Tổng quan nhuộm soi AFB, cấy vi khuẩn lao và kháng sinh đồ kháng lao

Mẫu thử được nhuộm soi trực tiếp tìm AFB (acid fast bacilli) và cấy tìm vi khuẩn (VK) lao được đựng trong những dụng cụ vô trùng nhanh chóng đem đến phòng xét nghiệm và xử lý ngay. Mẫu thử thường được lấy để tìm VK lao là đàm (nếu có nghi ngờ lao phổi). Đàm được lấy làm 3 mẫu liên tục vào sáng sớm khi mới ngủ dậy. Bệnh nhân (BN) được hướng dẫn để khạc ra đàm nhớt từ đường hô hấp dưới hoặc cho BN thở khí dung với nước muối sinh lý ưu trương, sau đó lấy mẫu đàm.

Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 TỔNG QUAN NHUỘM SOI AFB, CẤY VI KHUẨN LAO VÀ KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO Ngơ Thanh Bình* PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỬ, BẢO QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN Mẫu thử nhuộm soi trực tiếp tìm AFB (acid fast bacilli) cấy tìm vi khuẩn (VK) lao đựng dụng cụ vơ trùng nhanh chóng đem đến phòng xét nghiệm xử lý Mẫu thử thường lấy để tìm VK lao đàm (nếu có nghi ngờ lao phổi) Đàm lấy làm mẫu liên tục vào sáng sớm ngủ dậy Bệnh nhân (BN) hướng dẫn để khạc đàm nhớt từ đường hơ hấp cho BN thở khí dung với nước muối sinh lý ưu trương, sau lấy mẫu đàm BN hít sâu - lần, cố gắng ho khạc sâu từ lồng ngực Mở lọ đàm, đưa lại gần miệng nhổ đàm vào lọ (chú ý khơng lấy nước bọt nước mũi) Đóng nắp lọ lại cách chắn Chất lượng mẫu đàm tốt đàm đặc, khạc sâu từ phổi, đàm nhầy mủ, ml đàm Mẫu đàm có chất lượng tốt làm tăng khả phát AFB Trong trường hợp BN không khạc đàm được, trẻ nhỏ BN hôn mê, lấy dịch dày; BN thở máy có đặt ống nội khí quản lấy đàm qua ống nội khí phế quản Dịch dày xử lý giờ, nên cho thêm Sodium Carbonate muối đệm khác trung hòa acid dịch vị để bảo vệ VK lao diện mẫu thử Có thể lấy mẫu thử dịch rửa qua soi rửa phế quản Các mẫu thử khác lấy để soi cấy tìm VK lao (tùy trường hợp bệnh lý cụ thể) như: máu, dịch màng phổi, dịch màng bụng, dịch khớp, nước tiểu, tủy xương, dịch não tủy, mủ, mô bệnh… Tất mẫu thử không xử lý nên bảo quản – 100C, tốt để ngăn mát tủ lạnh, chuyển Tránh nhiệt độ cao ánh sáng mặt trời Chuyển đến phòng xét nghiệm vòng tuần tốt chuyển ngày Để khử trùng mẫu thử, người ta dùng số dd để loại bỏ VK ngoại nhiễm như: dung dịch (dd) Zepharin gồm Benzalkonium + Trisodium phosphate NaOH2%, NaOH4%; dd NaOH2% + dithiothreitol; dd NaOH2% + N-Acetyl-LCysteise (NALC); dd NaOH4% + Dithiothreitol; dd NaOH4% + NALC (NALC Dithiothreitol dùng ly giải chất nhầy) Mẫu thử sau xử lý dd khử trùng quay ly tâm với vận tốc 3.000 vòng/phút Sau ly tâm, chất lipids thành tế bào lên loại bỏ, lấy phần cặn lắng chứa Mycobacteria(2,3,7,34) PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOI AFB TRỰC TIẾP Quan sát trực tiếp kính hiển vi (KHV) sau mẫu thử nhuộm acid nhanh (AFB) phương pháp (PP) nhanh để tìm VK lao Nếu AFB (+) hỗ trợ cho chứng bị bệnh lao trước có kết xác định VK lao PP cấy mẫu thử Chất lipid cao thành tế bào Mycobacterium ngăn cản thấm thuốc nhuộm anilin Do đó, VK lao không nhuộm kỹ thuật nhuộm Gram mà nhuộm với phương pháp (PP) nhuộm acid nhanh Có PP nhuộm acid nhanh thường dùng: (1) Nhuộm Carbol-fuchsin gồm kỹ thuật Ziehl-Neelsen kỹ thuật Kinyoun; (2) Nhuộm Fluorochrome dùng thuốc nhuộm Auramin – (2,3,7,10,14,23,34) Rhodamine Phương pháp nhuộm Carbol-fuchsin Nhuộm Ziehl-Neelsen nhuộm Kinyoun khác kỹ thuật nhuộm chủ yếu Kỹ thuật Ziehl-Neelsen đòi hỏi hâm nóng Cabolfuchsin để thấm vào thành tế bào Mycobacteria Kỹ thuật Kinyoun PP nhuộm “lạnh” * Bộ môn Lao Bệnh phổi - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Ngơ Thanh Bình ĐT: 0908955945, Email: bsthanhbinh@yahoo.com 26 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 cách cho nhiều phenol vào dd nhuộm để tăng tính thấm vào thành tế bào Mycobacteria Cả PP nhuộm cho kết VK lao bắt màu đỏ bật xanh methylene Kính phết quan sát KHV vật kính 100 có ngâm dầu Kỹ thuật Ziehl-Neelsen tìm AFB trực tiếp đàm đánh giá PP nhanh (chỉ sau vài chục phút), dễ làm rẻ tiền nên sử dụng rộng rãi Nhược điểm PP cho kết soi AFB (+) có 105 VK lao lam kính Quy trình tiến hành kỹ thuật Ziehl-Neelsen để nhuộm soi tìm AFB đàm (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) Ghi số lên tiêu vào bên trái lam kính, đảm bảo số tên tiêu tương ứng với số ghi thành lọ đàm Dàn tiêu bản: dùng que lấy mẫu đàm tươi phết trực tiếp lam kính với kích thước x cm Dàn đàm trải đều, mịn lam kính, theo đường xốy ốc liên tục từ ngồi Vết dàn cân đối lam, với độ dày vừa phải Để tiêu khô tự nhiên 15 – 30 phút Không dùng lửa để làm khô Cố định tiêu bản: đưa tiêu nhanh qua phía bên lửa đèn cồn từ – lần, lần – giây, mặt lam kính có chứa mẫu thử đặt hướng lên phía Các tiêu xếp theo thứ tự lên giá nhuộm, cách 0,5 cm Sau đó, nhuộm tiêu cách nhỏ dd carbol fuchsin 0,3% lên phủ kín tồn bề mặt tiêu để phút Mỗi lần nhuộm khơng q 12 tiêu Hơ nóng tiêu từ phía lúc Fuchsin bắt đầu bốc