Thẩm định hiệu lực phương pháp LaL và ứng dụng để thử nghiệm nội độc tố vi khuẩn

Bài viết Thẩm định hiệu lực phương pháp LaL và ứng dụng để thử nghiệm nội độc tố vi khuẩn trình bày: LAL là phương pháp hiện đại để thử nghiệm nội độc tố, phương pháp này mang lại kết quả nhanh và chính xác. Bài báo này nghiên cứu tìm hiểu, tổng hợp một số phương pháp đánh giá hiệu lực của thử nghiệm LAL đã được công bố cũng như xác định các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm,... Mời các bạn cùng tham khảo.

THẨM ĐỊNH HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP LAL VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ THỬ NGHIỆM NỘI ĐỘC TỐ VI KHUẨN Trương Văn Đạt, Đỗ Quang Dương, Huỳnh Văn Hóa Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tóm tắt: Đặt vấn đề: Thuốc vô khuẩn phải đảm bảo không chứa chất gây sốt cần phải có thử nghiệm để đánh giá nội độc tố vi khuẩn Hiện nay, LAL phương pháp thử nghiệm nội độc tố, phương pháp mang lại kết nhanh xác Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Bài báo nghiên cứu tìm hiểu, tổng hợp số phương pháp đánh giá hiệu lực thử nghiệm LAL công bố xác định yếu tố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm Kết quả: Bài báo xác định phương pháp thử nghiệm LAL nhóm yếu tố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm Kết luận: Hiện có nhiều nguồn LAL khác nhiều nhà cung cấp khác nhau, hết phản ứng LAL – nội độc tố vi khuẩn bị ảnh hưởng nhiều yếu tố làm cho kết bị sai lệch Vì cần phải thẩm định hiệu lực thử nghiệm LAL để đảm bảo chất lượng sản phẩm Từ khóa: Nội độc tố vi khuẩn, thử nghiệm LAL, thuốc vô khuẩn Abstract: THE EFFICIENCY OF LAL METHOD VALIDATION AND APPLYING FOR ENDOTOXIN TESTING Truong Van Dat, Do Quang Duong, Huynh Van Hoa Faculty of Pharmacy, UMP HCMC Background: Sterile drug is required not contain pyrogen, so we must the method for endotoxin testing Nowadays, LAL is a modern method for endotoxin testing, this method carries quick and accurate result Materials and methods: This article has studied some methods to evaluate the efficiency of LAL testing as well as defined these factors that affect to the testing result Results: This article has identified methods of LAL testing and groups of factors that affect testing results Conclusion: There are many sources of LAL, many different providers and the reaction of LAL – endotoxin may be affected by other factors that yield misleading results So, we need to validate the efficiency of LAL testing to ensure drug quality Keywords: Endotoxin, LAL testing, sterile drug ĐẶT VẤN ĐỀ Chất gây sốt (pyrogen) thành phần vi khuẩn, nấm hay virus tạo chúng bị tiêu giải, làm cho mức quy định chế điều hòa thân nhiệt vùng đồi cao bình thường, lúc q trình sinh nhiệt thể tăng lên đồng thời với trình giữ nhiệt thể để 52 làm tăng thân nhiệt Khi thành phần lipopolysaccharid vi khuẩn gram âm gọi nội độc tố vi khuẩn (bacteria endotoxin) Nội độc tố vi khuẩn có nhiều ý nghĩa sản xuất thuốc [1] Theo khuyến cáo FDA tiêu chuẩn GMP-WHO, trước tiến hành sản xuất phải đánh giá nội độc tố nguyên vật liệu đầu Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 10 vào, chúng phải đáp ứng tiêu chuẩn cho phép đưa vào quy trình sản xuất (QTSX) Bảng nêu giới hạn nội độc tố cho nút cao su loại chai/lọ (vial) trước tiệt khuẩn [5] Bảng Giới hạn nội độc tố cho nguyên vật liệu Thử nghiệm Nút cao su Chai/lọ Nội độc tố ≤ 2.5 EUs/nút ≤ 10 EUs/ chai/lọ Việc đánh giá nội độc tố nguyên vật liệu phần quan trọng thẩm định QTSX Trước đây, người ta đánh giá dựa vào thay đổi nhiệt độ động vật thử nghiệm (thường thỏ) tiêm vào liều chế phẩm định thời gian xác Phương pháp có độ xác không cao phụ thuộc nhiều vào động vật