Ứng dụng kỹ thuật MLPA và QF-PCR chẩn đoán các hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ

Chậm phát triển trí tuệ là một vấn đề đang được quan tâm trong giáo dục và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Các bất thường về nhiễm sắc thể là nguyên nhân chính gây ra chậm phát triển trí tuệ thể nặng. Hiện nay, kĩ thuật MLPA và QF-PCR là các kĩ thuật có nhiều ưu điểm trong chẩn đoán các dạng đột biến cấu trúc và số lượng NST. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật MLPA và QF-PCR phát hiện các hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MLPA VÀ QF-PCR CHẨN ĐOÁN CÁC HỘI CHỨNG DI TRUYỀN GÂY CHẬM PHÁT TRIỂN TRÍ TUỆ Nguyễn Thị Băng Sương*,**, Nguyễn Hữu Huy*, Lê Thị Hương Lan***, Lâm Vĩnh Niên**, Lê Minh Khơi*,**, Đỗ Văn Dũng** TĨM TẮT Mở đầu: Chậm phát triển trí tuệ vấn đề quan tâm giáo dục chăm sóc sức khỏe cộng đồng Các bất thường nhiễm sắc thể nguyên nhân gây chậm phát triển trí tuệ thể nặng Hiện nay, kĩ thuật MLPA QF-PCR kĩ thuật có nhiều ưu điểm chẩn đoán dạng đột biến cấu trúc số lượng NST Mục tiêu:Ứng dụng kỹ thuật MLPA QF-PCRphát hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Chúng tơinghiên cứu trên109 bệnh nhân chẩn đốn chậm phát triển trí tuệ Thực hiệntách chiết ADN từ mẫu máu, kiểm tra độ tinh ADN, chạy phản ứng MLPA QF-PCR Kết quả: Chúng phát bệnh nhân mắc Hội chứng Down (Trisomy 21) bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter (47,XXY) Kết MLPA phân tích cho thấy bệnh nhân có đột biến đoạn, lặp đoạn Sáu hội chứng di truyền xác định, bao gồm hội chứng Cri du chat, hội chứng Phelan-Mcdermid, hội chứng đoạn 1p36, hội chứng Wolf-Hirschhorn, hội chứng DiGeorge, hội chứng lặp đoạn 7q11.23 Phát bệnh nhân Fragile X phương pháp QF-PCR Kết luận: Chúng ứng dụng thành công kĩ thuật MLPA QF-PCR phát hội chứng di truyền gây chậm phát triển trí tuệ Cần tiếp tục nghiên cứu nhiều bệnh nhân nhằm khẳng định giá trị MLPA VÀ QF-PCR phát xác định đặc trưng trường hợp chậm phát triển trí tuệ hội chứng di truyền gặp Từ khóa: Chậm phát triển trí tuệ, MLPA, QF-PCR, hội chứng di truyền ABSTRACT APPLICATION OF MLPAAND QF-PCR METHODS FOR DETECTING GENETIC SYNDROMES ASSOCIATED WITH INTELLECTUAL DISABILITY Nguyen Thi Bang Suong, Nguyen Huu Huy, Le Thi Huong Lan, Lam Vinh Nien, Le Minh Khoi, Do Van Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 21 - No - 2017: – 16 Introduction: Intellectual Disability has gained increasing attention in the area of community education and health care Chromosomal abnormalities are thought to be the most common cause of severe intellectual disability Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) and Quantitative FluorescencePolymerase Chain Reaction (QF-PCR) has many advantages in detecting mutations in number or structure of chromosomes Objective: We studied the application of MLPA and QF-PCR methods to detect genetic syndromes ** Bệnh viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh *** Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên Tác giả liên lạc:TS BS Nguyễn thị Băng Sương ĐT: 0914007038 Email:suongnguyenmd@gmail.com Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học associated