khoảng phút (không để lửa lâu Fuchsin sôi) Rửa tiêu với nước sạch, nhẹ nhàng vòi nước máy để loại bỏ Fuchsin thừa nghiêng tiêu cho chảy khỏi tiêu Lúc tiêu có màu hồng Tẩy màu tiêu nhuộm cách nhỏ dd H2SO4 25% (hoặc dd HCL 3%) lên tiêu để phút Màu hồng bề Chuyên Đề Nội Khoa I Tổng Quan mặt tiêu hoàn toàn biến (8) Rửa tiêu nhẹ nhàng với nước để tẩy hết dd thuốc nhuộm, nghiêng tiêu cho chảy khỏi tiêu Nếu bề mặt tiêu màu hồng phải tiến hành tẩy màu lần thứ hai (từ 1–3 phút), sau rửa lại với nước nghiêng tiêu để nước chảy hết (9) Nhỏ Bleu methylen 0,3% phủ kín bề mặt tiêu để phút (10) Rửa tiêu nhẹ nhàng với nước nghiêng tiêu cho chảy khỏi tiêu bản, để khơ tự nhiên khơng khí Khơng làm khô lam giấy thấm (11) Soi lam KHV với vật kính dầu x100 (trong khoảng phút) đọc kết Bắt đầu đọc từ phần đầu trái tiêu qua phải, chuyển dòng khác từ phải qua trái VK lao có hình que, mảnh, cong, bắt màu đỏ đứng riêng biệt hay xếp đôi đám dễ nhận biết xanh Đếm số lượng AFB ghi kết Kết (+) tính phải ghi mực đỏ Bảng 1: Cách đọc kết PP nhuộm CarbolFuchsin Kết soi Kết đọc > 10 AFB/1 vi trường Dương tính 1-10 AFB/1 vi trường Dương tính 10-99 AFB/100 vi Dương tính trường 4-9 AFB/100 vi trường Dương tính 1-3 AFB/100 vi trường Âm tính AFB/ 100 vi trường Âm tính Phân loại (+++) (++) (+) Ghi số VK cụ thể Xin thử lại Phương pháp nhuộm Fluorchrome Nhuộm Auramine 0, VK lao có màu vàng sáng đen dễ dàng thấy vật kính 25 Nhuộm Auramine - Rhodamine cách cho thêm Rhodamine vào cho kết màu vàng VK lao Kỹ thuật dùng nhuộm mặt cắt mơ để tìm VK lao Đếm số lượng AFB lam nhuộm Fluorochrome KHV vật kính 25 27 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Bảng 2: Cách đọc kết PP nhuộm Fluorochrome Số lượng VK thấy AFB / lam kính 1-2 AFB /lam 3-9 AFB /lam  10 AFB /lam Kết âm tính (+) (++) (+++)  AFB /quang trường (++++) PP nhuộm Fluorochrome nhạy PP nhuộm Carbol-fuchsin Kính phết nhuộm Fluorochrome quan sát KHV vật kính 25 Trong vật kính dầu dùng để quan sát kính nhuộm Carbol-fuchsin PP nhuộm Fluorochrome PP nhuộm khơng phân biệt vi sinh vật chết Ngoài ra, VK lao điều trị hóa trị liệu nhuộm PP huỳnh quang Tuy nhiên, thầy thuốc lâm sàng nên ý diện VK lao qua PP soi trực tiếp chắn chẩn đốn bệnh lao (dương tính giả) Phòng ngừa đọc sai kết nhuộm soi AFB Phòng ngừa đọc sai kết dương tính Đảm bảo khơng có thức ăn chất xơ mẫu đàm Tốt cho BN súc miệng nước trước khạc đàm để không bị lẫn thức ăn Dùng tiêu (lam kính) mới, khơng có vết trầy xước Sử dụng que phết đàm riêng cho bệnh phẩm Dùng Carbol Fuchsin lọc hạn sử dụng Khơng để Carbol Fuchsin khô nhuộm Tẩy màu cồn acid Khơng để vật kín dầu chạm vào tiêu Lau vật kính dầu sau lần soi tiêu (+) Các lọ đàm, tiêu phiếu xét nghiệm phải ghi xác Đối chiếu sổ xét nghiệm xác trước ghi kết Ghi báo cáo kết xác Phòng ngừa đọc sai kết âm tính Đảm bảo bệnh phẩm đàm, nước bọt Chọn mẫu đàm đặc, mủ để làm tiêu Đủ số lượng đàm cần thiết (ít ml) 28 Dàn tiêu không dày mỏng Cố định tiêu đủ thời gian Nhuộm Carbol Fuchsin đủ phút phải đọc đủ 100 vi trường Lọ đàm, tiêu phiếu xét nghiệm phải ghi xác Đối chiếu sổ xét nghiệm xác trước ghi kết Ghi báo cáo kết xác PHƯƠNG PHÁP CẤY ĐỊNH DANH VI KHUẨN LAO Mẫu thử sau nhuộm soi AFB trực tiếp, cho dù kết dương hay âm, nên cấy để xác định VK lao Xác định sớm tình trạng VK lao kháng thuốc ưu tiên chương trình chống lao nhằm giúp đề chiến lược điều trị lao thích hợp giám sát chặc chẽ kháng thuốc Xác định VK lao kháng thuốc thực PP xét nghiệm cổ điển dựa vào việc xác định phát triển VK lao với có mặt thuốc kháng lao Tuy nhiên, PP đòi hỏi phải có thời gian dài cần thiết kết Những năm gần đây, nhiều kỹ thuật tiếp cận bao gồm PP dựa vào kiểu hình PP dựa vào kiểu gen Các PP xác định VK lao kháng thuốc(2,3,6,7,10,11,14,17,20,21,23,34): Môi trường nuôi cấy kinh điển Có loại mơi trường cấy kinh điển khác dùng để nuôi cấy VK lao môi trường trứng, môi trường agar, môi trường chất lỏng môi trường chọn lọc Môi trường trứng (egg-based) Chứa thành phần trứng, khoai tây, muối, glycerol malachite green (một loại thuốc nhuộm) Môi trường làm đặc nhiệt độ 85 - 900C 30 - 45 phút, gồm: (1) môi trường Lowenstein - Jensen thường dùng nhất; (2) môi trường Petragnani ức chế VK tạp nhiễm mạnh dùng tạp khuẩn mạnh; (3) môi trường American Throracic Society môi trường hữu dụng cho Mycobacteria mọc phát triển mẫu thử không bị Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ngoại nhiễm Môi trường thạch (agar –based) Gồm Middle brook 7H10; Middle brook 7H11; Middle brook 7H12 Các môi trường Middle brook 7H10 7H11 môi trường chứa agar, hợp chất hữu cơ, muối, glycerol, albumine Môi trường Middle brook 7H11 khác với 7H10 có cho thêm 0,1% casein hydrolysate, chất làm tăng tốc độ phát triển Mycobacterium Nói chung, VK lao phát triển tốt môi trường Middle brook 7H11 môi trường Lowenstein-Jensen Môi trường chất lỏng Được dùng kỹ thuật MODS (Microscopic observation