Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh hương trong công nghệ sản xuất nước mắm

Nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá, là sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam. Nước mắm đã gắn liền với đời sống hằng ngày và là một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam. Luận văn sau đây nhằm phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh hương trong công nghệ sản xuất nước mắm.

M  Đ UỞ Ầ

Nước m m là m t lo i nắ ộ ạ ước ch m quen thu c đấ ộ ượ ưc  a chu ng nh t ộ ấ ở 

nước ta và không th  thi u trong m i b a ăn hàng ngày. Nể ế ỗ ữ ước m m có giá trắ ị dinh dưỡng cao, h p d n ngấ ẫ ười ăn b i hở ương v  đ m đà, đ c tr ng mà khôngị ậ ặ ư  

lo i s n ph m nào có th  thay th  đạ ả ẩ ể ế ược

Nước m m là m t m t hàng chính c a ngành th y s n. Nó tiêu thắ ộ ặ ủ ủ ả ụ kho ng 40­60% t ng s  cá đánh b t và đả ổ ố ắ ược ch  bi n kh p n i trên toànế ế ắ ơ  

qu c. Nố ước m m đắ ượ ảc s n xu t t  cá và mu i không ch  đấ ừ ố ỉ ượ ử ục s  d ng r ngộ  rãi   Vi t Nam  mà hi n nay còn đở ệ ệ ượ ưc  a chu ng   nhi u nộ ở ề ước trên th  gi i.ế ớ  

Tương t  nh  nự ư ước m m các nắ ước trên th  gi i cũng có m t s  lo i nế ớ ộ ố ạ ướ  c

ch m   khác   nh :   Shottusuru     Nh t,   nampla     Thái   Lan,   …   Nh ng   v iấ ư ở ậ ở ư ớ  

phương pháp khác nhau thì s n ph m có mùi v  không gi ng nhauả ẩ ị ố

Nước m m s n xu t theo phắ ả ấ ương pháp c  truy n   Vi t Nam có mùi vổ ề ở ệ ị 

th m ngon đ c tr ng. Tuy nhiên nó có nhơ ặ ư ược đi m là hàm lể ượng nit  khôngơ  cao, chu kì s n xu t quá dài (t  6 tháng đ n 1 năm ho c có th  lâu h n), giáả ấ ừ ế ặ ể ơ  thành s n ph m cao vì v y không kinh t  Vài ch c năm g n đây có nhi uả ẩ ậ ế ụ ầ ề  nghiên c u trong và ngoài nứ ước nh m rút ng n th i gian ch  bi n và nâng caoằ ắ ờ ế ế  

ch t lấ ượng, đáp  ng yêu c u ngày càng cao c a th  trứ ầ ủ ị ường trong và ngoài 

nước. Nh ng s n ph m ch  bi n t  các phư ả ẩ ế ế ừ ương pháp c i ti n này đã g p trả ế ặ ở 

ng i v  hạ ề ương v  vì s  t o thành hị ự ạ ương v  c a nị ủ ước m m ch  y u là do viắ ủ ế  sinh v t trong quá trình phân h y c  ch t t o thành, mà đ  t o hậ ủ ơ ấ ạ ể ạ ương thì c nầ  

th i gian dài.ờ

Xu t phát t  yêu c u đó chúng tôi đã ti n hành đ  tài : “ Phân l p, tuy nấ ừ ầ ế ề ậ ể  

ch n vi sinh v t sinh họ ậ ương trong công ngh  s n xu t nệ ả ấ ước m m”ắ

Chương 1­ T NG QUANỔ

1.1 Gi i thi u chung v  nớ ệ ề ước m m.ắ

Nước m m là s n ph m đắ ả ẩ ược lên men t  các lo i cá, là s n ph mừ ạ ả ẩ  truy n th ng c a dân t c Vi t Nam. Nề ố ủ ộ ệ ước m m đã g n li n v i đ i s ngắ ắ ề ớ ờ ố  

h ng ngày và là m t b n s c r t riêng c a dân t c Vi t Nam.ằ ộ ả ắ ấ ủ ộ ệ

Đây là s n ph m c a nhi u quá trình ph c t p g m quá trình đ m hóa,ả ẩ ủ ề ứ ạ ồ ạ  quá trình phân gi i đả ường trong cá thành acid, quá trình phân h y m t ph nủ ộ ầ  amino acid dưới tác d ng c a vi khu n có h i, ti p t c b  phân h y thànhụ ủ ẩ ạ ế ụ ị ủ  

nh ng h p ch t đ n gi n  nh  amin, amoniac, cacbonic hydrosunfua…ữ ợ ấ ơ ả ư

Nước m m đắ ượ ảc s n xu t t  cá và mu i không ch  đấ ừ ố ỉ ượ ử ục s  d ng r ngộ  rãi   Vi t Nam mà còn đở ệ ượ ưc  a chu ng t i nhi u nộ ạ ề ước trên th  gi i.ế ớ Đ cặ  

bi t, nệ ước m m đắ ược s n xu t   h u h t các nả ấ ở ầ ế ước Châu Á. M i nỗ ước có 

đi u ki n s n xu t khác nhau t o ra s n ph m có giá tr nh dinh dề ệ ả ấ ạ ả ẩ ị ưỡng và giá 

tr  c m quan khác nhauị ả [4]

1.1.1. Giá tr  dinh d ị ưỡ ng c a n ủ ướ c m m  ắ

Hàm lượng nit : Chi m ch  y u và quy t đ nh giá tr  dinh dơ ế ủ ế ế ị ị ưỡng c aủ  

nước m m ắ

­ Hàm lượng nit  toàn ph n: là t ng lơ ầ ổ ượng nit  có trong nơ ước m m (g/l),ắ  quy t đ nh phân h ng c a nế ị ạ ủ ước m m.ắ

­ Hàm lượng nit  amin: là t ng lơ ổ ượng đ m n m dạ ằ ướ ại d ng acid amin (g/l), quy t đ nh giá tr  dinh dế ị ị ưỡng c a nủ ước m mắ

­ Hàm lượng nit  amon: Lơ ượng đ m amon càng nhi u nạ ề ước m m càng kémắ  

ch t lấ ượng

Ngoài ra trong nước m m còn ch a đ y đ  các acid amin, đ c bi t làắ ứ ầ ủ ặ ệ  các acid amin không thay th : valin, leucin, methionin, isoleucin, phenylalanin,ế  alanin.v.v   Các thành ph n khác có kích thầ ước  l n nh  tripeptid, peptol,ớ ư  dipeptid. Chính nh ng thành ph n trung gian này làm cho nữ ầ ước m m d  b  hắ ễ ị ư 

Thành ph n hóa h c c a cá g m: nầ ọ ủ ồ ước, protide, lipid, glucid, mu i vôố  

c , vitamine, trong đó nơ ước chi m t  l  r t l n, protide và lipid chi m m tế ỉ ệ ấ ớ ế ộ  

ph n đáng k , glucid trong cá thầ ể ường r t ít và t n t i dấ ồ ạ ướ ại d ng glycogen. Các thành ph n này khác nhau và thay đ i ph  thu c vào gi ng, loài, gi i tính,ầ ổ ụ ộ ố ớ  

đi u ki n sinh s ng. Ngoài ra, các y u t  nh  thành ph n th c ăn, môi trề ệ ố ế ố ư ầ ứ ườ  ng

s ng, kích c  cá và các đ c tính di truy n cũng  nh hố ỡ ặ ề ả ưởng đ n thành ph n hóaế ầ  

h c, đ c bi t   cá nuôi. Thành ph n hóa h c c a cá   t ng c  quan, b  ph nọ ặ ệ ở ầ ọ ủ ở ừ ơ ộ ậ  

S  khác nhau v  thành ph n hóa h c c a cá và s  bi n đ i c a chúngự ề ầ ọ ủ ự ế ổ ủ  

có  nh hả ưởng đ n mùi v  và giá tr  dinh dế ị ị ưỡng c a s n ph m, vi c b o qu nủ ả ẩ ệ ả ả  

tươi nguyên li u và qui trình ch  bi n. ệ ế ế

Nước: [2] Đóng vai trò và ch c năng quan tr ng trong đ i s ng, ch tứ ọ ờ ố ấ  

lượng c a cá. Nủ ước tham gia vào ph n  ng sinh hoá, vào các quá trình khu chả ứ ế  tán trong cá, t o đi u ki n cho vi sinh v t phát tri n.ạ ề ệ ậ ể

Lipid: [2] Cá s  d ng ch t béo nh  là ngu n năng lử ụ ấ ư ồ ượng d  tr  đ  duyự ữ ể  trì s  s ng trong nh ng tháng mùa đông, khi ngu n th c ăn khan hi m. Hàmự ố ữ ồ ứ ế  

lượng lipid trong cá dao đ ng nhi u (0,1­30%). ộ ề

Lipid   trong   các   loài   cá   xương   được   chia   thành   2   nhóm   chính: phospholipid và triglycerit. Phospholipid t o nên c u trúc c a màng t  bào, vìạ ấ ủ ế  

v y chúng đậ ược g i là lipid c u trúc. Triglycerit là lipid d  tr  năng lọ ấ ự ữ ượng có trong các n i d  tr  ch t béo, thu ng   trong các t  bào m  đ c bi t đơ ự ữ ấ ờ ở ế ỡ ặ ệ ược bao quanh b ng m t màng phospholipid và m ng lằ ộ ạ ưới collagen m ng h n. ỏ ơ

Lipid c a cá khác v i lipid c a đ ng v t có vú, ch  y u do lipid c a cáủ ớ ủ ộ ậ ủ ế ủ  

có t i 40% acid béo m ch dài (14 ­ 22 nguyên t  cacbon) và m c đ  không noớ ạ ử ứ ộ  cao. Trong lipid c a đ ng v t có vú, ít khi có acid béo v i 2 n i kép tr  lênủ ộ ậ ớ ố ở  trong khi lipid c a cá có nhi u acid béo v i 5 ho c 6 n i kép. [2] ủ ề ớ ặ ố

­ Protein: [2] Có th  chia protein c a mô c  cá ra thành 3 nhóm sau: ể ủ ơ

*   Protein   c u   trúc:   G m   các   s i   myosin,   actin,   actomyosin   vàấ ồ ợ  tropomyosin, chi m kho ng 70 ­ 80% t ng lế ả ổ ượng protein (so v i 40% trongớ  các loài đ ng v t có vú). Các protein này hòa tan trong dung d ch mu i trungộ ậ ị ố  

tính có n ng đ  ion khá cao (> 0,5 M). Các protein c u trúc có ch c năng co rútồ ộ ấ ứ  