thử nghiệm Hiện nay, phương pháp mang lại hiệu thử nghiệm dựa vào phản ứng nội độc tố LAL (Limulus Amebocyte Lysate) [1,3] ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu chế tác động LAL thử nghiệm nội độc tố sản phẩm vô khuẩn Nghiên cứu yếu tố cần thẩm định để chứng minh hiệu lực phương pháp LAL KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN LAL dịch phân giải tế bào dạng amip có máu loài sam biển Limulus polyphemus Tachypleus tridentatus, FDA chấp thuận sử dụng năm 1970 Máu lấy từ màng tim sam Các tế bào máu tách từ huyết cách sử dụng ly tâm để vào nước cất, chúng vỡ ra, giải phóng lysate sau tinh chế đông khô Khi tiến hành thử nghiệm nội độc tố pha trộn với lysate nước Thử nghiệm việc cho phép phát nhanh nội độc tố giúp định lượng nội độc tố có sản phẩm Hình mơ tả trình chiết xuất LAL từ sam biển [1, 6] Hình Sam biển trình chiết xuất LAL Theo USP32-NF27, chuyên luận “ Thử nghiệm nội độc tố vi khuẩn”, có phương pháp để thực thử nghiệm LAL: phương pháp tạo gel dựa tạo thành gel cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội độc tố; phương pháp đo độ đục (turbidimetric) dựa vào thay đổi độ đục thuốc thử LAL tạo gel; phương pháp đo màu (chromogenic) dựa thay đổi màu phức hợp màu – peptid (Hình 2) [6,7] Tùy theo điều kiện tính chất mẫu thử, áp dụng kỹ thuật thích hợp để thực thử nghiệm Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 10 53 Hình Các chế thử nghiệm LAL [3, 4] (1 – phản ứng tạo gel; – phản ứng đo màu; – phản ứng đo độ đục) Tuy nhiên thị trường có nhiều nhà cung cấp thuốc thử LAL với nhiều tiêu chuẩn khác nhau, thách thức đặt cho nhà sản xuất phải chọn lựa nguồn LAL thích hợp đảm bảo độ tin cậy cao Để thực điều phải tiến hành thẩm định hiệu lực thử nghiệm phương pháp LAL đánh giá nội độc tố Ngoài việc thẩm định yêu cầu phải tìm thử nghiệm tính ức chế tăng cường phản ứng sản phẩm (chứa nội độc tố) LAL tin tưởng tuyệt đối vào nhà cung cấp thuốc thử LAL Theo “mức độ ức chế tăng cường phản ứng LAL sản 54 phẩm nên xác định cho công thức thuốc trước thử nghiệm để đánh giá lượng nội độc tố Tất thử nghiệm thẩm định phải thực sản phẩm thuốc pha loãng Dung dịch pha lỗng khơng nên vượt q độ pha lỗng tối đa (MVD) Ít ba lơ sản phẩm phải thử nghiệm tính ức chế tăng cường” Hình trình bày yếu tố ảnh hưởng đến thử nghiệm LAL, yếu tố gây tính ức chế tăng cường phản ứng nên cần phải xác định [1] Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 10 Hình Các yếu tố ảnh hưởng đến thử nghiệm LAL [1, 2] 3.1 Các phương pháp thực thử nghiệm LAL 3.1.1 Kỹ thuật đơng vón gel Phương pháp tạo gel cho phép phát xác định lượng nội độc tố thuốc dựa tạo gel thuốc thử LAL với nội độc tố Nồng độ nội độc tố yêu cầu để tạo gel với thuốc thử LAL điều kiện chuẩn nồng độ tương ứng với độ nhạy ghi nhãn thuốc thử Để đảm bảo độ xác giá trị phép thử, phải tiến hành phép thử kiểm tra để khẳng định độ nhạy ghi nhãn thuốc thử LAL Độ nhạy LAL ghi nhãn nồng độ nội độc tố chuẩn (CSE) thấp cần thiết để tạo gel với LAL điều kiện xác định Phép thử kiểm tra độ nhạy thực có lơ thuốc thử LAL có thay đổi điều kiện thí nghiệm ảnh hưởng tới kết phép thử [5,6] 3.1.2 Kỹ thuật đo độ đục Phương pháp đo độ đục xác định lượng nội độc tố có dung dịch CSE thử dựa đo mức độ thay đổi độ đục trình tạo gel thuốc thử LAL Hiện có kỹ thuật áp dụng: đo độ đục điểm dừng đo độ đục động học [5,6] Đo độ đục điểm dừng dựa tương quan nồng độ nội độc tố độ đục hỗn hợp phản ứng thời điểm xác định vào cuối giai đoạn ủ Đo độ đục động học dựa tương quan nồng độ nội độc tố thời gian cần thiết để đạt tới độ đục định trước hỗn hợp phản ứng tốc độ tăng độ đục hỗn hợp Phép thử thường thực 37±1 0C, độ đục biểu thị độ hấp thụ hay độ truyền qua 