broth-drug susceptibility assay) dùng để phát sớm M tuberculosis mọc môi trường chất lỏng, rút ngắn thời gian chẩn đoán làm kháng sinh (KS) đồ PP dựa trình tạo thành lõi đặc trưng M tuberculosis môi trường chất lỏng quan sát KHV với mặt thấu kính lồi Mơi trường chọn lọc Là mơi trường cấy cho thêm KS để ức chế VK ngoại nhiễm Một số môi trường chọn lọc thường dùng gồm: Lowenstein-Jensen Gruft; Mycobactosel® (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD); Selective Middle brook 7H11 (S7H11); BACTEC® Middle brook 7H12 Bảng 3: Các mơi trường cấy tìm VK lao: Mơi trường Thành phần Tác nhân ức chế Môi trường trứng (Egg based) Lowenstein- Trứng đông lạnh, muối, Malachite-green Jensen glycerol, khoai tây lát 0,025% Petragnani Trứng đông lạnh, khoai Malachite-green tây, glycerol, sữa, khoai 0,052% tây lát American Lòng đỏ trứng đơng lạnh, Malachite-green Thoracic glycerol, khoai tây miếng 0,02% Society Môi trường thạch (Agar based) Middlebrook Muối, glycerol, dextrose, Malachite-green 7H10 albumine, vitamines, 0,0025% cofactors, oleic acid, catalase Chuyên Đề Nội Khoa I Tổng Quan Môi trường Thành phần Tác nhân ức chế Middlebrook Muối, glycerol, albumine, Malachite-green 7H11 vitamines, cofactors, oleic 0,0025% acid, catalase, 0,1%casein hydrolysate Middlebrook 7H9 broth, casein loại KS 7H12 hydrolysate, bovine serum albimine, catalase, 14 C.-palmitic acid Bảng 4: Các mơi trường cấy tìm VK lao có chọn lọc Mơi trường có chọn lọc Lowenstein-Jensen Gruft Middlebrook 7H11 chọn lọc R Mycobactosel Lowenstein-Jensen Middlebrook 7H12 xạ Tác nhân ức chế Penicilline, Nalidixic acid, Malachite green Carbenicilline, Polymycine B, Trimethoprim lactate, Amphotericin B, Malachite green Lincomycine, Cycloheximide, Nalidixic acid, Malachite green Polymyxin, Azlocilline, Nalidixic acid, Trimethoprim, Amphotericin B Kỹ thuật cấy tìm VK lao qui ước Sau quay ly tâm mẫu thử lấy 0,25 ml phần cặn lắng mẫu thử phết bề mặt môi trường cấy chứa ống nghiệm hòa 0,5 ml mơi trường cấy đĩa Nắp đậy ống nghiệm để mở để cung cấp đủ khí CO2 cho mơi trường cấy Còn đĩa chứa mơi trường cấy đặt túi nhựa polyethylene thấm CO2 Tất mơi trường cấy ủ tuần nhiệt độ 350C, - tuần thời gian ủ nên để - 10% áp lực CO2 mơi trường cấy Những mẫu thử có AFB dương tính, kết cấy âm tính sau tuần ủ nên ủ thêm tuần Trong tuần phải kiểm tra hai lần tuần, tuần lại tối thiểu lần tuần Khi khúm Mycobacteria mọc quan sát kỹ thuật khác thực dựa khúm VK lao mọc như: lam kính phết nhuộm acid nhanh, KS đồ, xét nghiệm hóa sinh, xét nghiệm khảo sát acid nucleic Cấy tìm M tuberculosis phát 12 ngày sau tiêm môi trường trứng môi trường không chọn lọc đĩa cấy Tuy nhiên, thời gian mọc trung bình mơi trường thuận lợi 29 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 - tuần Có chủng đòi hỏi tuần trước khúm VK phát rõ ràng Tốc độ mọc thật Mycobacteria xác định nuôi cấy cấp hai môi trường canh cấy Middlebrook 7H9 ghi nhận thời gian cần thiết cho phát triển VK lao Những khúm M tuberculosis gồ ghề, giống bơng cải có màu da bò nhạt Các PP khác cấy tìm VK lao Phát đo xạ kế Là kỹ thuật tự động phát triển việc phát nhanh VK lao mọc mẫu thử Hệ thống BACTEC® (Johnston Laboratories Inc., Cockeysville, MD) dùng mơi trường Middle brook 7H12 lỏng chứa acid palmatíc đánh dấu C14 để phát VK lao mọc xạ kế C đánh dấu tạo CO2 suốt q trình mọc trao đổi khí Khi phát triển VK lao đạt đến phát triển định trước số mũ 10, định số lượng CO2 tạo ra, kết dương tính ghi nhận hệ thống BACTEC® Thuận lợi kỹ thuật rút ngắn thời gian phát tăng trưởng VK lao phân biệt M tuberculosis với loại Mycobacterium khơng điển hình khác – ngày PP sinh hóa để nhận dạng VK lao Nhận dạng M tuberculosis dựa số tiêu chuẩn cổ điển bao gồm: nhuộm acid nhanh, tỉ lệ mọc, hình thái khúm VK, tiết niacin, giảm tiết nitrat, bất hoạt hóa men catalase 680C tính nhạy cảm với Thiophene2-Carboxylic Hydrazide (TCH) Xét nghiệm Niacin Niacin chất chuyển hóa tan nước mẫu thử có chứa Mycobacteria, sản xuất sau 3-4 tuần nuôi cấy Hầu hết mẫu thử có chứa men chuyển hóa Niacin tự thành Niacin ribonucleotide Những M tuberculosis thiếu vắng men chất Niacin tự chiết xuất từ môi trường nuôi cấy cho vào ống nghiệm 30 có ống đèn lọc huỳnh quang Ống đèn lọc tạo khí Cyanogen chloride phản ứng với Niacin tự dịch chiết xuất cho kết màu vàng Kết gọi xét nghiệm Niacin dương tính chứng tỏ mẫu thử có chứa M tuberculosis Mặt khác, M tuberculosis khơng thể chuyển hố chất niacin sản xuất ra, xuất vào mơi trường ni cấy Có nhiều phương pháp phát Niacin phương pháp phải cho thêm cyanogen bromide Xét nghiệm khử Nitrat Cho biết khả chủng sản xuất enzym khử nitrate thành nitrite, dùng để phân biệt M tuberculosis với Mycobacteria tạo sắc tố tối (scotochromogenic Mycobacteria) M avium-intracellular complex M tuberculosis có chứa men nitroreductase cho kết dương tính mạnh Một loopful Mycobacteria mọc có hoạt