đ m nh n các ho t đ ng c a c  ả ậ ạ ộ ủ ơ

* Protein tương c : G m myoalbumin, globulin và các enzyme, chi mơ ồ ế  kho ng 25­30% t ng lu ng protein. Các   protein   này   hòa   tan   trong   nu c,ả ổ ợ ớ  trong   dung   d ch   mu i   trung   tính   có n ng   d    ion   th p (<15M). Đa sị ố ồ ộ ấ ố protein tương c  là các enzyme tham gia vào s  trao đ i ch t c a t  bào, nhơ ự ổ ấ ủ ế ư 

s  chuy n hoá năng lự ể ượng trong đi u ki n y m khí t  glycogen thành ATP. ề ệ ế ừ

* Protein mô liên k t: Bao g m các s i collagen. Chi m kho ng 3%ế ồ ợ ế ả  

t ng lổ ượng protein trong cá xương và kho ng 10% trong cá s n. Có trongả ụ  

m ng lu i ngo i bào, không tan trong nu c, dung d ch ki m ho c dung d chạ ớ ạ ớ ị ề ặ ị  

8.11.62.65.3

9.31.13.84.5

6.81.92.25.4

8.25.24.22.95.0

8.47.15.53.38.1

­ H  vi sinh v t cá: [10] ệ ậ Th t cá là môi trị ường thu n l i cho s  phát tri nậ ợ ự ể  

c a h u h t các vi sinh v t, trong đó có c  các loài sinh bào t  cũng nh  gâyủ ầ ế ậ ả ử ư  

b nh. H  vi sinh v t c a cá r t đa d ng. Trên b  m t cá thệ ệ ậ ủ ấ ạ ề ặ ường có m t l pộ ớ  

nh y ch a m t lầ ư ộ ượng l n ch t protein. L p nh y này là môi trớ ấ ớ ầ ường dinh 

dưỡng t t đ i v i vi sinh v t. Nh ng vi sinh v t này thố ố ớ ậ ữ ậ ường là tr c khu nự ẩ  sinh bào t  ho c không sinh bào t , c u khu n nh , ử ặ ử ầ ẩ ỏ Sarcina và m t s  n mộ ố ấ  men,   n m   m c   có     trong   nấ ố ở ước   Các   vi   khu n   thẩ ường   th y     đây   làấ ở  

Pseudomonas fluorescens liquefaciens, Proteus vulgaris, Micrococcus roseus và  E.coli.

 mang cá đ c bi t nhi u vi khu n hi u khí. Sau khi cá ch t các vi sinh

Clostridium botulinum  S  lố ượng vi khu n thẩ ường dao đ ng r t l n r  vàiộ ấ ớ ừ  nghìn t i vài ch c tri u t  bào trên 1g ch t ch a trong ru t.ớ ụ ệ ế ấ ứ ộ

Nhi u k t qu  nghiên c u đã xác đ nh thành ph n h  vi sinh v t c a cáề ế ả ứ ị ầ ệ ậ ủ  không khác bi t v i h  vi sinh v t c a môi trệ ớ ệ ậ ủ ường nước chung quanh cá s ng.ố  Trong các mô và c  quan c a cá tơ ủ ươi thường g p ặ Sarcina lutea, Sarcina flava,  Sarcina   alba,   Micrococcus   flavus,   Micrococcus   cereus,   proteus   vulgaris,   Chromobacterium   prodigiosum,   Pseudomonas   fluorescens   liquefacien,   Bacterium   pudium,   Bacillus   megatherium,   B   mycoides,   B   subtilis,   B   mesentericus, Clostridium putrificus, Aspergiluss niger, Mucor. 

Trong này có th  t i kho ng 20 loài có ho t tính proteaza. Chúng có thể ớ ả ạ ể phân h y protein và là ngu n gây th i r a sau khi cá ch t. Trong cá tủ ồ ố ữ ế ươ ố  i s ng

r t ít vi khu n t p nhi m. Thành ph n h  vi sinh v t t  nhiên c a cá khôngấ ẩ ạ ễ ầ ệ ậ ự ủ  thay đ i, n u nh  lo i tr  đổ ế ư ạ ừ ược nh ng ngu n t p nhi m t  môi trữ ồ ạ ễ ừ ường chung quanh. 

b Mu i  ố

Mu i là nguyên li u không th  thi u đố ệ ể ế ược trong quá trình s n xu t nả ấ ướ  c

ch m. Trong t  nhiên mu i hi n di n trong các ngu n nấ ự ố ệ ệ ồ ước bi n. Nh  khể ờ ả năng hút nước nên mu i đố ược dùng t n tr  th c ph m,  c ch  đồ ữ ự ẩ ứ ế ược vi sinh 

v t phát tri n trong th c ph m tr  các lo i vi sinh v t ch u m nậ ể ự ẩ ừ ạ ậ ị ặ

Thành ph n chính c a mu i là NaCl, Hầ ủ ố 2O, các ho t ch t hòa tan vàạ ấ  không tan. Mu i đố ược d  tr   trên 5 tháng. ự ữ

Các ch t hoà tan g m có: calciphosphat (CaSO4), Magiesunfat (MgSO4),ấ ồ  Magieclorua (MgCl), Calcioxit (CaO), Manganoxit (MnO)…. Các lo i này có vạ ị 

đ ng và chát, các t p ch t này làm gi m đ  th m th u c a mu i vào cá. ắ ạ ấ ả ộ ẩ ấ ủ ố Các 

t p ch t không tan g m có: bùn, đá, s i, cát…[4]ạ ấ ồ ỏ

1.2. Quy trình s n xu t nả ấ ước m m truy n th ngắ ề ố

1.2.1. Quá trình thu  phân, lên men nỷ ước m m.ắ

a, C  ch  quá trình  hình thành n ơ ế ướ c m m ắ

B n ch t c a quá trình s n xu t nả ấ ủ ả ấ ước m mắ

S  tham gia c a enzyme trong quá trình th y phân thự ủ ủ ường tr i qua baả  giai đo nạ

Trong đó E là enzyme, S là c  ch t (Substrate), ES là h p ch t trung gianơ ấ ợ ấ  

gi a enzyme và c  ch t, P  là s n ph m.ữ ơ ấ ả ẩ

Giai đo n th  nh t: Enzyme k t h p v i protein t o thành ph c ch tạ ứ ấ ế ợ ớ ạ ứ ấ  enzyme protein, bước này x y ra khá nhanh, liên k t không b n.ả ế ề

Giai đo n th  hai: X y ra s  chuy n bi n c a các phân t  protein d nạ ứ ả ự ể ế ủ ử ẫ  

đ n làm phá v  các m i liên k t đ ng hóa tr  tham gia vào ph n  ng. Khi đóế ỡ ố ế ồ ị ả ứ  

ph c ch t ES  đ ng th i x y ra hai quá trình là s  d ch chuy n thay  đ iứ ấ ồ ờ ả ự ị ể ổ  electron, d n đ n s  c c hóa c a m i liên k t tham gia vào ph n  ng và sẫ ế ự ự ủ ố ế ả ứ ự 

bi n d ng hình h c c a n i liên k t đ ng hóa tr  trong phân t  protein cũngế ạ ọ ủ ố ế ồ ị ử  

nh  trong trung tâm ho t đ ng c a enzyme, làm cho protein ho t đ ng, quáư ạ ộ ủ ạ ộ  trình th y phân d  dàng h n.ủ ễ ơ

Giai đo n th  ba: Giai đo n t o thành các acid amin và peptid c p th p,ạ ứ ạ ạ ấ ấ  

gi i phóng enzyme [11].ả

b, Các h  enzyme trong s n xu t n ệ ả ấ ướ c m m ắ

G m 3 h  enzyme l nồ ệ ớ

H  enzyme Metalo­protease (Aminodipeptidase): H  enzyme này t n t iệ ệ ồ ạ  trong n i t ng c a cá và ch u độ ạ ủ ị ược n ng đ  mu i cao nên ngay t  đ u nó đãồ ộ ố ừ ầ  

ho t đ ng m nh, gi m d n t  tháng th  3 tr  v  sau. Lo i enzyme này cóạ ộ ạ ả ầ ừ ứ ở ề ạ  

ho t tính khá m nh, có kh  năng th y phân r ng rãi đ i v i các lo i peptid.ạ ạ ả ủ ộ ố ớ ạ  Đây là nhóm th y phân enzyme trung tính, pH t i thích t  5­7, nó  n đ nh v iủ ố ừ ổ ị ớ  ion Mg2+, Ca2+ và m t ho t tính v i Znấ ạ ớ 2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+

H  enzyme serin­protease: Đi n hình là enzyme tripsin, t n t i nhi uệ ể ồ ạ ề  trong n i t ng c a cá.   giai đo n đ u c a quá trình s n xu t nộ ạ ủ Ở ạ ầ ủ ả ấ ước m mắ  

ho t đ ng c a nó y u đ n tháng th  2 và phát tri n d n đ t giá tr  c c đ i ạ ộ ủ ế ế ứ ể ầ ạ ị ự ạ ở tháng th  3 r i gi m d n đ n khi chứ ồ ả ầ ế ượp chín (protein phân gi i g n nh  hoànả ầ ư  toàn không còn   d ng peptol). H  enzyme này luôn b   c ch  b i chu i acidở ạ ệ ị ứ ế ở ỗ  amin trong c u trúc c a enzyme. Đ  tháo g  chu i này ph i nh  đ n ho tấ ủ ể ỡ ỗ ả ờ ế ạ  

đ ng c a enzyme cathepsin B nh ng enzyme cathepsin B d  b   c ch  b iộ ủ ư ễ ị ứ ế ở  

n ng đ  mu i cao. Vì v y đ  enzyme cathepsin B ho t đ ng đồ ộ ố ậ ể ạ ộ ược người ta 

th c hi n phự ệ ương pháp cho mu i nhi u l n. Enzyme serin­protease ho t đ ngố ề ầ ạ ộ  

m nh   pH t  5­10, m nh nh t   pH=9.ạ ở ừ ạ ấ ở

H  enzyme acid­protease: Có trong th t và n i t ng cá, đi n hình làệ ị ộ ạ ể  enzyme cathepsin D. H  enzyme này d  b   c ch  b i n ng đ  mu i kho ngệ ễ ị ứ ế ở ồ ộ ố ả  15% nên thường nó ch  t n t i m t th i gian ng n   đ u th i k  c a quá trìnhỉ ồ ạ ộ ờ ắ ở ầ ờ ỳ ủ  

th y phân. Lo i enzyme này đóng vai trò th  y u trong quá trình s n xu tủ ạ ứ ế ả ấ  

nước m m. ắ

c, Vai trò c a vi sinh v t  ủ ậ

Trong ướp chượp thường ch a m t lứ ộ ượng l n các vi sinh v t. Có thớ ậ ể tìm th y hàng trăm, hàng nghìn ho c hàng tri u t  bào trong 1 ml nấ ặ ệ ế ước chượ  p.Các vi khu n   đây thẩ ở ường thu c nhóm vi khu n lactic, thu c chi Micrococus,ộ ẩ ộ  

ngoài   ra   còn   có  Spirilum,   Proteus,   Leuconostoc,   Clostridium  và   n m   m c.ấ ố  

Nh ng vi khu n sinh bào t  tìm th y trong nữ ẩ ử ấ ước chượp là Bacillus [10]. 

