Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne cho các thai phụ được xác định là người mang gen bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE Đinh Thuý Linh, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh Trường Đại học Y Hà Nội Loạn dưỡng Duchenne bệnh lý di truyền thần kinh hay gặp nhóm bệnh lý loạn dưỡng đột biến gen dystrophin nhiễm sắc thể X Chẩn đoán trước sinh bà mẹ mang thai có nguy sinh bị bệnh giúp phát trường hợp thai mắc loạn dưỡng Duchenne Ứng dung kỹ thuật Microsatellite DNA chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne 05 thai phụ mang thai từ 17 - 22 tuần xác định người mang gen Tách chiết DNA từ tế bào ối, máu ngoại vi bệnh nhân thai phụ, hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật Microsatellite - DNA để chẩn đoán trước sinh so sánh kết với kỹ thuật phát đột biến gen trực tiếp Kỹ thuật xác định đột biến trực tiếp kỹ thuật Microsatellite - DNA có kết trùng khớp cho thấy hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite - DNA 1/5 thai nhi chẩn đoán mắc bệnh, thai phụ tư vấn đình thai nghén 4/5 thai nhi chẩn đốn bình thường, tiếp tục theo dõi thai Từ khoá: loạn dưỡng Duchenne, chẩn đoán trước sinh, Microsatellite DNA I ĐẶT VẤN ĐỀ cho sản phụ gia đình, giảm tỉ lệ sinh Bệnh loạn dưỡng Duchenne (DMD) mắc bệnh Trong kỹ thuật di truyền phân bệnh lý di truyền thần kinh hay gặp tử áp dụng để phát nhóm bệnh lý loạn dưỡng với tần đột biến gen dystrophin, kỹ thuật MLPA suất 1/3500 trẻ trai, nguyên nhân đột biến bộc lộ ưu điểm với khả khảo sát gen dystrophin nhiễm sắc thể giới tính X 79 exon gen dystrophin, phát Bệnh đặc trưng yếu tiến triển, phì đột biến xóa đoạn lặp đoạn, chiếm đại bắp chân, tăng sinh tổ chức khoảng 60 - 65%, thời gian - ngày chậm phát triển trí tuệ Bệnh nhân thường [4; 5] Tuy nhiên, khoảng 35 - 40% cần khả lứa tuổi 11 - 12 tử vong phải áp dụng kỹ thuật giải trình tự gen 79 lứa tuổi 20 biến chứng bệnh exon để phát đột biến điểm, kỹ thuật giải [1 - 3] trình tự gen thường cần nhiều thời gian giá Hiện chưa có phương pháp điều thành cao Việc chẩn đoán trước sinh thường trị đặc hiệu, sàng lọc người mang gen thực kỹ thuật phát đột bệnh chẩn đoán trước sinh bệnh loạn biến trực tiếp gen dystrophin dựa vào đột dưỡng Duchenne đóng vai trò biến điểm bệnh nhân [6] Tuy nhiên, quan trọng nhằm đưa lời khuyên di truyền số trường hợp không phát thấy đột biến việc phát đột biến gặp khó Địa liên hệ: Đinh Thúy Linh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: drdinhlinhobgyn@gmail.com khăn cấu trúc gen lớn số gia đình bệnh nhân khơng có điều kiện kinh tế, kỹ thuật Ngày nhận: 25/12/2017 phân tích gián tiếp áp dụng dựa Ngày chấp thuận: 18/3/2018 vào xác định allele đột biến (Linkage analysis) TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC với giá thành rẻ thời gian nhanh chóng hai chuỗi oligonucleotid lai đặc hiệu với 79 [7] gTrong nghiên cứu này, tiến hành exon Kết điện di cho 79 đỉnh có kích hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite - DNA áp thước tương ứng 79 probe đặc hiệu với 79 dụng kỹ thuật để chẩn đốn trước sinh exon: thơng qua việc khuếch đại vùng trình tự lặp lại STR (short tandem repeat) so sánh với kết phát đột biến kỹ thuật MLPA giải trình tự gen [8 - 10] Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật Microsatellite DNA chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne cho thai phụ xác định người mang gen bệnh loạn dưỡng Duchenne II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng - Với đột biến xoá đoạn, exon bị xố đoạn đỉnh exon khơng phát - Với đột biến lặp đoạn, kết tính tốn dựa vào tỉ lệ RPA (Relative Peak Area) tương ứng với exon so với mẫu chứng người bình thường, exon lặp đoạn mà tỉ lệ RPA lớn 1,5 Quy trình kỹ thuật: cho µl DNA cần phân tích vào ống PCR, biến tính 98oC/5 phút Nhiệt độ chuyển 2oC trước cho µl hỗn hợp chứa đoạn oligonucleotid probe Hỗn hợp ủ 60oC/16 giờ, - Nhóm chứng: gồm người nam đoạn lai phân tử oligonucleotid gắn người nữ bình thường, khơng có tiền sử gia với exon đích đặc hiệu vị trí sát Thêm đình mắc bệnh di truyền 32 µl hỗn hợp ligase buffer, ủ 54oC/15 phút, - Nhóm nghiên cứu: gia đình thai enzym ligase nối đoạn oligonucleotid phụ mang thai từ 17 tuần – 22 tuần, có probe với Phản ứng nối chấm dứt trai anh, em trai mắc bệnh loạn dưỡng tăng nhiệt độ lên 98oC/5 phút, hỗn hợp Duchenne, thai phụ phân giữ 4oC Khuếch đại sản phẩm lai: Thêm 10 tích gen xác đinh người mang gen µl sản phẩm lai vào 30 µl hỗn hợp PCR buffer, dystrophin đột biến giống trai anh, giữ 60oC, thêm 10 µl hỗn hợp PCR master, em trai thực chu trình nhiệt: [95oC/30 giây, Phương pháp 60oC/30 giây, 72oC/1 phút] x 35 chu kỳ, 72oC/20 phút Sản phẩm khuếch đại probe 2.1 Chọc hút dịch ối điện di mao quản huỳnh quang máy Tiến hành vào tuần thứ 17 - 22 thai kỳ giải trình tự để phân tích kết hướng dẫn siêu âm, Bệnh viện Phụ sản Trung ương Bệnh viện Phụ sản Hà Nội 2.3 Kỹ thuật Microsatellite DNA Xác định marker dị hợp tử alen bệnh mà người mẹ truyền cho 2.2 Xác định đột biến gen gây bệnh kỹ thuật microsatellite DNA xác định, loạn dưỡng Duchenne kỹ thuật MLPA kiểu gen kiểu hình thai nhi kỹ Nguyên lý kỹ thuật sử dụng 79 đoạn DNA sử dụng cặp mồi có gắn huỳnh dò gen dystrophin Mỗi DNA lai (probe) gồm quang để khuếch đại các vùng trình tự lặp thuật microsatellite DNA Kỹ thuật microsatellite TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC lại phân tích kích thước chúng bí mật cá nhân q trình nghiên cứu thơng qua điện di mao quản máy giải trình kết nghiên cứu Các thông tin bệnh tự gen (automated DNA sequencer) Đối với nhân, người nhà bệnh nhân kết chẩn gia đình loạn dưỡng Duchenne cần khuếch đốn hồn tồn giữ bí mật, đặc biệt đối đại 20 vùng trình tự lặp lại đặc hiệu để xác với thơng tin giới tính thai nhi định - marker dị hợp tử mẫu mẹ (informatic marker) Sử dụng cặp mồi xác định marker dị hợp tử từ xác định kiểu gen kiểu hình thai nhi III KẾT QUẢ Kết xác định đột biến gen Thành phần phản ứng: 1X đệm PCR; dystrophin bệnh nhân loạn dưỡng Dunchenne 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xi ngược; Hình ảnh phân tích MLPA probe tương 0,5unit Taq polymerase; 20ng DNA H2O, ứng với exon 14 - 43 mẫu ối cho thấy tổng thể tích 20µl Chu kỳ nhiệt phản ứng cường độ tín hiệu đỉnh cao nhiều so với mẫu người bình thường Sau phân PCR: 94oC/5 phút; {94oC/30 giây, 59oC/60 giây, 72oC/45 giây} x 40 chu kỳ; 72oC/5 phút Sản phẩm khuếch đại PCR điện di hệ thống sequencing - Beckman coulter Kết phân tích phần mềm GeneMapper v3.2 software 2.4 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào ối Nuôi cấy theo phương pháp hở tủ ấm 37°C với 5% CO2 95% khơng khí nguồn tích dựa RPA ta có tỉ lệ RPA exon từ 14 đến 43 bệnh nhân so với chứng lớn 