tính nhũ tương hóa dd Sodium Nitrat ủ 370C bồn nước Những chất phản ứng thử xét nghiệm (gồm dd Sulfanilamide Nounnaphthylenediamine) cho vào môi trường sau ủ Nếu xuất màu đỏ kết xét nghiệm xem dương tính Ngược lại, cho thêm bột kẽm vào, màu đỏ xuất kết xét nghiệm âm tính thật Các xét nghiệm cho kết nhanh, dễ thực hai xét nghiệm xác định mặt sinh hóa thường dùng để định danh M tuberculosis Một chủng có phản ứng (+) với xét nghiệm niacin xét nghiệm khử nitrate định danh chắn M tuberculosis Xét nghiệm P Nitro--acetylamino-hydroxypropiophenone (NAP) Dùng để phân biệt phức hợp M tuberculosis với loại khác Cơ chế: dựa ức chế phức hợp M tuberculosis NAP PP dùng hệ BACTECR xạ kế, cho phép xác định phức hợp M tuberculosis ngày sau cấy mọc môi trường Middle brook 7H12 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Xét nghiệm nhạy cảm với Thiophene -2-Carboxylic acid hydrazide (TCH) Dùng để phân biệt M tuberculosis M.bovis M bovis nhạy cảm với TCH, M tuberculosis đề kháng TCH hợp vào môi trường cấy agar 7H11 với tỉ lệ nồng độ /ml Môi trường cấy VK lao ủ thời gian từ 14 - 21 ngày 370C, với áp suất CO2 - 10% Sự nhạy cảm với TCH định khúm VK lao mọc mơi trường agar 7H11 có chứa KS tự không mọc môi trường TCH Xét nghiệm Catalase Hầu hết Mycobacteria bao gồm M tuberculosis sản xuất men catalase Tuy nhiên, số lượng men catalase sản xuất tính ổn định 680C phụ thuộc tùy loại Mycobarterium (1) Xét nghiệm định lượng: cho dd Tween-80-peroxydase (có chứa hydrogen peroxide 30%) vào mơi trường cấy LowensteinJensen để nghiêng có khúm tế bào Mycobacterium mọc Phản ứng quan sát sau phút, xuất cột khí đo kích thước cột khí Kết quả: < 50mm M Tuberculosis;  50mm M Fortuitum (2) Tính ổn định: M tuberculosis tiết men catalase không ổn định với nhiệt Ở nhiệt độ 680C 20 phút men catalase bất hoạt Còn M Fortuitum tiết men catalase ổn định với nhiệt Do đó, lấy mẫu thử đun nóng 680C 20 phút cho dd Tween 80-peroxide vào Nếu khơng tạo thành bọt khí mẫu thử có chứa M tuberculosis Xác định PP sắc ký Lipids thành tế bào Mycobacteria chiết xuất kỹ thuật chiết xuất ether-hexane đòi hỏi looful VK (0,001ml) Chất chiết xuất ly giải sắc ký khí trang bị với cột thủy tinh máy dò ion hóa lửa PP đơn giản có kết sau Một tiêu chuẩn tham khảo kiểm tra hàng ngày để cung cấp cho người làm sắc ký kết xác Ion chọn lọc Chuyên Đề Nội Khoa I Tổng Quan theo dõi phát acid tuberculostearic acid mycocerosic mẫu đàm cấy ngày báo cáo hữu ích cho việc chẩn đoán lao thời gian gần Tuy nhiên, PP khơng thực tiễn cho phòng xét nghiệm lâm sàng thường quy Xác định khảo sát acid Nucleic Khảo sát acid nucleic mở kỷ nguyên phòng xét nghiệm lâm sàng việc xác định nhiều loại Mycobacteria Khảo sát thực nhanh chóng dễ dàng mà phòng xét nghiệm lâm sàng dùng khảo sát để xác định môi trường cấy Đồng thời dùng PP PCR (Polymerase Chain Reaction) để tìm VK lao cách phóng đại đoạn ADN Mycobacterium có mẫu thử lên gấp nhiều lần, dùng đoạn ADN mẫu sản xuất phòng xét nghiệm đem so sánh, cho phép xác định chủng Mycobacteria Độ nhạy xét nghiệm khoảng 70% độ chuyên biệt cao từ 98 - 99% Những kỹ thuật dò tìm phóng đại trực tiếp chuỗi ADN giúp xác định diện M.tuberculosis vài Hai xét nghiệm sử dụng rộng rãi, xét nghiệm Gen-Probe MTD (Gen-Probe, Incorporated; San Diego) xét nghiệm Amplicor M.tuberculosis (Roche Diagnosis Systems, Branchburg, NJ), có độ nhạy độ chuyên biệt cao mẫu AFB (+) giá trị tiên đốn dương tính thấp mẫu soi AFB (-) Những xét nghiệm có giá trị mẫu đàm, dịch mà khơng có giá trị phát tổn thương lao phổi PP phát kháng thể kháng nguyên VK lao máu Khi bị nhiễm lao, thể tạo đáp ứng kháng thể đáp ứng trung gian tế bào Để phát kháng nguyên VK lao kháng thể tương ứng máu, người ta dùng kỹ thuật miễn dịch đại miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch men (ELISA), 31 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 ngưng tụ hồng cầu thụ động, ngưng kết tế bào toàn bộ, điều chế kháng thể đơn dòng Hiện nay, PP khơng thực phòng thí nghiệm để chẩn đốn lao KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO Định nghĩa Kháng sinh đồ PP đánh giá khả nhạy cảm loại thuốc kháng sinh (KS) VK xác định qua môi trường cấy Về phương diện sinh học, dòng VK lao gọi kháng thuốc lao số lượng VK kháng thuốc lao đạt tỉ lệ  1%(1,4,9,11,13,15,22,25,34) Chỉ định  Những BN thất bại tái điều trị với AFB(+)  Những BN điều trị mà AFB chuyển dương  Những BN mà AFB khơng chuyển sang âm tính sau 2-3 tháng điều trị  Những BN sau 4-6 tháng điều trị mà kết cấy (+)  Số lượng VK lao tăng qua nhuộm soi acid nhanh trực tiếp sau bệnh khởi phát  Những BN nghi ngờ mắc lao kháng thuốc vùng có tần suất lao kháng thuốc cao  BN phạm nhân bị tù  Bị nhiễm từ BN lao đa kháng thuốc Các phương pháp thực KS đồ kháng thuốc lao PP dựa vào kiểu hình qui ước Các PP xác định VK lao kháng thuốc dựa vào kiểu hình qui ước: PP tỉ lệ, PP tỉ số đề kháng, PP