with intellectual disability Patients and Methods:109 patients with intellectual disability DNA extracted from whole blood samples was tested for purity then MLPA and QF-PCR were performed Results: We found that of 22 patients with Down syndrome (Trisomy X) and patients with Klinefelter syndrome (47,XXY) MLPA analysis revealed deletions and duplications in patients Six genetic syndromes were identified, including Cri du chat syndrome, Phelan-Mcdermid syndrome, 1p36 deletion syndrome, WolfHirschhorn syndrome, DiGeorge syndrome, 7q11.23 duplication syndrome One patient with Fragile X syndrome was identified by QF-PCR Conclusions: We have successfully applied MLPA and QF-PCR methods in detecting genetic syndromes associated with intellectual disability More investigations of larger scale need to be done to verify the value of MLPA and QF-PCR in detecting genetic syndromes associated with intellectual disability Keywords: Intellectual disability, MLPA, QF-PCR, genetic syndromes (4,7,8) Điều đáng lưu ý CPTTT nguyên ĐẶT VẤN ĐỀ nhân di truyền có nguy di truyền cho hệ Chậm phát triển trí tuệ (CPTTT, chậm phát sau Do đó, việc chẩn đốn ngun nhân di triển tâm thần, khuyết tật trí tuệ) vấn đề truyền bệnh nhân CPTTT có ý nghĩa thực quan tâm giáo dục chăm sóc tiễn nhân văn cao, sở để tư vấn sức khỏe cộng đồng tần suất CPTTT phổ chẩn đoán trước sinh cho gia đình có biến (1-3% dân số) (9) Hơn nữa, sinh bệnh học mắc bệnh Bên cạnh việc xác định yếu CPTTT chưa hiểu rõ, có khoảng tố di truyền giúp hiểu rõ chế gây bệnh từ 50% ca CPTTT xác định nguyên nhân xây dựng biện pháp dự phòng hiệu Do chế chưa hiểu rõ, phương pháp Để phát bất thường cấu trúc điều trị CPTTT hạn chế Nguyên số lượng nhiễm sắc thể sử dụng nhiều nhân CPTTT đa dạng Nhờ thành tựu y sinh học việc nghiên cứu chế phương pháp khác FISH (fluorescence bệnh sinh nhờ phát triển phương in situ hybridization), microarray, giải trình tự tiện kỹ thuật chẩn đoán, nguyên nhân hệ mới,MLPA (Multiplex ligation-dependent CPTTT phát bổ sung không probe amplification) QF-PCR (Quantitative ngừng Đặc biệt nhóm nguyên nhân di truyền Fluorescence-Polymerase Chain Reaction) bao gồm bất thường nhiễm sắc thể, đột biến Nhiều nghiên cứu MLPA QF-PCR đơn gen di truyền đa nhân tố nhóm phương pháp dễ dàng, nhanh chóng, hiệu nguyên nhân quan trọng gây chậm phát triển trí tuệ(5),(6) Các nguyên nhân di truyền gây quả, kinh tế phù hợp việc phát CPTTT kể đến rối loạn nhiễm sắc đột biến gây hội chứng di truyền bệnh thể (Hội chứng Down, Klinefelter, Turner), nhân chậm phát triên trí tuệ Xuất phát từ thực bất thường gen hội chứng nhiễm sắc thể tiễn đó, chúng tơi tiến hành đề tài với mục tiêu: X dễ gãy (Fragile X syndrome), hội chứng “Ứng dụng kỹ thuật MLPA QF-PCR phát Prader-willi, bệnh phenylketone niệu Ngoài hội chứng di truyền bệnh nhân chậm CPTTT di truyền số đột biến khác phát triển trí tuệ” hội chứng Phelan-McDermid (22q13del), hội chứng Mowat-Wilson, hội chứng Cri du chat ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU hay Wolf-Hirschhorn chiếm tỷ lệ thấp Đối tượng nghiên cứu Trong số bất thường nhiễm sắc thể chiếm 28-40% CPTTT nặng 4-10% CPTTT nhẹ - Nhóm nghiên cứu: 109 