1,5 exon khác giao động xung quanh Như cho thấy bệnh nhân có đột biến lặp đoạn exon từ 14 đến 43 Kết xác định marker dị hợp tử, alen bệnh người mẹ truyền cho kết ẩm Thời gian trung bình ni cấy từ - 15 chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne cho thai nhi kỹ ngày thuật microsatellite DNA Các tế bào ối thai nhi thu với số lượng tương đối sau nuôi cấy tách DNA theo phương pháp phenol - chloroform phân tích gen Tế bào ối sử dụng để nhuộm băng G phân tích karyotype thai Đạo đức nghiên cứu Những gia đình có bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh loạn dưỡng Duchenne đưa vào nghiên cứu đồng ý tự nguyện tham gia Gia đình bệnh nhân tư vấn giải thích cụ thể ý nghĩa, mục đích, qui trình nghiên cứu, quyền tự rút khỏi nghiên cứu, quyền đảm bảo TCNCYH 112 (3) - 2018 Loạn dưỡng Duchenne bệnh lý di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X Nếu người mẹ người mang gen bệnh có khả truyền gen bệnh cho trai với tỷ lệ 50% Để xác định alen đột biến (allele bệnh -Xb), cần tiến hành kỹ thuật single PCR khuếch đại 20 vùng STR đặc hiệu mẫu máu thai phụ mẫu máu bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne (là em trai trai thai phụ), lựa chọn marker dị hợp tử: - Kết mẫu có đỉnh có kích thước tương đương thể alen đột biến (Xb) Kết mẫu có đỉnh khơng tương đương thể alen bình thường (XB) TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Hình ảnh MLPA (A) kết tính tốn (Relative Peak Area) phần mềm coffalyser (B) mẫu người bình thường mẫu ối thai bị bệnh Hình Kỹ thuật Microsatellite chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne Hình hình ảnh kết kỹ thuật Microsatellite gia đình bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne marker dị hợp tử tìm thấy DSTR 44 DSTR49 TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Với marker DSTR 44, thai phụ xuất Với marker DDTR49, đỉnh mang kích đỉnh có kích thước 181bp 185bp (hình B), thước 172bp đỉnh trùng khớp mẹ thai tương ứng với alen nằm nhiễm sắc phụ, thai phụ em trai thai phụ (bệnh nhân thể X (XBXb) Ở mẹ thai phụ xuất loạn dưỡng Duchenne), cho thấy đỉnh có kích thước 180bp cho thấy alen đỉnh alen bệnh đồng hợp tử Ở em trai thai phụ (là bệnh Phân tích kết mẫu ối thai nhi: nhân loạn dưỡng Duchenne) có Marker DSTR44 xuất đỉnh có kích đỉnh kích thước 180bp tương ứng với alen thước 180bp alen bệnh, marker DSTR49 nhiễm sắc thể X (XbY), trùng khớp với xuất đỉnh có kích thước 180bp kích thước đỉnh mẫu mẹ thai phụ thai alen bệnh Kết khẳng định phụ Từ kết hình ảnh mẹ thai phụ, trường hợp thai nam bị bệnh loạn dưỡng thai phụ em trai thai phụ cho thấy đỉnh kích Duchenne Kết nghiên cứu gia thước 180bp đỉnh alen bệnh đình loạn dưỡng Duchenne: Bảng Kết chẩn đoán trước sinh STT Mã số Dạng đột biến Kết chẩn đoán trước sinh DMD10 Xóa đoạn exon 46 - 50 Bình thường DMD11 Xóa đoạn exon 49 - 50 Bình thường DMD13 c.3022A > T (p.Cys1008Stop) DMD15 Xóa đoạn exon 35 - 43 Bình thường DMD 18 Lặp đoạn 19 - 43 Bệnh lý Bình thường Kết chẩn đoán trước sinh: 1/5 thai nhi chẩn đoán thai nhi bệnh lý, 4/5 thai nhi chẩn đốn bình thường Kết tương đồng với kết kỹ thuật phân tích xác định đột biến trực tiếp Trường hợp thai chẩn đoán mắc bệnh loạn dưỡng Duchenne sau tư vấn kết quả, bệnh nhân định đình thai nghén trường hợp thai bình thường tư vấn giữ thai IV BÀN LUẬN mang gen bệnh, kỹ thuật MLPA đời vào Loạn dưỡng Duchenne