nồng độ tuyệt đối PP tỉ lệ Cho phép xác định xác tỉ lệ đột biến kháng thuốc VK loại thuốc KS Nồng độ thuốc KS sử dụng PP tỉ lệ (µg/ml) trình bày bảng Mẫu thử chứa VK phân lập pha loãng 100 lần để dễ dàng đếm số lượng khúm VK mọc cho vào môi trường có thuốc KS ống chứng (khơng có thuốc KS) Nuôi cấy môi trường Lowenstein-Jensen, ủ nhiệt độ 370C đọc kết sau 28 42 ngày Nuôi cấy môi trường Middlebrook 7H10/11 cho kết sau 21 ngày chí sớm Kết dựa vào tỉ lệ phần trăm khúm VK mọc mơi trường có KS (R) so với mơi trường không chứa KS PP thiết lập để phát kháng thuốc mức 1% trở lên  Những BN nhiễm HIV sống Số khuẩn lạc mọc ống có KS R = 100% x Trung bình cộng số khuẩn lạc mọc ống chứng Xác định kháng thuốc tỉ lệ VK lao kháng thuốc có R > 1% INH, RIF, PAS 10% thuốc khác Bảng 5: Nồng độ thuốc KS sử dụng PP tỉ lệ (µg/ml) Thuốc kháng lao INH RIF EMB SM PZA PAS 32 LowensteinJensen 0,2 40,0 2,0 4,0 100 0,5 7H10 7H11 agar agar 0,2 – 1,0 0,2 – 1,0 1,0 1,0 5,0 7,5 2,0 2,0 – 10,0 2,0 8,0 Kanamycin Ethionamide Ofloxacin Capreomycin Cycloserine 20,0 20,0 2,0 20,0 40,0 5,0 5,0 2,0 10,0 - 6,0 10,0 2,0 10,0 - PP tỉ số đề kháng Là tỉ số MIC chủng VK phân lập (mẫu thử) chủng tham khảo nhạy cảm H37Rv (dòng chuẩn phòng xét nghiệm) thời điểm Sử dụng ống tương đương có chứa thuốc KS pha loãng gấp lần ủ với chủng VK phân lập chủng tham khảo phòng xét Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 nghiệm H37Rv 370C Đọc kết sau tuần Ống có  20 khúm VK coi dương tính MIC định nghĩa nồng độ thuốc tối thiểu có < 20 khúm VK mọc Mẫu thử có tỉ số đề kháng  coi nhạy cảm, kháng thuốc tỉ số đề kháng  PP nồng độ tuyệt đối Tính đề kháng chủng VK biểu dựa vào MIC toàn gần toàn thuốc phát triển VK Nồng độ thuốc KS tương tự PP tỉ lệ nồng độ thuốc KS cần thiết xác định tùy theo phòng xét nghiệm Đọc kết sau tuần sau - tuần Xác định kết dựa vào phát triển VK môi trường có thuốc KS pha lỗng hai lần mơi trường khơng có thuốc KS (nhóm chứng) Chủng VK coi nhạy cảm số khúm môi trường có thuốc KS < 20 mơi trường khơng có thuốc KS (+++) (++++) Kết PP nồng độ tuyệt đối xác định sau: Bảng 6: Kết PP nồng độ tuyệt đối Môi trường nuôi cấy Mọc 20 - 50 khuẩn lạc Mọc > 50 khuẩn lạc Khuẩn lạc nhiều không mọc thành đám Mọc thành đám Kết (+) (++) (+++) (++++) PP đo xạ kế BACTEC Hệ thống BACTEC TB-460 dùng mơi trường lỏng Middlebrook 7H9 có chứa axít palmatic 14C nguồn carbon Khi VK lao phát triển sử dụng axít béo đánh dấu 14C để tạo 14CO2 phát hệ thống BACTEC biểu số mọc Tính nhạy cảm VK với thuốc KS đánh giá qua hạn chế gia tăng số mọc hàng ngày Mẫu thử chứa VK phân lập pha loãng 100 lần, ủ 370C ống có chứa KS ống chứng Kết giải thích tương tự PP tỉ lệ với tỉ lệ mọc 1% Thuận lợi lớn kỹ thuật cho kết sớm PP qui ước môi trường thạch BACTEC MGIT 960 dựa nguyên tắc tiêu thụ oxy dấu hiệu phát huỳnh quang Mẫu thử chứng ủ Chuyên Đề Nội Khoa I Tổng Quan kiểm soát thiết bị MIGT 960 Đọc kết thực máy với chương trình cài đặt để giải thích nhạy cảm hay kháng thuốc VK lao Thuận lợi lớn kỹ thuật cho kết sớm vòng 4-6 ngày so với 21 ngày PP qui ước Ngoài ra, hệ thống BACTEC sử dụng cho việc làm KS đồ Nên tiến hành làm KS đồ sau phân lập M.tuberculosis Cấy MGIT trả lời KS đồ vòng – tuần kể từ lúc tiếp nhận mẫu thử so với – tuần dùng môi trường Lowenstein-Jensen cổ điển PP dựa vào kiểu gen Các PP dựa vào kiểu gen để phát VK lao kháng thuốc hay nhạy cảm dựa khuếch đại gen vùng chốt gen phối hợp với tượng kháng thuốc biết (PCR) Sau đó, tiến hành đánh giá sản phẩm khuếch xác định tính kháng thuốc VK lao Giải mã trình tự gen Giải mã trình tự gen sản phẩm khuếch đại PCR PP xác đáng tin cậy, sử dụng rộng rãi PP dựa vào kiểu gen, để xác định tính kháng thuốc VK lao Đây chuẩn tham khảo phát đột biến gen Ngày nay, PP thực hệ thống tự động thường dùng mô tả đột biến gen rpoB đề kháng RIF đột biến gen kháng thuốc thuốc lao khác Xác định tính kháng thuốc VK lao mơ tả kỹ thuật giải mã đoạn gen ngắn để tìm điểm đột biến điểm đa hình Kỹ thuật dựa việc định lượng pyrophosphate phóng thích theo sau gắn kết nucleotid vào chuỗi ADN Kỹ thuật lai phân tử phase đặc (Solid-phase hybridization technique) Phát nhanh kháng thuốc VK lao, gồm kỹ thuật: (1) Line Probe Assay để phát kháng RIF (INNO-LiPA Rif TB Assay); (2) GenoType MTBDR Assay phát đồng thời kháng INH RIF 33 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Kỹ thuật PCR thời gian thực (Real-time PCR) Sản phẩm PCR theo dõi sau chu kỳ khuếch đại cách gắn sản phẩm khuếch đại với chất phát huỳnh quang: gồm (1) Chất màu gắn không đặc hiệu vào chuỗi đơi ADN; (2) Đầu dò đặc hiệu phát huỳnh quang Ưu điểm: cho kết nhanh khoảng 1,5 - sau ly trích đoạn ADN từ mẫu thử giúp xác định nhanh đề kháng thuốc VK lao Đồng thời, kỹ thuật có nguy ngoại nhiễm thấp Hạn chế: trang thiết bị, thuốc thử đắt tiền, đòi hỏi kỹ thuật viên phải có chun mơn PP dựa vào kiểu hình PP dựa vào giai đoạn (Phage-based) Gen