Nhi u ch ng  ề ủ Bacillus  có kh  năng sinh proteaza đã đả ượ ức  ng d ngụ  trong s n xu t th c ph m. ả ấ ự ẩ Chi Bacillus là m t chi g m các vi khu n hình que,ộ ồ ẩ  nói chung Gram dương, h u h t có kh  năng chuy n đ ng, sinh trầ ế ả ể ộ ưởng hi uế  khí ho c hi u khí tùy ti n, h u h t có ph n  ng catalase dặ ế ệ ầ ế ả ứ ương tính, t t cấ ả 

đ u hình thành n i bào t  [19,20].  Ph n l n ề ộ ử ầ ớ Bacillus  là các vi khu n  a  mẩ ư ấ  

v i nhi t đ  sinh trớ ệ ộ ưởng t i  u t  30ố ư ừ 0 – 450C. M t s  loài có th  sinh trộ ố ể ưởng ở nhi t đ  65ệ ộ 0C. M t s  lo i  a l nh có th  sinh trộ ố ạ ư ạ ể ưởng và hình thành n i bàoộ  

t    0ử ở 0C, pH sinh trường r t khác nhau t  2 ­ 11 [30]. ấ ừ

Vi khu n lactic có vai trò quan tr ng trong b o qu n và ch  bi n đaẩ ọ ả ả ế ế  

d ng các lo i th c ph m lên men [1]. Lên men lactic giúp th c ph m ngănạ ạ ự ẩ ự ẩ  chăn s  phát tri n c a vi sinh v t gây đ c h i cho th c ph m. Aicd do quáự ể ủ ậ ộ ạ ự ẩ  trình lên  men t o ra cũng làm thay đ i hạ ổ ương c a các nguyên li u ban đ u vàủ ệ ầ  

c i thi n giá tr  dinh dả ệ ị ưỡng [6, 26]

Vi khu n Lactic: Kẩ hông đ ng nh t v  m t hình thái, các gi ng khácồ ấ ề ặ ố  nhau có hình d ng và kích thạ ước khác nhau. Nh ng nhìn chung chúng đư ượ  c

Gram (+), không có kh  năng t o bào t , không di đ ng, sinh axit lactic trongả ạ ử ộ  quá trình phát tri n, catalase, oxydase và kh  nitrat âm tính, không ch a cácể ử ứ  xitocrom, hô h p k  khí ho c vi hi u khí [5]ấ ỵ ặ ế

Hiroshi [17] khi nghiên c u v  vi sinh v t trong nứ ề ậ ước m m Thái Lan vàắ  

nước m m Nh t B n ông th y h u h t chúng là lo i vi khu n lên men lacticắ ậ ả ấ ầ ế ạ ẩ  

ch u đị ược đ  mu i cao. M t s  lo i n m m c phát tri n trong môi trộ ố ộ ố ạ ấ ố ể ường có hàm lượng đường kính cao, được phát tri n trong nể ước m m Thái Lan l iắ ạ  không có trong nước m m Nh t B n. Các loài ắ ậ ả Bacillus và Micrococcus đượ  cphân l p t  mu i bi n, còn  ậ ừ ố ể Micrococcus được phân l p trong c  thành ph nậ ả ầ  

c a mu i m  Các vi sinh v t có m t ngay trong thành ph n nguyên li u s nủ ố ỏ ậ ặ ầ ệ ả  

xu t là cá và mu i, chúng có kh  năng phát tri n trên môi trấ ố ả ể ường có đ  mu iộ ố  cao. M t s  lo i lên men lactic d  hình độ ố ạ ị ược phát hi n nh :  ệ ư Staphylococcus  saprophyticus, Micrococcus varians  trong nước m m Thái Lan, nắ ước m mắ  

Nh t B n. Vi khu n lên men lactic đ ng hình nh  ậ ả ẩ ồ ư Pediococcus halophilus từ 

các lo i nạ ước m m Malaixia. Nghiên c u v  vi sinh v t trong nắ ứ ề ậ ước m m Tháiắ  Lan,   Bulan   phithakpol   [14]   nh n   th y   các   loài   vi   khu n   thu c   nhómậ ấ ẩ ộ  

Micrococcus, Pediococcus, Staphylococcus sarcina, Bacillus liên quan đ n quáế  trình lên men

Vi sinh v t có m t ngay t  đ u c a quá trình ch  bi n do nguyên li u,ậ ặ ừ ầ ủ ế ế ệ  

d ng c  và t  môi trụ ụ ừ ường nhi m vào, nh ng do n ng đ  mu i cao nên chúngễ ư ồ ộ ố  không ho t đ ng đạ ộ ược. Song cũng có nhi u loài vi sinh v t  a m n ho c quenề ậ ư ặ ặ  

d n v i mu i có th  phát tri n m nh trong môi trầ ớ ố ể ể ạ ường mu i caoố

Ngay trong giai đo n ng n đ u tiên khi mu i ch a k p tác d ng, cóạ ắ ầ ố ư ị ụ  

m t ít vi sinh v t  gây th i ho t đ ng. V i s  hình thành c a nộ ậ ố ạ ộ ớ ự ủ ước b i, đổ ộ 

m n tăng d n lên, khi đ t t  12% tr  lên thì vi sinh v t gây th i h u nhặ ầ ạ ừ ở ậ ố ầ ư 

ng ng ho t đ ng và các vi khu n h u nh  cũng b   c ch  Nh  v y trong quáừ ạ ộ ẩ ầ ư ị ứ ế ư ậ  trình ch  bi n nế ế ước m m s  tham gia c a vi sinh v t  trong quá trình th yắ ự ủ ậ ủ  phân tương đ i y u nh ng v  s  hình thành mùi v  c a nố ế ư ề ự ị ủ ước m m trong quáắ  trình  ch  bi n thì vi khu n gây hế ế ẩ ương đã tham gia khá tích c cự [4]

d, Các nhân t   nh h ng đ n quá trình ch  bi n n c m m ố ả ưở ế ế ế ướ ắ

Quá trình ch  bi n nế ế ước m m có nhi u y u t   nh hắ ề ế ố ả ưởng đ n. Nh ngế ữ  

y u t  công ngh  đó là: Nhi t đ  lên men, pH, lế ố ệ ệ ộ ượng mu i, di n tích ti p xúcố ệ ế  

và  nh hả ưởng b i b n thân nguyên liêu:ở ả

Nhi t đ ệ ộ: Nhi t đ  tăng v n t c ph n  ng tăng, đ n m t nhi t đ  nàoệ ộ ậ ố ả ứ ế ộ ệ ộ  

đó s  không tăng n a và có th  gi m xu ng do nhi t đ  cao làm cho hẽ ữ ể ả ố ệ ộ ệ enzyme serin­protease m t ho t tính, quá trình th y phân kém. Nhi t đ  30 ­ấ ạ ủ ệ ộ  

47oC thích h p cho quá trình ch  bi n chợ ế ế ượp. Nhi t đ  70ệ ộ oC tr  lên h u h tở ầ ế  các h  enzyme trong cá m t ho t tính. Nâng nhi t đ  c a chệ ấ ạ ệ ộ ủ ượp lên b ng cáchằ  

ph i n ng, n u ho c s  d ng tôn nóng đ  che phân xơ ắ ấ ặ ử ụ ể ưởng [4]

pH: M i h  enzyme có pH t i thích khác nhau, vì v y ph i xem lo iỗ ệ ố ậ ả ạ  enzyme nào nhi u nh t và đóng vai trò ch  y u nh t trong quá trình s n xu tề ấ ủ ế ấ ả ấ  

nước m m đ  t o pH thích h p cho enzyme đó ho t đ ng. ắ ể ạ ợ ạ ộ

Qua th c nghi m cho th y: pH môi trự ệ ấ ường t  nhiên t  5,5­6,5 enzymeự ừ  tripsin và pepsin ho t đ ng đạ ộ ược, đ ng th i   pH này có tác d ng  c ch  m tồ ờ ở ụ ứ ế ộ  

ph n vi khu n gây th i. Vì v y   môi trầ ẩ ố ậ ở ường t  nhiên có pH thích h p cho quáự ợ  trình s n xu t nả ấ ước m m h nắ ơ .

L ượ ng mu i: ố   Mu i là nguyên li u quan tr ng cho quá trình s n xu tố ệ ọ ả ấ  

nước m m, thi u mu i nắ ế ố ước m m không hình thành đắ ược. Yêu c u c a mu iầ ủ ố  trong s n xu t nả ấ ước m m ph i là lo i mu i ăn, càng tinh khi t càng t t, k tắ ả ạ ố ế ố ế  tinh h t nh  có đ  r n cao, màu tr ng óng ánh.  N ng đ  mu i th p có tácạ ỏ ộ ắ ắ ồ ộ ố ấ  

d ng thúc đ y quá trình th y phân protein nhanh h n, chụ ẩ ủ ơ ượp mau chín. N ngồ  

đ  mu i quá cao có tác d ng  c ch  làm m t ho t tính c a enzyme, quá trìnhộ ố ụ ứ ế ấ ạ ủ  

th y phân ch m l i, th i gian th y phân kéo dài (protein b  k t t a b i mu iủ ậ ạ ờ ủ ị ế ủ ở ố  trung tính bão hòa)

Đ  ch  bi n chể ế ế ượp nhanh c n xác đ nh lầ ị ượng mu i cho vào trongố  

chượp là bao nhiêu và lượng mu i này ph i thõa mãn 2 đi u ki n: Không m nố ả ề ệ ặ  quá đ  tránh  c ch  ho t đ ng c a enzyme và không nh t quá đ  có đ  khể ứ ế ạ ộ ủ ạ ể ủ ả năng  c ch  s  phát tri n c a vi khu n gây th i.ứ ế ự ể ủ ẩ ố

Thường lượng mu i cho vào kho ng 20­25% so v i kh i lố ả ớ ố ượng cá. Nên 

th c hi n phự ệ ương pháp cho mu i nhi u l n và c n ph i xác đ nh s  l n choố ề ầ ầ ả ị ố ầ  

mu i, t  l  mu i c a m i l n và kho ng cách gi a các l n cho mu i đ  khôngố ỉ ệ ố ủ ỗ ầ ả ữ ầ ố ể  

nh h ng đ n quá trình s n xu t n c m m

Di n tích ti p xúc ệ ế : Mu n ph n  ng x y ra nhanh ph i có s  ti p xúc t tố ả ứ ả ả ự ế ố  

gi a enzyme và c  ch t. Các enzyme trong cá t p trung nhi u   n i t ng, nênữ ơ ấ ậ ề ở ộ ạ  

