mM magnesium không bị phá vỡ, cặn lắng đẹp; 2: vi khuẩn tươi (mới thu hoạch sau nuôi cấy); 3: vi acetate, 50 mM potassium acetate, mM khuẩn đông lạnh - 30°C, vi khuẩn biến nạp DTT, 100 µg/ml BSA 80 µM AdoMet) với với plasmid tái tổ hợp mang enzim hạn chế μg chất ADN (pAdeBsaBI) cho 50 μl bảo quản - 30°C, cho thấy hiệu phá vỡ thể tích phản ứng Ủ 20 phút 37°C Dừng tế bào khác tùy theo tình trạng tế bào phản ứng với đệm Gel Loading Dye, Blue Tế bào vỡ nhiều thể tích cặn tế bào lớn màu nước đậm New England Biolabs (2,5% Ficoll - 400, 11 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Sự phá vỡ E coli với lysozim 1: Hỗn dịch vi khuẩn chứng 2: Hỗn dịch vi khuẩn cho thêm lysozim Hình Sự phá vỡ E coli với lysozim sau ly tâm 1: E coli chứng 2: vi khuẩn tươi 3: vi khuẩn đông lạnh - 30°C 4: vi khuẩn biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang enzym hạn chế đông lạnh Ảnh hưởng nồng độ tế bào Hình 3: Phá vỡ Escherichia coli cách sử dụng tỷ lệ lysozim/số tế bào tương ứng, nồng độ 1/1, 1/2, 1/4 1/8 Bảng cho thấy, độ pha loãng tế bào 1/8, phá vỡ cao nhất, gần gấp lần tế bào khơng pha lỗng Theo kết hình 3, cho Hiệu phá vỡ phân tích đo nồng độ endonucleasa nguyên 3µl nguyên sinh chất nồng độ tế bào 1/1 thể tích chứa đựng 1U endonucleasa Trên sinh chất kỹ thuật bán định lượng Nếu cho 1U enzym đơn vị cho phép thủy sở đó, suy số đơn vị endonucleasa nguyên sinh chất tế bào vỡ nồng độ phân hồn tồn lượng ADN chuẩn dùng, ước lượng số đơn vị endonucleasa có nồng độ tế bào có hoạt động endonucleasa vi 10 Lưu ý: bên cạnh enzym hạn chế tái tổ hợp TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC khuẩn, hình vạch ADN hạn chế khơng thấy rõ Bảng Ước lượng endonucleasa nguyên sinh chất tế bào vỡ lysozim tùy theo nồng độ tế bào Nồng độ tế bào 1U U/ml 1/1 ml 333 1/2 ml 333 1/4 12 ml 666 1/8 ml 888 Hình Hoạt tính endonucleasa 9, 3, 1, 1/3 ml nguyên sinh chất - 4: nồng độ tế bào 1/1; - 9: nồng độ tế bào 1/2; 11 - 14: nồng độ tế bào 1/4; 16 - 19: nồng độ tế bào 1/8; 5, 10, 15 20: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III Quan sát enzym hạn chế tái tổ hợp Để xem hoạt động enzym hạn chế tái tổ hợp, nguyên sinh chất hỗn hợp vi khuẩn độ pha lỗng 1/1 đưa qua cột heparine - sepharose Hình 4: Enzym hạn chế tái tổ hợp nhiều phân đoạn 15 - 16 mức độ hoạt tính cho phép xác định tính đặc hiệu enzym TCNCYH 83 (3) - 2013 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Endonucleasa tái tổ hợp phân đoạn sau qua cột heparin - sepharose - 7: phân đoạn 3, 5, 7, 9, 10, 11; - 16: phân đoạn 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19; 18 - 24: phân đoạn 20, 21, 23, 25, 27, 29, 31; 1, 8, 17 25: ADN thang λ-Hind III + PhiX174-Hae III IV BÀN LUẬN Sự phá vỡ Escherichia coli với lysozim sau (ống nghiệm số 4) hiệu phá vỡ cao ly tâm quan sát rõ hình Ống nghiệm Thật ra, biểu enzym hạn chế tái tổ hợp gây tượng hủy hoại vật chủ số 1, vi khuẩn khơng bị phá vỡ, có cặn tủa gọn gàng đáy ống nghiệm với thể tích tế bào dễ vỡ Theo lý thuyết, Escherichia coli vi khuẩn Gram - có thành nhỏ Ống nghiệm số 2, vi khuẩn bị phá vỡ phồng lên không đủ độ nặng để lắng phần murein Gram + có thêm lớp màng tế bào bao quanh, suy nghĩ đáy ống nghiệm tốc độ ly tâm Thêm nữa, nước có thay đổi phá vỡ vi khuẩn không hiệu màu, nhiều tế bào vỡ màu đậm Khi hỗn dịch Escherichia coli bị đông lạnh -30°C (ống nghiệm số 3), tủa tế bào phồng lên so với vi khuẩn thu hoạch tươi chứng tỏ Tuy nhiên, kết cho thấy có phá vỡ tế bào điều kiện thí nghiệm thiết lập Khi kết hợp việc đông lạnh vi khuẩn trước xử lý lysozim, việc phá vỡ tế bào hiệu Ở độ pha loãng tế bào 1/8, hiệu phá vi khuẩn bị phá vỡ nhiều Điều giải thích sau: đông lạnh (cũng tác vỡ đạt cao nhất, gần gấp lần tế bào không động vật lý) gây phá hủy màng tế bào cách