luciferase đom đóm đưa vào VK lao qua thể thực khuẩn Khi VK lao phát triển môi trường nuôi cấy, lượng luciferase nhân lên tương ứng Luciferase môi trường có ATP, Mg++ oxy hoạt hóa luciferine thành lucifenyl-adenosine monophosphate, cuối thành oxyluciferine Đồng thời, ánh sáng phát phát hệ thống phát ánh sáng cảm ứng Qua đó, phát có mặt VK lao mơi trường cấy, phát triển VK lao đánh giá hiệu thuốc kháng lao Sự phát sáng bị ức chế chủng VK nhạy cảm với KS Trong chủng VK lao kháng thuốc, phát sáng tiếp tục PP đo chất thị màu Được sử dụng để phát nhanh kháng thuốc VK lao PP dựa vào thay đổi chất thị màu alamar blue (là chất sử dụng) muối tetrazolium cho thêm vào môi trường cấy để phát VK lao mọc Khi VK lao phát triển, phản ứng oxy hóa khử xảy ra, chất alamar blue từ màu xanh chuyển sang màu hồng muối tetrazolium từ màu vàng thành tinh thể màu tía khơng hòa tan Chất alamar blue sử dụng để đánh giá hoạt tính INH, RIF, EMB, SM, đặc biệt dùng để phát VK lao kháng INH RIF Muối tetrazolium giúp phát nhanh 34 VK lao kháng RIF Chất Resazurin thành phần alamar blue sử dụng để phát đề kháng thuốc lao Kỹ thuật REMA (Resazurin Microtiter Assay) cho phép phát nhanh VK lao đa kháng thuốc với độ xác 97% so với PP tỉ lệ môi trường đặc REMA giúp phát đề kháng thuốc thuốc kháng lao khác như: thuốc kháng lao hàng thứ hai, Fluoroquinolones PZA PP khử Nitrate (Nitrate Reductase Assay-NRA) Là kỹ thuật đơn giản dựa vào khả khử Nitrate thành Nitrite VK lao xác định cách cho thêm chất phản ứng hóa học vào mơi trường cấy VK lao cấy mơi trường Lowenstein-Jensen có KS phản ứng khử Nitrate xác định sau 10 ngày ủ Đối với chủng VK lao kháng thuốc, VK lao phát triển phản ứng khử Nitrate xảy làm cho ống mơi trường có màu đỏ hồng, chủng VK lao nhạy cảm khơng có VK lao bị ức chế KS PP MODS Là kỹ thuật phát sớm phát triển nhanh KSĐ VK lao dựa vào việc quan sát hình thành yếu tố thừng đặc trưng VK lao môi trường lỏng với KHV đảo ngược PP cấy môi trường thạch 7H11 lớp mỏng (Thin Layer 7H11 agar method, TL7H11) Bệnh phẩm nuôi cấy môi trường thạch Middlebrook 7H11 lớp mỏng xác định khuẩn lạc mọc KHV PP TL7H11 xác định nhanh VK lao đa kháng thuốc trực tiếp từ mẫu đàm với thời gian nhận biết khoảng tuần QUI TRÌNH CẤY ĐÀM VÀ LÀM KS ĐỒ TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH(24) Mẫu đàm khử tạp khuẩn dd NAcetyl-L-Cystein (NALC) - NaOH Dd dùng khử tạp khuẩn Gồm dd dd NaOH 4% (chứa 20 gr Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Tổng Quan NaOH 500 ml nước cất Dd dd Sodium citrat dihydrate 2,9% (chứa 14,5 gr Sodium citrat dihydrate 500 ml nước cất) Dd dd NaOH-Nacitrat (chứa 500 ml dd 500 ml dd 2) Dd khử tạp khuẩn gồm dd NALC (pha dùng ngày) Mỗi mẫu đàm cần 5ml dd khử tạp khuẩn Đánh giá kết theo hướng dẫn chương trình chống lao quốc gia Cách tính lượng NALC cần dùng Lượng NALC (mg) = số ml NaOH-Nacitrat x Chẳng hạn, 10 ml NaOH-Nacitrat, lượng NALC cần dùng 50 mg; tương tự, 20 ml NaOH-Nacitrat, lượng NALC cần dùng 100 mg; 30 ml NaOH-Nacitrat, lượng NALC cần dùng 150 mg; Nguyên tắc Khi có VK lao mọc, sử dụng oxy, làm oxy ống nghiệm giảm phát huỳnh quang thông báo kết dương tính Ngưỡng để máy thơng báo kết dương tính 104 – 107 Cách tiến hành khử tạp khuẩn Cho – ml đàm vào ống ly tâm nhựa 50 ml nắp xoáy Thêm dd khử tạp tương đương với thể tích đàm, đóng chặt nắp ống ly tâm Lắc máy Votex đàm nhuyễn hóa hồn tồn (5 – 20 giây), lộn ngược ống để toàn bề mặt ống tiếp xúc với dd khử tạp khuẩn Để đứng ống 15 phút nhiệt độ phòng thí nghiệm (thỉnh thoảng lắc nhẹ) Bổ sung dd đệm vơ trùng tới vạch 30 – 40 ml Đóng chặt nắp ống ly tâm, lắc Quay ly tâm 3.000 vòng/15 phút (100 C máy ly tâm lạnh) Bỏ hết phần nước nổi, giữ lại cặn Thêm 0,5 – ml dd đệm vô trùng vào cặn, lắc đều, tạo thành huyền dịch để nuôi cấy Các dung dich đệm Có thể dùng dd sau: (1) Dd đệm phosphate bufer 0,067M pH 6,8: gồm dd A: 9,47gr Na2HPO4 1.000 ml nước cất; dd B: 9,07gr K2HPO4 1.000 ml nước cất Trộn dd A B theo tỉ lệ 1:1 chỉnh pH=5,6 cách thêm A cần tăng pH thêm B cần giảm pH Hấp 1210C /15 phút, bảo quản nhiệt độ phòng thí nghiệm tuần (2) Dd đệm NaCl 0,85% gồm 8,5 g NaCl tinh thể 1.000 ml nước cất Hòa tan, hấp 1210C/15 phút Bảo quản nhiệt độ phòng thí nghiệm tuần Chuyên Đề Nội Khoa I Nhuộm soi AFB đàm kỹ thuật Ziehl Neelsen Nuôi cấy môi trường MGIT theo dõi tự động phát triển VK lao môi trường hệ thống BACTEC MGIT 960 Thời gian đọc kết Từ – 42 ngày (nếu có kết tuần thường ngoại nhiễm nhiễm Mycobacterium khác M tuberculosis (MOTT) Ngoại nhiễm Nhiễm VK Thường xảy 24 - 48 hai ống nuôi cấy khử tạp khuẩn chưa đạt Khi nhiễm trùng rầm rộ, bề mặt môi trường nhày, ướt, chí vữa tồn mơi trường Khi nhiễm VK, mơi trường chuyển màu, chuyển hóa VK sinh acid làm pH môi trường giảm, chất thị Malachite đổi màu xanh tối, đậm độ màu xanh phụ thuộc vào lượng VK nhiễm môi trường cấy Khi nhiễm tồn ống ni cấy, M.tuberculosis khơng