đ  tăng t c đ  th y phân ngể ố ộ ủ ười ta tìm cách tăng di n tích ti p xúc gi aệ ế ữ  enzyme và th t cá.ị

B n thân nguyên li u: ả ệ  Nh ng loài cá khác nhau, thành ph n hóa h c vàữ ầ ọ  

c u trúc cũng khác nhau, nh t là h  enzyme trong cá vì v y t o ra lo i nấ ấ ệ ậ ạ ạ ướ  c

m m có ch t lắ ấ ượng khác nhau [11]

1.2.2. S  đ   s n xu t.nơ ồ ả ấ ước m m truy n th ng [4,11]ắ ề ố

a, S  đ ơ ồ

b,  Thuy t minh s  đ ế ơ ồ

X  lý nguyên li u: Nguyên li u ph i đử ệ ệ ả ượ ửc r a s ch, lo i b  t p ch tạ ạ ỏ ạ ấ  

l p nh ng dày. Ph  m t l p mu i m t khá dày kho ng 2 – 3 cm trên cùng. ớ ư ủ ộ ớ ố ặ ả

L y nhi u l p lá ph  lên l p mu i m t. L p lá đấ ề ớ ủ ớ ố ặ ớ ược c t ch t vào cácộ ặ  thanh n p, dùng các đòn h  gài các thanh n p l i r i dùng hai đòn thẹ ạ ẹ ạ ồ ượng gác ngang qua thùng chượp đ  nén v  không b  tr i lên. M c đích c a khâu gài nénể ỉ ị ồ ụ ủ  

là v a gi  đừ ữ ược v  sinh, v a tác d ng l c ép đ  nệ ừ ụ ự ể ướ ừ ịc t  th t cá được ti tế  nhanh h n.ơ

 th i gian 2 ngày. Đây là giai đo n lên men khô, c  kh i ch p nóng

lên đ n g n 40ế ầ 0C.  Lên men khô y m khí v a có tác d ng phân gi i t t, v aế ừ ụ ả ố ừ  

t o hạ ương v  th m ngon.ị ơ

Giai đo n lên men ­ ch  bi n chạ ế ế ượp c  truy n: Đây chính lá quá trìnhổ ề  

th y phân protein trong cá nh  h  enzyme protease. S n ph m cu i cùng làủ ờ ệ ả ẩ ố  acide amin ho c peptide c p th p.ặ ấ ấ

Có 3 phương pháp ch  bi n chế ế ượp c  truy n:ổ ề

­ Phương pháp đánh khu y (Đây là phấ ương pháp c a Cát H i ­ H iủ ả ả  Phòng): Cho mu i nhi u l n đã l i d ng đố ề ầ ợ ụ ược kh  năng phân gi i c a enzymeả ả ủ  

và vi sinh v t t i m c đô cao, rút ng n th i gian ch  bi n chậ ớ ứ ắ ờ ế ế ượp. Cho mu iố  nhi u l n là t o đi u ki n đ  phòng th i, tiêu di t các vi khu n gây th i thôngề ầ ạ ề ệ ể ố ệ ẩ ố  

nước lã là cung c p cho môi trấ ường phân gi i m t lả ộ ượng vi sinh v t đáng k ,ậ ể  

t o môi trạ ường l ng giúp cho men và vi sinh v t ho t đ ng đỏ ậ ạ ộ ược d  dàng, làmễ  cho t  bào th t cá chóng đế ị ược phân gi i. Lả ượng nước cho thêm vào nên v aừ  

ph i, n u ít quá thì tác d ng phân gi i c a men kém nh ng n u nhi u quá thìả ế ụ ả ủ ư ế ề  không kh ng ch  đố ế ược quá trình th i r a, đ ng th i làm gi m đ  đ m trongố ữ ồ ờ ả ộ ạ  

nước m m. Vì v y, lắ ậ ượng nước cho vào còn tùy thu c đ c đi m c a nguyênộ ặ ể ủ  

li u, thệ ường t  20 – 30% so v i cá.ừ ớ

­ Phương pháp gài nén (Đây là phương pháp c a vùng khu 4 cũ ho c c aủ ặ ủ  các t nh phía Nam): Cá đỉ ược tr n đ u v i mu i cho đ  mu i ngay t  đ uộ ề ớ ố ủ ố ừ ầ  

ho c cho mu i nhi u l n, sau đó ặ ố ề ầ ướp vào thùng ho c b  r i gài nén. D a vàoặ ể ồ ự  men trong cá đ  phân gi i protide c a th t cá, không cho nể ả ủ ị ước lã và không đánh khu y.ấ

­ Phương pháp ch  bi n h  h p (k t h p hai phế ế ỗ ợ ế ợ ương pháp gài nén và đánh khu y).   Lúc đ u, th c hi n phấ ầ ự ệ ương pháp gài nén. Sau đó th c hi nự ệ  

phương pháp đánh khu y.ấ

Khi đã cho đ  mu i thì thân cá đã ng m đ  mu i, nát đ u và chìmủ ố ấ ủ ố ề  

xu ng, không còn hi n tố ệ ượng trương và n i lên n a. Lúc đó, ngổ ữ ười ta nói cá 

đã “đ ng cá”. Nh  nén ch t, nhi t n i có trong cá làm cho men ho t đ ng tăngứ ờ ặ ệ ộ ạ ộ  lên, trung tâm tích t  d n khí NHụ ầ 3, CO2, H2S  làm cho cá trương lên, th t cá bị ị 

xé nát nh ng xư ương và da v n còn nguyên. Mu i th m th u vào cá nẫ ố ẩ ấ ước ti tế  

ra g i là nọ ước b i. Kho ng 1 tháng sau thì cá chìm xu ng h n, nổ ả ố ẳ ước n i lên cóổ  màu vàng, trong và xu t hi n mùi nấ ệ ước m m rõ r t, lúc đó cá đã “đ ng m tắ ệ ứ ặ  

d u”. Màu s c c a nầ ắ ủ ước m m chuy n t  màu vàng nh t sang h n màu vàngắ ể ừ ạ ẳ  

đ m, nậ ước m m trong.ắ

Sau 6 – 12 tháng, chượp đã chín hoàn toàn, có th  chi t rút.ể ế

Đ c đi m c a phặ ể ủ ương pháp này là chượp chín cá v n còn nguyên con,ẫ  

xương không nát nên thu n l i cho vi c kéo rút.ậ ợ ệ

Chi t rút: Quá trình kéo rút nế ước m m là quá trình l c liên hoàn. Quáắ ọ  trình kéo rút là quá trình rút đ m trong bã không quá n u b ng cách dùngạ ấ ằ  

lượng nước b i ho c nổ ặ ước thu c ít đ m cho chuy n l n lộ ạ ể ầ ượ ừt t  thùng này qua thùng khác đ  tăng đ m và tăng hể ạ ương v ị

Sau khi chượp chín, nước m m ch  có mùi th m thu n túy, không cònắ ỉ ơ ầ  mùi h n t p c a chỗ ạ ủ ượp n a. Tuy v y, ph n bã v n còn mùi tanh. Ta rút ph nữ ậ ầ ẫ ầ  

nước có nàu vàng, trong phía trên (nước m m c t). Còn l i ph n xắ ố ạ ầ ương th t cáị  

ch a phân gi i h t ta ti p t c cho lên men. V i m i l n chi t rút ta l i bư ả ế ế ụ ớ ỗ ầ ế ạ ổ sung nước mu i vào đ  làm nố ể ước thu c. Quá trình lên men ti p t c phân gi iộ ế ụ ả  

h t lế ượng th t cá còn sót l i. Quá trình lên men và chi t rút d ng l i khi t t cị ạ ế ừ ạ ấ ả 

th t cá đã hoàn toàn đị ược phân gi i.ả

Ph i tr n: Mu n thu đố ộ ố ược nước m m có hắ ương v  th m ngon và cóị ơ  hàm lượng nit  nh  mong mu n, ta ph i pha đ u các lo i nơ ư ố ả ấ ạ ước m m có cóắ  hàm lượng nit  khác nhau, thơ ường pha nước m m có có hàm lắ ượng nit  caoơ  

v i nớ ước m m có có hàm lắ ượng nit  th p thành lo i nơ ấ ạ ước m m có có hàmắ  

lượng nit  trung bình. ơ

S n ph m nả ẩ ước m m thu đắ ược theo phương pháp c  truy n có  hổ ề ươ  ng

v  đ c tr ng nên đị ặ ư ược người tiêu dùng  a thích. Phư ương pháp này, trang thi tế  

b  đ n gi n, chi phí s n xu t th p. Nh ng do th i gian ch  bi n quá dài nênị ơ ả ả ấ ấ ư ờ ế ế  

hi u qu  kinh t  không cao, lệ ả ế ượng đ m m t đi l n, v  sinh an toàn th c ph mạ ấ ớ ệ ự ẩ  

th p. ấ

1.3. Quy trình s n xu t nả ấ ước m m có b  sung enzyme protease thắ ổ ương 

m i (quy trình s n xu t nạ ả ấ ước m m ng n ngày) ắ ắ

D a trên c  s  mu n rút ng n th i gian ch  bi n nự ơ ở ố ắ ờ ế ế ước m m ta c n bắ ầ ổ sung enzyme proteaza và t o đi u ki n thích h p cho enzyme ho t đ ng đạ ề ệ ợ ạ ộ ể thúc đ y nhanh quá trình th y phân. Đ  đáp  ng nhu c u ngày càng tăng vẩ ủ ể ứ ầ ề 

nước m m đã có nhi u nha khoa h c đã nghiên c u s  d ng enzyme proteazaắ ề ọ ứ ử ụ  nhân t o đ  rút ng n quá trình th y phân th t cá. Nguy n Th  D  (Vi n côngạ ể ắ ủ ị ễ ị ự ệ  ngh  Th c ph m) năm 1995 đã th c hi n đ  tài c p B  công nghi p “Nghiênệ ự ẩ ự ệ ề ấ ộ ệ  

c u   hoàn   thi n   quy   trình   s n   xu t   nứ ệ ả ấ ước   m m   ng n   ngày   b ng   enzymeắ ắ ằ  proteaza t  ừ B. subtilis”. K t qu  là rút ng n quy trình s n xu t nế ả ắ ả ấ ước m m t  6ắ ừ  – 8 tháng xuông còn 2 tháng, đ  đ m nộ ạ ước m m tăng t  8,3% lên 20,8% hi uắ ừ ệ  

xu t thu h i đ m tăng g p 2 l n, tiêu hao nguyên li u gi m 13%. Tuy nhiênấ ồ ạ ấ ầ ệ ả  các ngu n đ  thu enzyme có ngu n g c t  th c v t, đ ng v t, t  vi sinh v t,ồ ể ồ ố ừ ự ậ ộ ậ ừ ậ  

m c dù m i nghiên c u nh ng năm g n đây, nh ng nh ng nghiên c u vặ ớ ứ ữ ầ ư ữ ứ ề enzyme t  vi sinh v t đã đem l i nh ng thành t u đáng k , đóng góp to l nừ ậ ạ ữ ự ể ớ  vào thành công chung c a vi c nghiên c u rút ng n th i gian ch  bi n nủ ệ ứ ắ ờ ế ế ướ  c

m m. Enzyme có ngu n g c t  vi sinh v t đắ ồ ố ừ ậ ược s  d ng  u vi t h n cácử ụ ư ệ ơ  

ngu n enzyme khác. Ba lo i enzyme vi sinh v t chính thồ ạ ậ ường được s  d ngử ụ  trong thu  phân cá là:ỷ