bệnh có năm 2002 bộc lộ ưu điểm vượt trội tỉ lệ mắc cao bệnh lý di truyền so với kỹ thuật di truyền khác với độ xác thần kinh với bệnh cảnh lâm sàng nặng nề cao cần dùng cặp primer Hiện có nhiều kỹ thuật sinh học phân (so với kỹ thuật Multiplex PCR đòi hỏi nhiều tử áp dụng để phát đột biến cặp primer, dễ thất bại điều kiện phản ứng gen dystrophin Trong phát người lành bị thay đổi dù nhỏ); khả khảo sát TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 79 exon so với kỹ thuật Multiplex PCR đình có đột biến gen gây bệnh loạn dưỡng khảo sát 25 exon nằm hai vùng Duchenne cần thiết, từ phát “hot spot” phát đột biến xóa cách xác thời gian nhanh đoạn nằm khả phát kỹ trường hợp thai nhi mắc bệnh để có thuật PCR tư vấn cụ thể cho gia đình thai phụ Tuy nhiên kỹ thuật Multiplex PCR Hiện bất thường di truyền, đặc biệt hay MLPA tập trung phát đột biến bất thường nhiễm sắc thể xóa đoạn, đột biến điểm chiếm tỉ lệ 25 - ngun nhân gây đa dị tật hình 30% lại nằm khả phát thái thai nhi Trong bất thường di kỹ thuật Chính vậy, chẩn truyền hội chứng Down (3 nhiễm đoán trước sinh, người mẹ mang đột biến sắc thể 21), hội chứng Edwards (3 nhiễm sắc điểm gen dystrophin khơng thể phát thể 18) hay hội chứng Patau (3 nhiễm sắc thể thai nhi có nhận gen bệnh từ mẹ 13) hội chứng hay gặp Vì vậy, hay không sử dụng kỹ thuật Với chọc hút nước ối, cần lấy nước ối để chẩn kỹ thuật Microsatellite DNA, khơng có đốn bất thường nhiễm sắc thể thai nhi khả phát trường hợp thai song song với việc chẩn đoán bệnh loạn nhi mang nhiễm sắc thể có chứa gen dystrop- dưỡng Duchenne thai nhi hin có đột biến điểm từ mẹ mà đáp ứng u cầu chẩn đốn trước V KẾT LUẬN sinh với thời gian trả lời kết nhanh Kỹ thuật Microsatellite - DNA ứng xác (chỉ sau 48 – 72h) so với kỹ thuật dụng thành cơng chẩn đốn trước sinh Southern blotting hay kỹ thuật giải trình tự gen bệnh DMD: 1/5 thai nhi chẩn đoán phải đến hàng tuần Các đoạn microsate- thai nhi bệnh lý, thai phụ tư vấn llite DNA có tính đa hình cao dễ dàng định đình thai nghén, 4/5 thai nhi khuếch đại (nồng độ DNA cần khoảng chẩn đốn bình thường 7pg) sử dụng sau để xác định alen Lời cám ơn bệnh di truyền cho Đồng thời chi phí cho xét nghiệm thấp giúp giảm gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân Nhóm nghiên cứu xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Gen-protein - Trường Trong kỹ thuật Microsatellite DNA, Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Phụ sản Trung bệnh nhân nên lựa chọn - ương, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội giúp đỡ marker dị hợp tử (informatic marker) nhóm trình nghiên cứu số trường hợp xảy tình trạng TÀI LIỆU THAM KHẢO khuếch đại thất bại Với trường hợp đó, việc phân tích kết marker dị hợp tử lại chẩn đốn xác định thai nhi có hay khơng mắc loạn dưỡng Duchenne Từ kết cho thấy việc xây dựng quy trình chẩn đốn trước sinh cho gia Bushby, K (2010) Diagnosis and management dystrophy, of part Duchenne 2: muscular implementation of multidisciplinary care Lancet Neurol, 9(2), 177 - 189 TCNCYH 112 (3) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kneppers, A L., Ginjaar, I B and ing of Duchenne Muscular Dystrophin JMD, Bakker, E (2004) Duchenne and Becker muscular dystrophy Methods Mol Med, 92, 311 - 341 (3), 317 - 325 Ta MH, Tran TH, Do NH et al (2013) Rapid method for targeted prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in