thể mọc điều kiện pH thấp, phải hủy bỏ ống nuôi cấy (2) Nhiễm nấm Thường xảy muộn trình ủ ấm, thường từ ngồi vào Nếu phát sớm nấm mọc rải rác phân lập chủng VK lao mọc lẫn môi trường, phát muộn thường chủng VK nấm mọc kín tồn mơi trường Nhiễm nấm sớm thường bệnh phẩm bị nhiễm nấm dụng cụ hay thao tác, nấm mọc phong phú sau vài ngày đến tuần, phải hủy ống nuôi cấy 35 Tổng Quan Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Kết dương tính có khuẩn lạc mọc kiểu thơ ráp (Rough, R) Lúc đầu tròn nhẵn, sau đó, sần sùi hoa súp lơ, màu kem Đọc kết cấy đàm tìm VK lao: Bảng 7: Đọc kết cấy đàm tìm VK lao Cấy đàm Khơng thấy khuẩn lạc - 19 khuẩn lạc 20 - 100 khuẩn lạc 100 - 200 khuẩn lạc 200 - 500 khuẩn lạc > 500 khuẩn lạc Kết (-) ghi số khuẩn lạc (+) (++) (+++) (++++) Định danh Mycobacterium sau nuôi cấy (cổ điển) Dựa vào xác định tốc độ mọc, nhiệt độ mọc, hình thái khuẩn lạc (nhìn mắt thường KHV), sinh sắc tố, tính chất sinh vật hóa học, đặc điểm hóa sinh (các test sinh hóa) Có thể nghĩ đến M tuberculosis VK mọc chậm, khơng có sắc tố, khơng sinh sắc tố ngồi ánh sáng, khuẩn lạc mọc xù xì, có khuynh hướng tạo thừng, sản sinh niacin: test niacin (+), test khử nitrat dương tính, test NAP (P Nitro-alpha-acetylamino-beta) nhạy test TCH (Thiophene-2-carboxylic acid hydrazide) kháng Thực KS đồ kháng lao Cấy bệnh phẩm vào ống môi trường (Lowenstein-Jensen) có chứa KS ống chứng (2 ống) sau định danh M tuberculosis ủ nhiệt độ 35 – 370C Thường xuyên theo dõi nhiệt độ ủ Kiểm tra tình trạng nhiễm khuẩn sau 24 – 48 Sau 72 giờ, kiểm tra bề mặt mơi trường phải khơ, xốy nắp chặt vừa phải tránh bay làm khô môi trường Đọc kết hàng tuần Theo dõi xét nghiệm vòng ngày để phát MOTT trả lời kết sau tuần Xét nghiệm KS đồ tiến hành với thuốc: INH, RIF, EMB, PZA, SM, Ofloxacin, PAS, TB1, Ethionamide, Cycloserine, Kanamycin theo phương pháp tỉ lệ với nồng độ sau: SM: µg/ml; INH: 0,2 µg/ml; RIF: 40 µg/ml; EMB: µg/ml; TB1: 10 µg/ml; Ofloxacin: µg/ml; 36 Ethionamide: 40 µg/ml; Cycloserine: 30 µg/ml; Kanamycin: 20 µg/ml; PAS: 0,5 µg/ml; PZA: 200 µg/ml (theo phương pháp Wayne) * Kết KSĐ  Nhạy cảm: có khuẩn lạc mọc ống chứng khơng có khuẩn lạc mọc ống có KS  Kháng thuốc: có khuẩn lạc mọc ống chứng ống có KS Đồng thời, có số R >10% PZA > 1% thuốc lại KẾT LUẬN Nhuộm soi AFB trực tiếp, cấy tìm VK lao thực KS đồ kháng thuốc lao xét nghiệm quan trọng chẩn đốn bệnh lao, đặc biệt tình hình lao đa kháng thuốc ngày gia tăng Ngày nay, với tiến lĩnh vực sinh học phân tử, giúp phát triển nhiều phương pháp, kỹ thuật giúp xác định VK lao gây bệnh mẫu thử có kết KS đồ nhanh, xác, dễ thực thời gian ngắn Đây u cầu cấp thiết chương trình chống lao tầm soát, phát hiện, quản lý kiểm soát tốt bệnh lao cộng đồng TÀI LIỆU THAM KHẢO Anandi M et al (2007), “Drug resistance and Drug resistance detection”, Textbook of Tuberculosis, pp 635-660 Bộ Y tế Chương trình chống lao quốc gia (2001), Phát điều trị bệnh lao (sách dịch), Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 221-235 Bộ Y tế Chương trình chống lao quốc gia (2009), Hướng dẫn quản lý bệnh lao, Nhà xuất Y học, Hà nội Butt T, Ahmad RN, Afzal RK, Mahmood A, Anwar M (2004), “Rapid detection of rifampicin susceptibility of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens by mycobacteriophage assay”, J Pak Med Asso 2004, 54(7), pp 379-382 Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I (2006), “Evaluation of the Genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates”, J Clin Microbiol 2006, 44(7), pp 2338-2342 Cirillo DM, Piana F, Frisicale L, Quaranta M, Riccabone A, Penati V, Vaccarino P, Marchiaro G (2004), “Direct rapid diagnosis of rifampicin-resistant M tuberculosis infection in clinical samples by line probe assay (INNO LiPA Rif-TB)”, New Microbiol, 27(3), pp 221-227 Crofton J (1999), “Các xét nghiệm nhuộm soi AFB, cấy tìm vi khuẩn lao”, Bệnh lao lâm sàng, Viện lao bệnh phổi Trung ương, tr.235-250 Didi B, Andersen AB, et al (2006), “Rapid Genotypic Detection Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Directly in Clinical Specimens”, J Clin Microbiol, 44(7), pp 2605-2608 Espasa M, Gonzalez-Martin J, Alcaide F, et al (2005), “Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogeneic probes”, J Antimicrob Chemother (55), pp.860-5 Fraser RS, Pare PD, Colman N, Muller NL (2005), “Mycobacteria”, Synopsis of diseases of the chest, 3rd ed., pp.249267 Hazbon MH (2004), “Recent advances in molecular methods for early diagnosis of tuberculosis and drug-resistant tuberculosis”, Biomedica, 24, pp 149-162 Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, Richter E, Niemann S (2005), “Use of the geneotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates”, J Clin Microbiol., (43), pp.3699-703 Hoàng Thị Phượng, Trần Văn Sáng, Lê Thị Kim Hoa, Phạm Thị Thái Hà (2009), “Nhận xét đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng lao phổi có vi khuẩn lao kháng đa thuốc”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học bệnh phổi toàn quốc lần thứ III-11/2009, tp.HCM, tr 265-271 Hopewell PC et al (2010), “Tuberculosis”, Murray and Nadel’s Textbook of respiratory medicine, 5th ed, pp.755-792 Kim SY, Park YJ, Song E, et al (2006), “Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis”, Diagn Microbiol Infect Dis., (54), pp.203-10 Mailaender C, Reiling N, Engelhardt H et al (2004), “The MspA porin promotes growth and increases antibiotic susceptibility of both Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis” Microbiology, 150, pp.853-64 Martin A, Portaels F, Palomino JC (2007), “Colorimetric redoxindicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis”, J Antimicrob Chemother., (59), pp.175-83 Martin A, Portaels F (2007), “Drug Resistance and Drug Resistance Detection”, Textbook of Tuberculosis, pp 635-655 Martin A, Takiff H, Vandamme P, Swings J, Palomino JC, Portaels F (2006), “A new rapid and simple colorimetric method to detect pyrazinamide risistance in Mycobacterium tuberculosis using nicotinamide”, J Antimicrob Chemother 2006, 58(2), pp 327-331 Martin A, Panaiotov S, Portaels F, Hoffner S, Palomino JC, Angeby K (2008), “The nitrate reductase assay for the rapid detection of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and metaanalysis”, J Antimicrob Chemother 2008, 62(1), pp 56-64 Martin A, Portaels F, Palomino JC (2007), “Colorimetric redoxindicator methods for the rapid detection of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis”, J Antimicrob Chemother 2007, 59(2), pp Chuyên Đề Nội Khoa I 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Tổng Quan 175-183 Pai M, Kalantri S, Pascopella L, Riley LW, Reingold AL (2005), “Bacteriophage-based assays for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a metaanalysis”, J Infect 2005, 51(3), pp 175-187 Philips JA, Rubin EJ (2008), “The microbiology, virulence, and immunology of mycobacteria”, Fishman’s pulmonary diseases and disorders, 4th ed., chapter 139, pp.2459-2465 Quy trình cấy đàm làm kháng sinh đồ Phòng xét nghiệm vi sinh học, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Tài liệu lưu hành nội Riska E, Jacobs WR, Alland D (2000); “Molecular determinants of drug resistance in tuberculosis”; Int J Tuberc Lung Dis;42, pp: S4–S10 Rusch-Gerdes S, Pfyffer GE, Casal M, Chadwick M, Siddiqi S (2006), “Multicenter laboratory validation of the BACTEC MGIT 960 technique for testing susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to classical second-line drugs and newer antimicrobials”, J Clin Microbiol., (44), pp.688-92 Sajduda A, Brzostek A., Poplawska M, et al (2004), “Molecular characterization of rifampin- and isoniazidresistant M tuberculosis strains isolated in Poland”, J Clin Microbiol., (42), pp.2425-31 Shah NS, Lan NT, Huyen MN, Laserson K., Iademarco M.F., Binkin N, Wells C, Varma JK (2009), “Validation of the lineprobe assay for rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in Vietnam”, Int J Tuberc Lung Dis 2009, 13(2), pp 247-252 Shamputa IC, Rigouts L, Portaels F (2004), “Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimens”, APMIS, (112), pp.72852 Sharma M, Sethi S, Mishra B, Sengupta C, Sharma SK (2003), “Rapid detection of mutations in rpoB gene of rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis strains by line probe assay”, Indian J Med Res 2003, 117, pp 76-80 Traore H, van Deun A, Shamputa IC, Rigouts L, Portaels F (2006), “Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis-complex DNA and Rifampin Resistance in Clinical Specimens from Tuberculosis Patients by the Line Probe Assay; a Large Scale Study”, J Clin Microbiol., (44), pp.4384-8 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 5-35 Watterson SA, Wilson SM, Yates MD, Drobniewski F.A (1998), “Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampincin resistance in Mycobacterium tuberculosis”, J Clin Microbiol 1998, 36(7), pp 1969-1673 Whitelaw AC, turm WA (2009), “Microbiological testing for Mycobacterium tuberculosis” In: Schaaf H.S and Zumla A., Tuberculosis: a comprehensive reference, 1st ed., pp.169-178 37 ... bộ, điều chế kháng thể đơn dòng Hiện nay, PP khơng thực phòng thí nghiệm để chẩn đoán lao KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO Định nghĩa Kháng sinh đồ PP đánh giá khả nhạy cảm loại thuốc kháng sinh (KS) VK... kết cấy đàm tìm VK lao: Bảng 7: Đọc kết cấy đàm tìm VK lao Cấy đàm Khơng thấy khuẩn lạc - 19 khuẩn lạc 20 - 100 khuẩn lạc 100 - 200 khuẩn lạc 200 - 500 khuẩn lạc > 500 khuẩn lạc Kết (-) ghi số khuẩn. .. nhiễm từ BN lao đa kháng thuốc Các phương pháp thực KS đồ kháng thuốc lao PP dựa vào kiểu hình qui ước Các PP xác định VK lao kháng thuốc dựa vào kiểu hình qui ước: PP tỉ lệ, PP tỉ số đề kháng, PP