+ Enzyme Flavourzyme: Đượ ảc s n xu t t  ch ng ấ ừ ủ A. oryzae, ch  ph m này baoế ẩ  

g m c  ho t tính endopeptidaza và exopeptidaza. pH thích h p cho quá trìnhồ ả ạ ợ  

th y phân là 5,0 – 7,0, nhi t đ  thích h p 45 – 55ủ ệ ộ ợ oC [25]

+ Enzyme Alcalase: Được s n xu t t  ch ng ả ấ ừ ủ B. licheniformis, Subtilisin A là 

thành ph n enzyme chính, đó là m t endopeptindaza. Nhi t đ  thích h p choầ ộ ệ ộ ợ  enzyme ho t đ ng tà 55 – 70ạ ộ oC. pH thích h p 6,5 – 8,5 [23].ợ

+ Enzyme Protamex: là m t enzyme proteaza c a ộ ủ Bacillus th y phân protein.ủ  Khác v i các endopeptindaza là protamex t o ra d ch th y phân protein khôngớ ạ ị ủ  

có v  đ ng ngay c  khi m c đ  th y phân r t th p. Protamex ho t đ ng t i  uị ắ ả ứ ộ ủ ấ ấ ạ ộ ố ư  

    Nướ ọc l c       L cọ

D ch th y phânị ủ  

S n ph mả ẩ     Hình 1. S  đ  qui trình ch  bi n nơ ồ ế ế ước m m b ng phắ ằ ương pháp enzyme

1.3.2. Thuy t minh quy trình ế

a, X  lý nguyên li u ử ệ

Cá c n ph i r a s ch các t p ch t nh  bùn, rác th i, t p ch t còn l nầ ả ử ạ ạ ấ ư ả ạ ấ ẫ  trong cá. Nguyên li u đệ ược nh p v  c n ti n hành phân lo i phân h ng d aậ ề ầ ế ạ ạ ự  trên kích thước và ch t lấ ượng c a cá, yêu c u đ t ra v i nguyên li u làm nủ ầ ặ ớ ệ ướ  c

m m là  đ ng đ u v  ch t lắ ồ ề ề ấ ượng và kích c  đ  quá trình th y phân di n raỡ ể ủ ễ  hàng lo t, đ u nhau nh  v y quá trình th y phân s  tri t đ  tránh hao phí hàmạ ề ư ậ ủ ẽ ệ ể  

lượng nit  do còn l i trong bã gây t n th t hàm lơ ạ ổ ấ ượng nit , làm gi m hi uơ ả ệ  

qu  kinh t  và gi m ch t lả ế ả ấ ượng nước m m. Đ i v i nh ng nguyên li u cá cóắ ố ớ ữ ệ  

kh i lố ượng và kích thướ ớc l n thì ph i x  lý đ p d p, nghi n nh  ho c c tả ử ậ ậ ề ỏ ặ ắ  khúc đ  quá trình th y phân di n ra hoàn thi n h n.ể ủ ễ ệ ơ

Mu i ph i s  d ng mu i ăn đã qua b o qu n, ít nh t là mu i đã đố ả ử ụ ố ả ả ấ ố ượ  c

b o qu n h n m t tháng và t  l  mu i ban đ u so v i cá là 10% sau 3 ngày thìả ả ơ ộ ỷ ệ ố ầ ớ  

b  sung mu i m t l n, m i l n 3% cho đ n khi t ng kh i lổ ố ộ ầ ỗ ầ ế ổ ố ượng mu i đố ủ 25%, th i gian th y phân tùy  theo phờ ủ ương pháp th y phân. ủ

b, Ti n hành th y phân ế ủ

Nguyên li u cá sau khi đệ ược x  lý đ p d p tr n đ u v i 0,1% chử ậ ậ ộ ề ớ ế 

ph m enzyme proteaza đ o tr n đ u trong 30 phút, đ  enzyme khu ch tánẩ ả ộ ề ể ế  trong nguyên li u, sau đó tr n v i mu i t  l  10% so v i nguyên li u cá và choệ ộ ớ ố ỉ ệ ớ ệ  vào thùng có n p đ y. H ng ngày m  n p đánh khu y 2 l n m i l n kho ngắ ậ ằ ở ắ ấ ầ ỗ ầ ả  

10 – 15 phút. Sau khi đánh đ o xong thì đ y n p l i tránh ánh n ng chi u tr cả ậ ắ ạ ắ ế ự  

ti p vào kh i chế ố ượp, sau 2 – 3 ngày thì cá nát nh  và  x y ra hi n từ ả ệ ượng cá đòi 

mu i (kh i chố ố ượ ủ ọp s i b t, mùi tanh b c lên) lúc này ta cho thêm 3% mu i n a,ố ố ữ  sau 1 – 2 tháng chượp đã vào giai đo n đã  n đ nh, mùi không còn tanh, có mùiạ ổ ị  

nước m m nh  Chắ ẹ ượp chín khi th y nấ ước c t có màu vàng nâu đ n màuố ế  cánh gián

S n xu t nả ấ ước m m theo phắ ương pháp ng n ngày đã đáp  ng đắ ứ ược nhu 

c u ngày c ng tăng c a ngầ ả ủ ười dân, gi m t n th t lả ổ ấ ượng nito trong quá trình 

ch  bi n. Tuy nhiên nế ế ước m m s n xu t theo phắ ả ấ ương pháp ng n ngày cóắ  

nhược đi m là mùi th m kém đ c tr ng do đó ch a h p d n ngể ơ ặ ư ư ấ ẫ ười tiêu dùng. 1.4. Các nghiên c u v  hứ ề ương nước m mắ

Người Vi t Nam đ u tiên tham gia nghiên c u nệ ầ ứ ước m m là Đinh Minhắ  Kha và Nguy n Xuân Th  Các nghiên c u xoay quanh v  ch  đ  ho t đ ngễ ọ ứ ề ế ộ ạ ộ  

c a proteaza và thành ph n c a nủ ầ ủ ước m m. Các nghiên c u này t p trung r tắ ứ ậ ấ  nhi u vào khu h  vi sinh v t cá và tác d ng c a chúng trong quá trình t o raề ệ ậ ụ ủ ạ  

nước m m ắ

1.4.1 M i liên quan gi a nguyên li u và h ố ữ ệ ươ ng n ướ c m m ắ

Bulan Phithakpl [14] cho bi t nế ước m m thắ ượng h ng c a Thái Lanạ ủ  

được s n xu t t  cá c m. Ngả ấ ừ ơ ười tiêu dùng tin tưởng r ng nằ ước m m t  cáắ ừ  

c m có hơ ương t t h n nhi u so v i nố ơ ề ớ ước m m t  nguyên li u khác. H u nhắ ừ ệ ầ ư 

t t c  các lo i cá bi n nh  đ u có th  t n d ng làm nấ ả ạ ể ỏ ề ể ậ ụ ước m m   Vi t Nam,ắ ở ệ  

th m chí c  cá nậ ả ước ng t cũng đọ ược các nhà nghiên c u đ a vào th  nghi m.ứ ư ử ệ  

Th c ti n cá nự ễ ước ng t không ph i là ngu n nguyên li u d i dào nên ch  y uọ ả ồ ệ ồ ủ ế  

Vi t Nam v n s n xu t t  các lo i cá bi n nh : Cá n c, cá thu, cá tráp…ệ ẫ ả ấ ừ ạ ể ỏ ụ

Nh ng c  s  s n xu t có ngu n nguyên li u truy n th ng là cá c m   Vi tữ ơ ở ả ấ ồ ệ ề ố ơ ở ệ  Nam đã n i ti ng v i các lo i nổ ế ớ ạ ước m m v i thắ ớ ương hi u riêng: Nệ ước m mắ  Phú Qu c, nố ước m m Nha Trang, Phan Thi t….c  s  s n xu t nắ ế ơ ở ả ấ ước m m ắ ở 

mi n B c đa s  s n xu t t  các lo i cá bi n nh  (cá t p). Thông thề ắ ố ả ấ ừ ạ ể ỏ ạ ường   cácở  

xí nghi p này (ví d  nh : Xí nghi p nệ ụ ư ệ ước m m c a H i Ngh  An, Xí nghi pắ ủ ộ ệ ệ  

nước m m H i Th nh ­ Nam Đ nh) luôn ph i t o ra các chắ ả ị ị ả ạ ượp hương. Các 

chượp này khác v i các lô chớ ượp còn l i   ch  nguyên li u đ a vào là cácạ ở ỗ ệ ư  

c m ho c cá trích. Nơ ặ ước m m rút ra t  các ô b    khác trắ ừ ể ước khi đem chế 

bi n, pha đ u t o thành nế ấ ạ ước m m thành ph m cho chay qua chắ ẩ ượp hươ  ng

đ  tăng hể ương v  đ c tr ng. Đi u này có nghĩa là trong dân gian, tuy ch a gi iị ặ ư ề ư ả  thích được vi c t o hệ ạ ương, nh ng kinh nghi m c a các nhà s n xu t đã choư ệ ủ ả ấ  

th y m i quan h  gi a nguyên li u là hấ ố ệ ữ ệ ương nước m m. ắ

­ Cá c m là lo i cá ăn n i, ho t đ ng m nh nên thành ph n c a cá ít m ơ ạ ổ ạ ộ ạ ầ ủ ỡ  Trong s n xu t không th y n i lên l p váng m  d y trên b  m t bả ấ ấ ổ ớ ỡ ấ ề ặ ể 

chượp nh  các ô b  khác. Vì v y mùi v  ôi khét c a nư ể ậ ị ủ ước m m ít x y raắ ả  (do oxy hóa l p d u m  b i oxy trong khí quy n).ớ ầ ỡ ở ể