học sinh cấp Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 chẩn đốn chậm phát triển trí tuệ qua biến tính lai với 1,5 μL hỗn hợp probe thăm khám bác sĩ lâm sàng với 1,5 μL buffer MLPA Sau lai 60°C - Nhóm chứng: gồm 10 học sinh bình vòng 16 (qua đêm) Phản ứng nối: Cho thường, tiền sử gia đình khơng có mắc bệnh di enzyme ligase vào ủ 54°C (15’) Sau tăng truyền nhiệt độ lên 98°C (5’) để phá hủy ligase tiến Phương pháp nghiên cứu hành thực quy trình nhiệt phản ứng Kỹ thuật tách chiết ADN từ 200 μl máu ngoại vi Máu tươi chống đông EDTA, tách vòng 24 Quy trình tách chiết ADN từ 200μl máu ngoại vi tiến hành theo QiAgen Kit Đo nồng độ độ tinh ADN,những mẫu có giá trị tỷ lệ mật độ quang đo bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 sử dụng để tiến hành phản ứng MLPA Phản ứng QF-PCR phát lệch bội Sử dụng kit thương mại kit QF-PCR Aneufast® (molGENTIX S.L., Tây Ban Nha) chẩn đoán lệch bội NST 13, 18, 21, X, Y Thành phần phản ứng QF-PCR: 1μL DNA tách chiết, 4μL H2O 10 μL Multiplex PCR Mix Sau tăng nhiệt độ lên 95°C (15’) tiến hành thực quy trình nhiệt phản ứng PCR để khuếch đại: 95°C (40”), 60°C (90”), 72°C (40”) lặp lại 35 chu kỳ Sau kéo dài kết thúc 60oC (30’) Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 4oC Điện di phân tích kết quả: Điện di mao quản máy ABI 3500 Sử dụng phần mềm GeneMarker v1.91 (Softgenetics, State College, PA) để phân tích kết Phản ứng MLPA Sử dụng kit thương mại SALSA MLPA PCR để khuếch đại probe Khi phản ứng PCR kết thúc, giảm nhiệt độ xuống 40C Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng PCR gồm primer, polymerase, buffer, dNTP, nước Chu kỳ nhiệt: 90°C (20”), 65°C (80”), lặp lại 35 chu kỳ Sau kéo dài kết thúc 720C (20’) Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 40C Điện di phân tích kết quả: Điện di mao quản máy Beckman Coulter Sử dụng phần mềm GeneMarker v1.92 (Softgenetics, State College, PA) để phân tích kết Phản ứng QF-PCR phát Hội chứng NST X dễ gãy Kỹ thuật QF-PCR sử dụng kit thương mại AmplideXPCR/CE FMR1 củahãng Asuragen bao gồm hai phản ứng PCR thứ phản ứng PCR đặc hiệu gen sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng lặp lại CGG phản ứng thứ hai phản ứng PCRCGG RP (CGG Repeat Primed PCR) sử dụng mồi gồm cặp mồi khuếch đại vùng lặp lại CGG mồi bắt cặp với trình tự lặp lại CGG Sau thực phản ứng luân nhiệt tiến hành điện di phân tích kết quả: Điện di mao quản máy ABI 3500 Sử dụng phần mềm GeneMarker P064 Mental Retardation-1 probemix SALSA v1.91(Softgenetics, State College, PA) để phân MLPA probemix P096-B1 Mental Retardation-2 tích kết MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan Phản Lưu đồ nghiên cứu ứng lai: 100 ng genomic ADN (hòa μL) 10 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học 109 Bệnh nhân CPTTT Xét nghiệm QF-PCR cho 22 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ lệch bội Xét nghiệm MLPA cho105 bệnh nhân không phát nhân bị đột biến Xét nghiệm QF-PCR chẩn đoán Fragile X cho 98 bệnh nhân không phát đột biến Bệnh nhân bị đột biến Bệnh nhân bị đột biến Bệnh Tư vấn di truyền Tư vấn di truyền KẾT QUẢ Kết tách chiết DNA Các mẫu DNA tách chiết có độ tinh cao với tỉ số mật