3.1.3 Kỹ thuật đo màu Phương pháp đo màu xác định nồng độ nội độc tố dung dịch CSE dựa đo chất màu giải phóng từ chất mang màu phản ứng nội độc tố với thuốc thử LAL Có kỹ thuật đo: đo màu điểm dừng đo màu động học [5,6] Đo màu điểm dừng dựa tương quan nồng độ nội độc tố đậm độ chất màu tạo thành hỗn hợp phản ứng điểm cuối giai đoạn ủ Đo màu động học dựa mối tương quan định lượng nồng độ nội độc tố thời gian cần thiết để hỗn hợp phản ứng đạt tới độ hấp thu (hoặc độ truyền qua) định trước tốc độ tăng màu hỗn hợp Phép thử thường thực 37±1 0C 3.2 Các yếu tố cản trở phản ứng LAL nội độc tố 3.2.1 pH pH tối ưu cho thử nghiệm từ 6,0-8,0 Nếu pH vượt qua khoảng khắc phục biện pháp pha lỗng, thêm vào dung dịch đệm dùng HCl, NaOH [2,3,4] 3.2.2 Ion hóa trị Ion hóa trị mức giới hạn tối ưu giúp cho phản ứng xảy ra, nhiên nồng độ cao trung hòa điện tích âm nội độc tố từ làm giảm hiệu lực phản Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 10 55 ứng Pha loãng biện pháp khắc phục tượng [2,3,4] 3.2.3 Yếu tố tạo phức chelat EDTA hay heparin tạo phức chelat với ion hóa trị 2, làm giảm liên kết với nội độc tố từ làm tăng cường phản ứng Tuy nhiên, lập hết ion hóa trị làm hạn chế phản ứng ức chế hoạt động enzym Khắc phục tượng sử dụng gel tinh khiết pha loãng mẫu thử [2,3,4] 3.2.4 Máu, huyết thanh, huyết tương protein Protein sản phẩm máu kết hợp với nội độc tố Ngoài ra, số protease góp phần phân hủy protein làm ảnh hưởng đến phản ứng Khắc phục tượng làm biến tính protein nhiệt với điều kiện nội độc tố chịu nhiệt độ làm biến tính protein [2,3,4] 3.2.5 Tác nhân làm biến tính protein Alcol phenol tác nhân làm biến tính protein, khắc phục cách pha loãng mẫu thử [2, 3, 4] KẾT LUẬN Phương pháp LAL phương pháp thử nghiệm nội độc tố sản phẩm vơ khuẩn cho kết nhanh xác Tuy nhiên, có nhiều nguồn LAL nhiều nhà cung cấp khác phản ứng LAL nội độc tố bị ảnh hưởng nhiều yếu tố khác làm cho kết bị sai lệch Bài báo tổng hợp số phương pháp đánh giá kết thử nghiệm LAL xác định yếu tố ảnh hưởng đến kết thử TÀI LIỆU THAM KHẢO Center for Drug Evaluation and Research S Zijlstra, P Gerken, C Rechin, R Wortmann, (1987), Guideline on validation of the limulus G Notohamiprodjo (1997), “Validation of the amebocyte lysate test as an end-product limulus amebocyte lysate (LAL) test for routine endotoxin test for human and animal parenteral PET radiopharmaceuticals”, Appl Radiat Isot, drugs, biological products and medical devices, 48(1), 51-54 FDA, USA, pp 1-54 Syed Imtiaz Haider (2006), Validation Standard Michael E Dawson (2005), “Interference with Operating Procedures: A Step by Step Guide for the LAL Test and How to Address It”, LAL Achieving Compliance in the Pharmaceutical, update, 23(3), 1-6 Medical Device, and Biotech Industries, Taylor Rosimar L Silveira et al (2004), “Comparative & Francis Group, USA, pp 957-977 evaluation of pyrogens tests in pharmaceutical USP32-NF27 (2009), Bacterial products”, Brazilian Journal of Microbiology, Endotoxins Test 35, 48-53 USP32-NF27 (2009), Pyrogen test 56 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 10 ... phản ứng nội độc tố LAL (Limulus Amebocyte Lysate) [1,3] ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu chế tác động LAL thử nghiệm nội độc tố sản phẩm vô khuẩn Nghiên cứu yếu tố cần thẩm định để. .. lựa nguồn LAL thích hợp đảm bảo độ tin cậy cao Để thực điều phải tiến hành thẩm định hiệu lực thử nghiệm phương pháp LAL đánh giá nội độc tố Ngoài vi c thẩm định yêu cầu phải tìm thử nghiệm tính... nghiệm LAL [1, 2] 3.1 Các phương pháp thực thử nghiệm LAL 3.1.1 Kỹ thuật đơng vón gel Phương pháp tạo gel cho phép phát xác định lượng nội độc tố thuốc dựa tạo gel thuốc thử LAL với nội độc tố