­ Cá c m nói riêng và các lo i cá n i ho t đ ng nhi u nói chung có ho tơ ạ ổ ạ ộ ề ạ  tính enzyme proteaza trong th t cá, ru t cá cao h n các cá khác nên quáị ộ ơ  trình th y phân x y ra nhanh h n. Vì v y cùng m t đ n v  th i gian s nủ ả ơ ậ ộ ơ ị ờ ả  

xu t 6­ 12 tháng thì các ô b  có nguyên li u là cá c m th y phân tri t đấ ể ệ ơ ủ ệ ẻ 

h n không còn mùi tanh, ngái c a cá.ơ ủ

­ Cá c m kích thơ ước nh  h n các lo i cá khác nên d  th y phân, có thỏ ơ ạ ễ ủ ể các ch t t o hấ ạ ương được hình thành t  s  phân gi i th t cá qua s  tácừ ự ả ị ự  

d ng c a vi sinh v t và enzyme trong cá ụ ủ ậ

1.4.2.Các thành ph n hóa h c c a n ầ ọ ủ ướ c m m liên quan đ n h ắ ế ươ ng v ị  

c a n ủ ướ c m m c  truy n ắ ổ ề

Nước m m không ch  đắ ỉ ược s n xu t   Vi t Nam mà còn s n xu t ả ấ ở ệ ả ấ ở nhi u nề ước khác nhau nh : Thái Lan, Campuchia, Malaixia, Philippin, H ngư ồ  Kông, Trung Qu c. Đã có r t nhi u công trình khoa h c c a các tác gi  nố ấ ề ọ ủ ả ướ  cngoài công b  v  m i liên quan c a m t s  thành ph n hóa h c trong nố ề ố ủ ộ ố ầ ọ ướ  c

m m đ n v  c a nắ ế ị ủ ước m m   Thái Lan, Philippin, H ng Kông. K t quắ ở ồ ế ả nghiên c u c a Doagan và Haward [18] năm 1975 đã đứ ủ ược nhi u nhà khoa h cề ọ  khác   nh :   Mitsuya   Shimoda,   Rossana.R.Peralta,   Yutaka   Osajima   [22],ư  Clifford.G.Beddows Arhes G [16] công nh n và coi nh  là c  s  lý thuy t đậ ư ơ ở ế ể ban đ u đ  lý gi i chi ti t v  nguyên do phát sinh ra chúng. Tóm t t k t quầ ể ả ế ề ắ ế ả nghiên c u c a Dougan và Haward v  hứ ủ ề ương nước m m có th  tóm t t là:ắ ể ắ  

Hương nước m m đắ ược hình thành t  ba lo i hừ ạ ương v  khác nhau.ị

­ Mùi amoniac: ch  y u do s u t n t i c a amoniac và trimethylaminủ ế ự ồ ạ ủ

­ Mùi phó mát được hình thành t  các acid béo bay h i phân t  lừ ơ ử ượ  ng

th p. Các aicd béo d  bay h i này t n t i theo m t t  l  đ c tr ng cùngấ ễ ơ ồ ạ ộ ỉ ệ ặ ư  

v i s  tham gia  u th  c a ethernoic và acid butanoicớ ự ư ế ủ

­ Mùi th t cá: nó không do m t ch t riêng nào mà ph  thu c vào s  l nị ộ ấ ụ ộ ố ớ  các ch t d  bay h i.ấ ễ ơ

Ghi nh n v  s  có m t NHậ ề ự ặ 3 được phát hi n l n đ u tiên b i Rose [34]ệ ầ ầ ở  năm 1918. Sau này t m quan tr ng c a NHầ ọ ủ 3 trong nước m m đã đắ ược mô tả 

b i Chở ương Văn Chom [15]. NH3 gây ra (mùi th i) n ng mùi cho nố ặ ước m m,ắ  

vì v y trong nh ng năm g n đây hàm lậ ữ ầ ượng NH3 được ki m tra nghiêm ng t.ể ặ  

Nó là m t trong nh ng tiêu chu n đánh giá ch t lộ ữ ẩ ấ ượng nước m m có đ t tiêuắ ạ  chu n an toàn ch t lẩ ấ ượng th c ph m hay không.ự ẩ

1.4.3. Liên h  gi a vi sinh v t và h ệ ữ ậ ươ ng n ướ c m m ắ

 trong n c vi c phân l p và nh n d ng vi sinh v t có trong n c

m m đã đắ ược tác gi  Nguy n Th  Hoa  ả ễ ị [35]  bước đ u nghiên c u nh ng ầ ứ ư ở 

m c đ  nh  ch a có tính bao quát.ứ ộ ỏ ư  Nghiên c u c a Dứ ủ ương Văn H p ợ [2], c aủ  Nguy n  ễ Tr ng  ọ C n  ẩ [3]  v  vi sinh v t có liên quan đ n sinh hề ậ ế ương như 

Bacillus  Subltilis, Clostridium. G n đây nghiên c u c a giáo s  Ph m Thànhầ ứ ủ ư ạ  

H   đã   phân   l p   đổ ậ ược   m t   s   vi   sinh   v t   có   kh   năng   sinh   hộ ố ậ ả ương   như 

Staphylococcus intermedius, Vibrio costicola [7]

Năm 1930 Boez và Guillerm [32,33] đã phân l p đậ ược m t ch ng t  cáộ ủ ừ  

và t  giai đo n đ u c a quá trình s n xuât nừ ạ ầ ủ ả ước m m. Đó là vi khu n y mắ ẩ ế  khí, t o bào t  Ông cho r ng đó là m t ch ng m i thu c nhóm ạ ử ằ ộ ủ ớ ộ Clostridium có 

liên quan đ n t o hế ạ ương v  đ c bi t cho nị ặ ệ ước m m. Vi khu n này có đ c tínhắ ẩ ặ  

k  khí b t bu c, phát tri n t t trong môi trị ắ ộ ể ố ường có đường glucoza, maltoza, fructoza và đường kính, t o khí, nhi t đ  thích h p t  28 – 45ạ ệ ộ ợ ừ 0C. Nó có thể 

t o enzyme proteaza trong môi trạ ường mu i, ch  y u chúng t o ra các h pố ủ ế ạ ợ  

ch t ch a nit , d  bay h i trong nấ ư ơ ễ ơ ước m m. Sau này tác gi  Trắ ả ương Văn Chôm [15] đã phát hi n ra acid axetic và acid n.butanoic và gi  thi t r ng cóệ ả ế ằ  

th  vi khu n lên men lactic liên quan đ n v n đ  t o hể ẩ ế ấ ề ạ ương. Vi c phân h yệ ủ  protein t  cá là do hai nguyên nhân chính: Do enzyme có s n trong cá và doừ ẵ  enzyme t  vi sinh v t trong nừ ậ ước m mắ

Các s n ph m đả ẩ ược làm trong đi u ki n vô trùng thi u h n hề ệ ế ẳ ương vị 

c a nủ ước m m. Nh  v y vi sinh v t t n t i trong quá trình s n xu t m t m tắ ư ậ ậ ồ ạ ả ấ ộ ặ  thúc đ y nhanh quá trình phân h y b ng chính enzyme t o ra mà thành ph nẩ ủ ằ ạ ầ  quan tr ng h n c  là t o ra các s n ph m hình thành họ ơ ả ạ ả ẩ ương v  đ c tr ng c aị ặ ư ủ  

nước m m.ắ

Nhi u nhà nghiên c u khác nh  Saisithi và c ng s  [27] đã nghiên c uề ứ ư ộ ự ứ  vai trò vi sinh v t trong quá trình t o hậ ạ ương nước m m b ng cách phân tíchắ ằ  các h p ch t bay h i t  nợ ấ ơ ừ ước m m Thái Lan, Melver và c ng s  [21], Sancedaắ ộ ự  

và c ng s  [28,29] đã tách các thành ph n bay h i trong nộ ự ầ ơ ước m m Philippinắ  

r i so sánh chúng trong thành ph n nồ ầ ước m m Nh t B n, nắ ậ ả ước m m Vi tắ ệ  Nam. Suphson Chayovan và c ng s  [29] v i k t qu  phân tích thành ph n axitộ ự ớ ế ả ầ  bay h i và axit không bay h i, tác gi  nh n th y khó có th  ch  ra m t axitơ ơ ả ậ ấ ể ỉ ộ  riêng r  nào đó mang đ c tr ng c a hẽ ặ ư ủ ương v  nị ước m m. Hắ ương nước m mắ  

là do  nh hả ưởng c a các y u t  axit bay h i và các axit không bay h i t o raủ ế ố ơ ơ ạ  trong quá trình lên men. Các h p ch t ch a nit  có th  đóng vai trò quan tr ngợ ấ ứ ơ ể ọ  trong hương nước m m. M t kh  năng khác cũng đắ ộ ả ược d  đoán là hự ươ  ng

nước m m là k t qu  c a vi c t o ra các axit bay h i (acid axetic, acidắ ế ả ủ ệ ạ ơ  propionic,   acid   butyric,   acid  isobutyric,   acid   isovaleric)   t   ch ng   vi   khu nừ ủ ẩ  

acid lactic trong nước m m là k t qu  c a các vi sinh v t tham gia vào quáắ ế ả ủ ậ  trình lên men t o nên acid lactic.ạ

Chương 2 ­ NGUYÊN LI U VÀ PHỆ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

2.1 Nguyên li uệ

Nguyên li u chính ph c v  cho quá trình nghiên c u là các m u chệ ụ ụ ứ ẫ ượ  p các giai đo n khác nhau t  các xí nghi p s n xu t n c m m H i Phòng,

Ngh  An, và m u chệ ẫ ượp được làm t i Vi n Công Ngh  Th c ph m.ạ ệ ệ ự ẩ

Cá c m đơ ược cung c p b i c  s  s n xu t nấ ở ơ ở ả ấ ước m m Ngh  Anắ ệ

Enzyme protease thương ph m đẩ ượ ực l a ch n đ  nghiên c u trong đọ ể ứ ề tài là enzyme Alacalse, Flavourzyme được cung c p b i hãng Novoenzymeấ ở  (Đan M ch).ạ

D ng c : H p petri, pipet t  đ ng các lo i,  ng nghi m,  ng eppendorf,ụ ụ ộ ự ộ ạ ố ệ ố  

c c đong, đèn c n, que c y, bình tam giácố ồ ấ

 Thi t b  c  b n ph c v  thí nghi mế ị ơ ả ụ ụ ệ

Tên thi t bế ị Hãng s n xu tả ấ

­ Kính hi n viể Niko, Nh t B nậ ả

2.3. Môi trường phân l p và nuôi c y vi sinh v tậ ấ ậ

­ Môi tr ng Plate Count Agar: dùng đ  phát hi n vi khu n hi u khíườ ể ệ ẩ ế

­ Môi trường LB: dùng đ  nuôi c y nhóm ể ấ Bacillus 

a. Phân l p các ch ng vi sinh v t t  các m u ch ậ ủ ậ ừ ẫ ượ p cá

Pha loãng dung d ch m u   các c p đ  khác nhau  ị ẫ ở ấ ộ 10­1  đ n 10ế ­7…Tùy theo s  lố ượng vi sinh v t trong m u nhi u hay ít mà pha loãng đ n n ng đậ ẫ ề ế ồ ộ 

c n thi t. S  d ng nầ ế ử ụ ước c t đã h p vô trùng đ  pha loãng.ấ ấ ể  L y 100 µl t  m iấ ừ ỗ  