độ quang bước sóng 260/280nm khoảng 1,8 –2,0, nồng độ DNA từ 50 ng/μL đạt yêu cầu để thực xét nghiệm Kết QF-PCR phát lệch bội NST Sau thực phản ứng QF-PCR cho 22 trẻ CPTTT nghi ngờ lệch bội NST, phát trường hợp bất thường NST chiếm tỷ lệ 18,2% 11 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Hình 1:Kết QF-PCR bệnh nhân CPT20 Nhận xét: Marker chẩn đoán cho NST giới: marker SRY khơng có đỉnh, marker AMXY có đỉnh, marker X22, HPRT, DXYS267 có đỉnh Kết luận bệnh nhân có NST X Marker chẩn đốn cho NST 21: marker D21S1414 D21S1446 có tỉ lệ 2:1, marker D21S1442 có tỉ lệ 1:1:1 Như có marker có tỉ lệ bất 12 thường kết luận bệnh nhân có NST 21 Bảng Tổng kết lệch bội bất thường trẻ CPTTT Hội chứng Karyotype Số trẻ Hội chứng Down 47,XY,+21 47,XX,+21 (CPT47, CPT90) (CPT20) Hội chứng Klinefelter 47,XXY (CPT51) Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Nhận xét: Hội chứng Down chiếm đa số trường hợp bất thường karyotype, chiếm 3/4 trường hợp Có bệnh nhân Klinefelter: 47,XXY chiếm 1/4 trường hợp bất thường karyotype 18 bệnh nhân lại lâm sàng nghi ngờ có trisomie kết QFPCR không phát bất thường số lượng NST tiếp tục phân tích gen (phản ứng MLPA) để xác định nguyên nhân gây CPTTT Nghiên cứu Y học Kết MLPA phát đột biến vi đoạn, lặp đoạn Kết MLPA phân tích cho thấy 7/105 bệnh nhân có đột biến đoạn, lặp đoạn Sáu hội chứng di truyền xác định, bao gồm hội chứng Cri du chat, hội chứng PhelanMcdermid,hội chứng đoạn 1p36, hội chứng Wolf-Hirschhorn, hội chứng DiGeorge, hội chứng lặp đoạn 7q11.23 Hình 2: Kết MLPA bệnh nhân CPT64 kit SALSA MLPA P064 (1A) kit SALSA MLPA P096 (1B) 13 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 21 * Số * 2017 Nhận xét: Kết bệnh nhân (CPT64) có đỉnh tín hiệu tương ứng với gene CLPTM1L, IRX4, TERT kit P064 gene CLPTM1L, PDCD6, TERT kit P096 bệnh nhân nửa so với mẫu chứng (DQ ~ 0,5), chứng tỏ bệnh nhân bị đoạn dị hợp tử gene Các gene nằm nhiễm sắc thể số 5, kết luận bệnh nhân mắc hội chứng Cri du chat Bảng 2: Tổng kết hội chứng đoạn – lặp đoạn NST trẻ CPTTT Hội chứng Hội chứng Cri du chat Hội chứng Phelan-McDermid (PMS) Hội chứng đoạn 1p36 Hội chứng Wolf-hirschhorn Hội chứng DiGeorge Hội chứng lặp đoạn 7q11.23 Mất đoạn – lặp đoạn Mất đoạn NST 5p Mất đoạn NST 22q13 Mất đoạn NST 1p36 Mất đoạn NST 4p Mất đoạn lặp đoạn 22q11.21 Lặp đoạn 7q11.23 Nhận xét: Hội chứng Phelan-McDermid chiếm đa số trường hợp đoạn – lặp đoạn NST Bên cạnh đó, nghiên cứu phát trường hợp đoạn nhiễm sắc thể gặp trường hợp bệnh nhân CPT26 đoạn gene PEX10 nằm 1p36.32 gene WHSC1 nằm vị trí 4p16.3, đoạn gene gây hội chứng chậm phát triển trí tuệ khác hội chứng đoạn 1p36 hội chứng WolfHirschhorn Trường hợp thứ hai bệnh nhân Số trẻ (CPT64) (CPT10, CPT13, CPT29) (CPT26) (CPT26) (CPT92) (CPT25) CPT92 đoạn dị hợp tử gene CDC45 có lặp đoạn dị hợp tử gene SNAP29 Cả gene nằm vị trí 22q11.21 chứng tỏ bệnh nhân mắc biến thể hội chứng DiGeorge Kết QF-PCR phát lệch bội NST Chúng tơi thực phản ứng QF-PCR chẩn đốn Fragile X cho 95 bệnh nhân lại chưa xác định đột biến phát bệnh nhân CPT43 có đột biến gây bệnh Fragile X Hình Kết QF-PCR bệnh nhân CPT43 có đột biến CGG 99 lần cao nhiều so với mức bình Nhận xét: thường (