tách rời phân tử cấu trúc pha loãng (bảng 1) Điều cần lưu ý muốn thu lại nhiều sản phẩm Nhưng cần phải khỏi Trong dùng Escherichia coli biến nạp với plasmid tái tổ hợp mang gen enzym thao tác với thể tích hỗn hợp tối thiểu nhiều lần so với thể tích ban đầu Tuy nhiên, hạn chế bị đông lạnh trước dùng lysozim việc phân tích tính chất enzym, số 12 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC lượng enzym đủ dùng hỗn dịch tế bào tế bào, phương pháp nhẹ nhàng để vỡ khơng pha lỗng 1/1 Việc phá vỡ Escherichia coli lysozim phá vỡ tế bào Escherichia coli cho phép giữ hoạt tính protein tái tổ hợp nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với việc phân tích protein tái tổ hợp Hình TÀI LIỆU THAM KHẢO cho thấy enzym hạn chế tái tổ hợp (chủng tế bào ER 3081 biến nạp với pSAPV6 Benov L., Al-Ibraheem J (2002) Disrupting Escherischia coli: A comparison tái tổ hợp chứa gen enzym hạn chế chủng of methods J Biochem Mol Biol, 35 (4), 428 - 431 Rothia dendocariosa ATCC 17931) bảo tồn nguyên vẹn hoạt tính Kết nghiên cứu cho thấy, phương pháp dùng lysozim cho việc clon gen phân tích protein biểu thuận lợi áp dụng điều kiện phòng thí nghiệm so với phương pháp phá vỡ tế bào vi khuẩn thường dùng máy siêu âm, máy áp lực cao, loại máy nghiền… Nó khơng đòi hỏi máy móc khơng tạo tăng lên nhiệt độ hỗn dịch tế bào lực cọ sát mạnh mà máy móc gây Như vậy, lysozim có chức đặc hiệu phá hủy chất murein màng tế bào có hiệu lực việc phá vỡ Escherischia coli để lại nguyên vẹn protein tái tổ hợp Brown T (2010) Gene cloning and DNA analysis An introduction Ed Wiley - VCH http://texbookofbacteriology.netstructure_5.html Sambrook J., Fritsch Escherichia F., Maniatis T (1989) Gel electrophoresis of DNA In Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press Sambrook J., Fritsch Escherichia F., Maniatis T (1989) Plasmid vectors In Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press Porch T.G., Erpelding J.E (2006) Lowcost conversion of the Polaroid MD - land camera to a digital gel documentation system J Biochem Biophys Methods, 67, - V KẾT LUẬN 30 ml môi trường lỏng 37°C qua đêm Samuelson J.C., Zhenyu Zhu, and Shuang - yong Xu (2004) The isolation of strand-specific nicking endonucleases from a randomized SapI expression library Nucleic thu hoạch lấy lại 1,5 ml dung dịch phá Acids Res., 32(12), 3661 - 3671 Phương pháp dùng 20 ml lysozim nồng độ 10 mg/ml với khối lượng tế bào mọc Summary LYSIS OF RECOMBINANT ESCHERISCHIA COLI WITH LYSOZYME FOR THE ANALYSIS OF EXPRESSED PROTEIN This study aimed to contribute a simple laboratory technique for the analysis of recombinant protein products from the recombinant Escherichia coli In order to achieved the intact recombinant protein, lysozyme was used to lyse Escherichia coli Lysozyme has been tested in different conditions to lyse recombinant Escherichia coli strain Our results showed that our protocol using lysozyme for the cell disruption of recombinant Escherichia coli is successful and give high recovery of recombinant protein in the cell supernatant Keywords: cell lysis - Escherischia coli - recombinant protein - lysozyme TCNCYH 83 (3) - 2013 13 ... Quan sát enzym hạn chế tái tổ hợp Để xem hoạt động enzym hạn chế tái tổ hợp, nguyên sinh chất hỗn hợp vi khuẩn độ pha loãng 1/1 đưa qua cột heparine - sepharose Hình 4: Enzym hạn chế tái tổ hợp nhiều... lượng enzym đủ dùng hỗn dịch tế bào tế bào, phương pháp nhẹ nhàng để vỡ không pha loãng 1/1 Việc phá vỡ Escherichia coli lysozim phá vỡ tế bào Escherichia coli cho phép giữ hoạt tính protein tái tổ. .. phép giữ hoạt tính protein tái tổ hợp nghiên cứu hồn tồn phù hợp với việc phân tích protein tái tổ hợp Hình TÀI LIỆU THAM KHẢO cho thấy enzym hạn chế tái tổ hợp (chủng tế bào ER 3081 biến nạp