đ  pha loãng cho vào h p petri ch a môi trộ ộ ứ ường, dàn đ u b ng que trang vôề ằ  trùng, nuôi trong t   m   30ủ ấ ở 0C, quan sát khu n l c sau 16h, 24h, 36h, 48hẩ ạ

Phân l p vi khu nậ ẩ  Bacillus

Pha loãng dung d ch m u   các c p đ  khác nhau x  lý   80ị ẫ ở ấ ộ ử ở 0C trong 10 phút L y 100 µl t  m i đ  pha loãng cho vào h p petri ch a môi trấ ừ ỗ ộ ộ ứ ường (1), dàn đ u b ng que trang vô trùng, nuôi trong t   m   30ề ằ ủ ấ ở 0C, quan sát khu n l cẩ ạ  sau 16h, 24h, 36h, 48h

Xác đ nh nhóm vi khu nị ẩ  lactic 

Pha loãng dung d ch m u   các c p đ  khác nhau. L y 100 µl t  m i đị ẫ ở ấ ộ ấ ừ ỗ ộ pha loãng cho vào h p petri ch a môi trộ ứ ường PCA có ch a BCP, dàn đ u b ngứ ề ằ  que trang vô trùng, nuôi trong t   m   30ủ ấ ở 0C, quan sát khu n l c sau 16h, 24h,ẩ ạ  

36h, 48h. Các khu n l c nào có t o vòng sinh axit trên môi trẩ ạ ạ ường BCP đượ  ccác đ nh thu c nhóm vi khu n lactic ị ộ ẩ

b) Đ nh tên các ch ng vi khu n đã phân l p và tuy n ch n ị ủ ẩ ậ ể ọ

­       Nhu m b ng dung d ch tím k t tinh trong 1 phút, r a nộ ằ ị ế ử ước, th m khô.ấ

­        Nhu m l i b ng dung d ch Iod trong 1 phút, r a nộ ạ ằ ị ử ước, th m khô. ấ

­        Nh  d ch t y màu, gi  kho ng 30 giây, r a nỏ ị ẩ ữ ả ử ước, th m khô. ấ

­        Nhu m b  sung b ng dung d ch Safranin trong 2­3 phút, r a nộ ổ ằ ị ử ước, để khô trong không khí.  Soi kính: dùng v t kính d u 100X.ậ ầ

Vi khu n Gram (+) b t màu tím, Gram (­) b t màu đ ẩ ắ ắ ỏ

 Xác đ nh kh  năng sinh bào tị ả ử

C y vi khu n trên môi trấ ẩ ường th ch thạ ường. Sau 3 ngày ti n hành x  lýế ử  nhi t   80ệ ở 0C. Dùng vi khu n đã x  lý nhi t c y l i trên đĩa th ch thẩ ử ệ ấ ạ ạ ường đ tặ   30

ở 0C. Sau 24 gi  n u xu t hi n khu n l c thì k t lu n ch ng vi khu n cóờ ế ấ ệ ẩ ạ ế ậ ủ ẩ  

kh  năng sinh bào t  N u không thì k t lu n ngả ử ế ế ậ ượ ạc l i

Xác đ nh ho t tính catalazaị ạ

C y vi khu n vào  ng nghi m ch a 5 ml môi trấ ẩ ố ệ ứ ường th ch thạ ường d chị  

th , đ t    30ể ặ ở 0C. Sau 24 gi , nh  2 gi t Hờ ỏ ọ 2O2 vào d ch nuôi c y. N u s i b t taị ấ ế ủ ọ  

k t lu n có ho t tính catalaza. Ngế ậ ạ ượ ạc l i không có ho t tínhạ

 Ph ươ ng pháp tách ADN vi khu n ẩ

­ L y 2 vòng que c y vi khu n hoà vào 200 ấ ấ ẩ l TE trong  ng Eppendoftố

­ Thêm lyzozym vào, tr n đ u, sau đó     37ộ ề ủ ở 0C trong 30 phút

­ Thêm 100  l SDS 10%,     37ủ ở 0C trong 30 phút

­ Thêm 300  l PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, tr n đ uộ ề  trong đá l nh, sau đó ly tâm v i v n t c 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, l y d chạ ớ ậ ố ấ ị  trên (Bước này đượ ặ ạc l p l i 2 l n).ầ

­ Dùng etanol l nh v i th  tích g p 2 l n th  tích m u đ  t a ADN.ạ ớ ể ấ ầ ể ẫ ể ủ

­ R a t a b ng etanol 70%.ử ủ ằ

s  ch y v  c c d ng khi đ t trong đi n tr ng. K  thu t này đ c ti n hànhẽ ạ ề ự ươ ặ ệ ườ ỹ ậ ượ ế  trên m t đ m gel có tác d ng phân tách các axit nucleic theo kích th c.ộ ệ ụ ướ

­ Ti n hành:  ế Đun tan 1% agaroza trong dung d ch đ m TAE 1x đ  vàoị ệ ổ  khuôn, đ i cho ngu i và đ t t m gel vào trong máy đi n di, ng p trong ợ ộ ặ ấ ệ ậ 300ml dung d ch 1X TAE. Tr n đ u 2ị ộ ề l dung d ch loading buffer 6x v i 5ị ớ l m u, nhẫ ỏ vào gi ng. Ch y đi n di b ng dòng đi n m t chi u v i đi n th  100V, c ng đế ạ ệ ằ ệ ộ ề ớ ệ ế ườ ộ 

dòng đi n 80mA trong 30 phút, b  ra ngâm trong dung d ch EtBr (n ng đ  0,5ệ ỏ ị ồ ộ  l/ml) 20 phút v t ra. Quan sát v ch ADN trên máy soi gel.ớ ạ

Ki m tra các s n ph m c a PCR b ng đi n di:  ể ả ẩ ủ ằ ệ Ti n hành tế ương t  nhự ư 

đ i v i đi n di genom.ố ớ ệ

Do trong th c t  thự ế ường ph i s  d ng nh ng lả ử ụ ữ ượng axit nucleic r t nhấ ỏ (thường là micro­, nano­ ho c picogram) khi ti n hành các thí nghi m táchặ ế ệ  dòng. Không th  xác đ nh s  lể ị ố ượng này m t cách tr c ti p mà n ng đ  c aộ ự ế ồ ộ ủ  dung d ch axit nucleic đị ược xác đ nh b ng cách đo đ  h p th  t i bị ằ ộ ấ ụ ạ ước sóng 

260 nm (A260) trong máy đo quang ph  k  M t đ n v  (1,0) giá tr  h p thổ ế ộ ơ ị ị ấ ụ 

bước sóng 260 nm tương đương v i n ng đ  50ớ ồ ộ g/ml c a ADN s i kép, ho củ ợ ặ  

tương đương v i n ng đ  40ớ ồ ộ g/ml c a ADN ho c ARN m ch đ n. T  sủ ặ ạ ơ ỉ ố A260/A280 là ch  s  cho th y đ  nhi m các ch t nh  phenol ho c protein. T  sỉ ố ấ ộ ễ ấ ư ặ ỷ ố A260/A280 là 1,8 đ i v i m u ADN s ch.ố ớ ẫ ạ

 Ph n  ng khu ch đ i ADN cho gi i trình tả ứ ế ạ ả ự

S  d ng b  kít Cycle sequencing v i h n h p ph n  ng nh  sau :ử ụ ộ ớ ỗ ợ ả ứ ư

sánh v i các tr t t  c a các loài đã có trong ngân hàng gen qu c t  đ  xác đ nhớ ậ ự ủ ố ế ể ị  

đ n tên loài.ế

c.  Xác đ nh m t đ  vi sinh v t: ị ậ ộ ậ

­ Phương pháp đ m khu n l c trên đĩa th ch:ế ẩ ạ ạ

Vi khu n đẩ ược nuôi c y l c 180v/p trong 24h, sau đó ti n hành phaấ ắ ế  loãng d ch huy n phù đ n 10ị ề ế ­7, hút 50µl d ch pha loãng, c y g t trên môiị ấ ạ  

trường thích h p, đ t vào t   m 30 – 32ợ ặ ủ ấ 0C, sau 24h đ m s  lế ố ượng khu n l cẩ ạ  

V: th  tích d ch pha loãng c y tr i trên đĩa th chể ị ấ ả ạ

­ Phương pháp đo m t đ  quang h c­ODậ ộ ọ

Số  lượng tế bào vi sinh v t trong d ch nuôi cóậ ị  thể  xác đ nh gián ti pị ế  

b ng cách đo m tằ ậ  đ  quang h c. D ch nuôiộ ọ ị  được pha loãng 5 l n, đo OD ầ ở  

bước sóng 620 nm

2.4.2. Ph ươ ng pháp sinh hóa

a. Xác đ nh kh  năng ch u m n các ch ng vi sinh v t ị ả ị ặ ủ ậ

Thí nghi m đệ ược ki m tra trong môi trể ường MRS, LB v i đ  m n 2%,ớ ộ ặ  4%, 6%, 8%, 10%, 12% 

b. Xác đ nh  nh h ị ả ưở ng c a nhi t đ   t i s  phát tri n c a các ch ng vi ủ ệ ộ ớ ự ể ủ ủ   sinh v t ậ

        Chúng tôi ti n hành lên men trong môi trế ường l ng t i các kho ng nhi tỏ ạ ả ệ  

đ  độ ược kh o sát là: 20; 25; 30; 35 và 45ả 0C. K t qu  đế ả ược đo sinh kh i b ngố ằ  

phương pháp đo m t đ  quang h c ­ OD   bậ ộ ọ ở ước sóng   = 620nm. C  4h l yứ ấ  

m u ra đo m t l n. K t qu  cho trên đ  th  3   28h.ẫ ộ ầ ế ả ồ ị ở

c. Xác đ nh  nh h ị ả ưở ng c a pH t i s  phát tri n c a các ch ng vi sinh ủ ớ ự ể ủ ủ  

v t ậ

           Ti n hành nghiên c u  nh hế ứ ả ưởng c a pH đ n s  phát tri n c a cácủ ế ự ể ủ  

ch ng vi khu n trong môi trủ ẩ ường MRS và LB l ng. D i pH đỏ ả ược kh o sát tả ừ 

4 – 8,   nhi t đ  đã l a ch n, trong 48h. C  4h l y m u đo OD m t l n. K tở ệ ộ ự ọ ứ ấ ẫ ộ ầ ế  

qu  đả ược bi u di n trên đ  th  4,   28hể ễ ồ ị ở

d. Xác đ nh  nh h ị ả ưở ng c a t  l  ti p gi ng ủ ỷ ệ ế ố

   Chúng tôi ti n hành kh o sát t  l  ti p gi ng trong môi trế ả ỷ ệ ế ố ường l ng,ỏ  

v i các t  l  khác nhau: 1; 3; 5; 7; 10; 15; 20% gi ng. V i môi trớ ỷ ệ ố ớ ường có pH 

và nhi t đ  nuôi thích h p, trong 24h đem đo OD. ệ ộ ợ

e. Xác đ nh  kh  năng sinh enzyme proteaza c a các ch ng vi sinh v t ị ả ủ ủ ậ   phân l p  ậ