Vietnam Mendell R.J., Griggs C.R (1991) “Muscular dystrophin”, Harrison’s principles of internal medicine, 12th edition, 2112 - 2118 Hwa H.L., Chang Y.Y., Chen C.H et al (2007) Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification identification of deletions and duplications of the Duchenne muscular dystrophy gene in Taiwanese subjects J Formos Med Assoc, 106, 339 - 346 Lai K.K., Lo I.F., Tong T.M et al (2006) Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligationdependent Probe Amplification (MLPA) Clin Taiwan J Obstet Gynecol, 52(4), 534 - 539 Matsuo M (2002) Duchenne and Becker muscular dystrophy: from molecular diagnosis to gene therapy IUBMB Life, 53, 147 - 152 Hussey N.D., Donggui H., Froiland D.A., Hussey D.J et al (1999) Analysis of five Duchenne muscular dystrophy exons and gender determination using conventional duplex polymerase chain reaction on single cells Mol Hum Reprod, 5(11), 1089 - 1094 10 NguyễnThị Băng Sương, Trần Vân Biochem, 39, 367 - 372 Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn Chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Prior TW, Bridgeman SJ (2005) Experience and Strategy for the Molecular Test- Duchenne Tạp chí Nghiên cứu Y học, 66(1), 29 - 35 Summary APPLICATION OF MICROSATTELITE DNA FOR PRENATAL DIAGNOSIS OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is caused by the mutation of the dystrophin gene on the X chromosome It is the most common genetical neuromuscular disease among muscular dystrophy diseases affecting 1/3500 of male children Prenatal diagnosis on pregnant women carrying the gene will provide a chance to diagnose DMD among fetus Applying Microsattelite DNA technique in DMD prenatal diagnosis 05 pregnant gene-carrier women at 17 - 22 weeks of gestation were tested DNA from the amniococco cells and peripheral blood of the patients and pregnant women were extracted and analyzed by Microsatellite-DNA technique and prenatal diagnosis technique through amplifying short tandem repeat sections; the results are then compared with those obtained from the direct mutation diagnosis technique Since the direct mutation diagnosis analysis technique and the Microsatellite-DNA technique provided the same results, we are confident that Microsatellite-DNA technique for DMD prenatal diagnosis had been perfected 1/5 fetus was diagnosed with the disease, and pregnancy was suspended 4/5 fetus were diagnosed to be normal and the pregnancy was continued Microsatellite DNA has proven to be a promising and effective technique in DMD prenatal screening in Vietnam Keywords: Duchenne muscular dystrophy, prenatal diagnosis, Microsattelite DNA TCNCYH 112 (3) - 2018 ... thường mẫu ối thai bị bệnh Hình Kỹ thuật Microsatellite chẩn đốn trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne Hình hình ảnh kết kỹ thuật Microsatellite gia đình bệnh nhân loạn dưỡng Duchenne marker dị hợp... nhanh Kỹ thuật Microsatellite - DNA ứng xác (chỉ sau 48 – 72h) so với kỹ thuật dụng thành cơng chẩn đốn trước sinh Southern blotting hay kỹ thuật giải trình tự gen bệnh DMD: 1/5 thai nhi chẩn đoán. .. với kết phát đột biến kỹ thuật MLPA giải trình tự gen [8 - 10] Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu ứng dụng kỹ thuật Microsatellite DNA chẩn đoán trước sinh bệnh loạn dưỡng Duchenne cho thai phụ