           Môi trường s  tuy n là môi trơ ể ường phân l p có n ng đ  mu i 10%ậ ồ ộ ố  

c ng 0.5% protein (s a tách béo). C y vi khu n c n ki m tra vào chính gi aộ ữ ấ ẩ ầ ể ữ  

h p l ng v i môi trộ ồ ớ ường s  tuy n. Sau th i gian nuôi c y   nhi t đ  thíchơ ể ờ ấ ở ệ ộ  

h p (48 – 72h). N u xung quanh v t c y xu t hi n vòng tròn thu  phân trongợ ế ế ấ ấ ệ ỷ  

su t thì ta nói r ng vi khu n có kh  năng sinh t ng h p proteaza. Và đo vòngố ằ ẩ ả ổ ợ  phân gi i (D­d;mm) trong đó:ả

D: Chi u r ng c a đề ộ ủ ường phân gi iả

d: Đ  r ng c a khu n l c vi khu nộ ộ ủ ẩ ạ ẩ

2.4.3 Ph ươ ng pháp tính toán th ng kê: ố

Th ng   kê   k t   qu   b ng   phố ế ả ằ ương   pháp   ANOVA   (chương   trình TAGRAPHIC) cho hai nhân t , v i s  ki m tra m c đ  khác bi t có ý nghĩaố ớ ự ể ứ ộ ệ  

c a nghi m th c qua ki m đ nh LSD.ủ ệ ứ ể ị

2.4.4 Ph ươ ng pháp c m quan [13] ả

Cách ti n hành ế :  

a) Ch  bi n m u chế ế ẫ ượp b ng cá c m theo phằ ơ ương pháp th y phân cáủ  

b ng enzyme sau đó b  sung các ch  ph m vi sinh v t sinh hằ ổ ế ẩ ậ ương

Cá: xay nh , tr n enzyme Flavouyme 0,3%, Alacalse 0,5%, mu i 10%ỏ ộ ố  cho vào bình gói kín đ    nhi t đ  thể ở ệ ộ ường 4 ngày, đ a vào đi u ki n t i  uư ề ệ ố ư  

500C trong 2 ngày, b  b  sung vi sinh v t đã đổ ổ ậ ược tuy n ch n vào các m uể ọ ẫ  

chượp theo t  l  10ỉ ệ 5 CFU/g nguyên li u cá, sau 3 ngày thì b  sung mu i m tệ ổ ố ộ  

l n, m i l n 3% cho đ n khi t ng kh i lầ ỗ ầ ế ổ ố ượng mu i đ  25%. Sau khi chố ủ ượ  pchín, c m quan hả ương th m nơ ước m m b ng phắ ằ ương pháp cho đi m.ể

b) M u đ i ch ng:ẫ ố ứ

Ch  bi n m u chế ế ẫ ượp b ng cá c m theo phằ ơ ương pháp th y phân cáủ  

b ng enzyme không b  sung các ch  ph m vi sinh v t sinh hằ ổ ế ẩ ậ ương. Các m uẫ  này được đánh giá c m quan nh  m u thí nghi mả ư ẫ ệ

C m quan mùi h ả ươ ng n ướ c m m ắ

Chu n b  m uẩ ị ẫ

Thành l p h i đ ng c m quan g m 6 thành viên làm vi c đ c l pậ ộ ồ ả ồ ệ ộ ậ

Đi mể Yêu c uầ

5 S n ph m có mùi th m r t đ c tr ng c a nả ẩ ơ ấ ặ ư ủ ước m m, d  ch uắ ễ ị

4 S n ph m có mùi th m đ c tr ng c a nả ẩ ơ ặ ư ủ ước m mắ

3 S n ph m có mùi th m nh  c a nả ẩ ơ ẹ ủ ước m mắ

2 S n ph m có mùi th m r t nh  c a nả ẩ ơ ấ ẹ ủ ước m mắ

1 S n ph m không có mùi th m c a nả ẩ ơ ủ ước m m, không có mùiắ  

a, Nghiên c u s  k t h p các ch ng vi khu n t i kh  năng sinh h ứ ự ế ợ ủ ẩ ớ ả ươ ng

Các ch ng vi khu n đủ ẩ ược đượ ực l a ch n, b  sung k t h p vào các m uọ ổ ế ợ ẫ  

chượp

K t h p hai ch ng vi khu n theo t  l  1:1ế ợ ủ ẩ ỉ ệ

K t h p ba ch ng vi khu n theo t  l  1:1:1ế ợ ủ ẩ ỉ ệ

K t h p b n ch ng vi khu n theo t  l  1:1:1:1 ế ợ ố ủ ẩ ỉ ệ

H n h p vi khu n b  sung vào các m u chỗ ợ ẩ ổ ẫ ượp theo t  l  10ỉ ệ 5  CFU/g nguyên li u cá. Đánh giá c m quan hệ ả ương th m nơ ước m m.ắ

 b,  nh h ng t  l  vi khu n v i kh  năng sinh h ng Ả ưở ỉ ệ ẩ ớ ả ươ

Các m u chẫ ượp được chu n b  bao g m Cá, mu i, enzyme. Lẩ ị ồ ố ượng vi khu n b  sung v i các t  l  10ẩ ổ ớ ỉ ệ 4, 105, 106 ,  10 7  CFU/g cá. Đánh giá c m quanả  

hương th m nơ ước m m.ắ

2.4.6 Ph ươ ng pháp phân tích

a. Phân tích các c u t  h ấ ử ươ ng b ng GC­ MS ằ

M u xác đ nh thành ph n hẫ ị ầ ương được phân tích các c u t  trên máyấ ử  GC­MS.

X  lý m u phân tích các c u t  t o hử ẫ ấ ử ạ ương: L y 300ml m u v i 450 mlấ ẫ ớ  

nướ ấc c t, trích ly b ng diethyl ether, làm khan, phân tích trên h  GC­MSằ ệ

Chương trình cài đ t phân tích GC­MSặ

­ GC: Injector: 1800C; He: 2ml/ phut; Chương trình nhi t đ  100ệ ộ 0C – 

1800C (200C/phút );  lượng m u b m 0.2ul; DB5 (30m x 0,25mm x 0,25um).ẫ ơ

­ MS: Ngu n Ion: 200 ồ 0C, 70 eV; Ph  quét: 30 – 300m/zổ

b. Phân tích protein t ng s  theo ph ổ ố ươ ng pháp Kjeldahl[9]

C  s  c a phơ ở ủ ương pháp: M u ph m v t đẫ ẩ ậ ược vô c  hóa b ng aicdơ ằ  sunfuric đ m đ c. H p ch t h u c  b  oxy hóa và t o thành COậ ặ ợ ấ ữ ơ ị ạ 2 và H2O còn nit  sau khi gi i  phóng ra dơ ả ưới  d ng NHạ 3  k t h p  v i  Hế ợ ớ 2SO4  t o thànhạ  (NH4)2SO4 tan trong d ch theo ph n  ng (1) và (2)ị ả ứ

R –CH2N­CH2­COOH +H2SO4       NH3 + CO2+ SO2+ H2O   (1)

NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 (2)

Đu i amoniac kh i dung d ch b ng NaOH, đ ng th i c t và thu b ngổ ỏ ị ằ ồ ờ ấ ằ  

m t lộ ượng d  acid boric Hư 3BO3 theo phương trình (3) và (4)

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O +2NH3 (3)2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O (4)

Đ nh phân lị ượng tetraborat amon t o thành b ng dung d ch Hạ ằ ị 2SO4 chu nẩ  0,1N qua đó d  dàng tính đễ ượ ược l ng nit  có trong m u v t theo phơ ẫ ậ ương trình (5)

(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 3H3BO3 (5)

Cách ti n hànhế

Vô c  hóa m u: Cân 100 mg m u khô vào bình Kjeldahl sao cho ph mơ ẫ ẫ ẩ  

v t không dính lên thành c  bình. Cho ti p vào bình kenđan 10ml Hậ ổ ế 2SO4 đ mậ  

đ c. Thêm h n h p xúc tác Kặ ỗ ợ 2SO4 : CuSO4 ( 3:1) có tác d ng làm tăng nhi t đụ ệ ộ sôi c a Hủ 2SO4 và làm tăng cường v n t c c a ph n  ng.ậ ố ủ ả ứ

Sau khi đã thêm các ch t xúc tác, đ t bình vào b  vô c  hóa m u. Đunấ ặ ộ ơ ẫ  cho đ n khi dung d ch hoàn toàn m t màu. Trong quá trình đun, th nh tho ngế ị ấ ỉ ả  

l c nh , tráng khéo sao cho không còn m t v t đen nào c a m u v t thíắ ẹ ộ ế ủ ẫ ậ  nghi m ch a b  phân h y sót l i trên thành bình. Đun cho đ n khi dung d chệ ư ị ủ ạ ế ị  trong bình hoàn toàn tr ng.ắ

C t m u: Sau khi vô c  hóa m u xong thêm kho ng 150ml nấ ẫ ơ ẫ ả ước c tấ  vào bình vô c  hóa m u thêm 2­3 gi t ch  th  phenolphtalein, ti p theo thêmơ ẫ ọ ỉ ị ế  kho ng 40 ml NaOH 30­40% dung d ch chuy n sang màu h ng là đả ị ể ồ ược. l pắ  nhanh vào b  c t thu NHộ ấ 3,   bình h ng đã có s n 20 ml Hở ứ ẵ 3BO3 và vài gi t chọ ỉ 

th  taxiro( chú ý đ u n i cong ph i ng p trong d ch). Sau khi c t kho ng 30ị ầ ố ả ậ ị ấ ả  phút nh c bình h ng và ki m tra lấ ứ ể ượng NH3 đã h t ch a b ng gi y qu , n uế ư ằ ấ ỳ ế  

đã h t ta mang m u đi đ nh phân lế ẫ ị ượng tetraborat amon t o thành b ng dungạ ằ  

d ch Hị 2SO4 0,1N cho đ n khi xu t hi n màu h ng nh t, ghi l i th  tích Hế ấ ệ ồ ạ ạ ể 2SO4 0,1N đã chu n đ  ­ a .ẩ ộ

Tính toán k t quế ả

X = a.1,4.100/mTrong đó X: hàm lượng nit  t ng s  tính b ng %ơ ổ ố ằ

a: s  ml Hố 2SO4 0,1N dùng đ nh phânị

1,4­ s  mg Nit   ng v i 1ml Hố ơ ứ ớ 2SO4 0,1N