Bài viết trình bày xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Đảng sâm 3 năm tuổi trồng làm nguyên liệu tại Lâm Đồng. Mô tả và chụp hình các đặc điểm hình thái và giải phẫu. Vi phẫu của rễ Đảng sâm được nhuộm bằng phẩm nhuộm son phèn và iod lục.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM ĐẢNG SÂM (CODONOPSIS JAVANICA) NĂM TUỔI TRỒNG LÀM NGUYÊN LIỆU TẠI LÂM ĐỒNG Đỗ Văn Mãi*, Đinh Thị Đào**, Nguyễn Thị Ngọc Đan**, Dương Thị Mộng Ngọc**, Trần Cơng Luận** TĨM TẮT Mục tiêu: Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Đảng sâm năm tuổi trồng làm nguyên liệu Lâm Đồng Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm thực vật học: Mơ tả chụp hình đặc điểm hình thái giải phẫu Vi phẫu rễ Đảng sâm nhuộm phẩm nhuộm son phèn iod lục Kiểm tra độ tinh khiết: Độ ẩm, tro toàn phần, tro khơng tan HCl Định tính: Định tính hợp chất saponin phản ứng hoá học lobetyolin phương pháp sắc ký lớp mỏng Định lượng: Xác định hàm lượng chất chiết phương pháp chiết nóng với dung mơi nước hàm lượng saponin tồn phần phương pháp cân theo tiêu chuẩn DĐVN IV Kết quả: Đã đề nghị tiêu chuẩn kiểm nghiệm Đảng sâm năm tuổi trồng làm nguyên liệu Lâm Đồng Kết luận: Phương pháp phân tích Đảng tin cậy, đơn giản nên ứng dụng vào cơng tác kiểm tra đánh giá chất lượng nguyên liệu Từ khóa: Đảng sâm, Lâm Đồng, lobetyolin, saponin ABSTRACT STUDY ON THE STANDARDIZATION OF THE 3-YEAR-OLD CODONOPSIS JAVANICA ROOTS AS RAW MATERIAL IN LAM DONG Do Van Mai, Dinh Thi Dao, Nguyen Thi Ngoc Dan, Duong Thi Mong Ngoc, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 80 - 86 Objectives: The aim of the study was to develop the specifications for analyzing Codonopsis javanica as raw material in Lam Dong Research methods: Botanical characteristics: Description and photograph of morphological and anatomical characteristics The root of Codonopsis javanica was stained with carmine alum and iodine green dye Test purity: Humidity test, total ash, insoluble ash in acid Qualitative: Determination of saponins compounds by chemical reactions and lobetyolin by thin layer chromatography method Quantification: Extractable matter was determined by hot extraction with water and total saponins according to VN Pharmacopoeia IV Results: The specifications for analyzing Codonopsis javanica as raw material in Lam Dong were proposed Conclusions: The analytical method was proven to be reliable This result is able to apply for quality control of material Keywords: Codonopsis javanica, Lam Dong, lobetyolin, saponins * Trường Đại học Tây Đô TT Sâm Dược liệu TPHCM Tác giả liên lạc: PGS.TS.Trần Công Luận ĐT: 0903671323 80 Email: congluan53@gmail.com Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Nước ta có nguồn dược liệu phong phú, có kinh nghiệm sử dụng thuốc từ thiên nhiên lâu đời, có điều kiện mơi trường phù hợp cho ni trồng phát triển nhiều loại dược liệu Đây điều kiện thuận lợi để phát triển lĩnh vực sản xuất loại thuốc từ nguồn dược liệu thiên nhiên góp phần quan trọng cho nghiệp chăm sóc sức khỏe nhân dân, ngồi ngun liệu đầu vào cho ngành công nghiệp khác mỹ phẩm, chế biến thực phẩm… Đảng sâm dược liệu quý giúp tăng cường thể lực, chống nhược sức, suy nhược thể, kích thích hoạt động não bộ, suy nhược tinh thần, chống ơxy hóa, chống lão hóa, phòng chống loại ung thư, tăng sức đề kháng(4) đưa vào sách đỏ Việt Nam năm 2007 Vì nhằm phát triển nguồn dược liệu quý thực chủ trương nhà nước hình thành vùng trồng dược liệu, đồng thời góp phần đánh giá nguồn nguyên liệu Đảng sâm Việt Nam, nghiên cứu này, tiến hành xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Đảng sâm (Codonopsis javanica) năm tuổi trồng làm nguyên liệu Lâm Đồng Áp dụng phương pháp lý hóa để khảo sát độ ẩm, định tính nhóm hoạt chất chủ yếu pháp sắc ký lớp mỏng xác định diện lobetyolin Đảng sâm (Codonopsis javanica) năm tuổi trồng Lâm Đồng Từ đó, góp phần tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng Đảng sâm (Codonopsis javanica) năm tuổi trồng làm nguyên liệu Lâm Đồng ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Rễ Đảng sâm năm tuổi trồng Công ty TNHH Cao Lâm, Đà Lạt, Lâm Đồng Lobetyolin phân lập từ Rễ Đảng sâm năm tuổi Trung tâm Sâm dược liệu Tp.HCM Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Nghiên cứu Y học Phương tiện Hóa chất: Methanol (TQ); anhydric acetic (Merck); diethyl ether (TQ), cloroform (TQ); nbutanol (TQ), acid acetic (TQ) Dụng cụ: Máy siêu âm (lma, LC60H); tủ sấy; bể cách thủy; bình sắc ký; cân có độ xác 0,1 mg (Mettler Tolerdo, AB204) Phương pháp nghiên cứu Khảo sát đặc điểm thực vật học: Mô tả cấu tạo giải phẫu bột dược liệu qua kính hiển vi sau cắt ngang nhuộm kép với carmin lục iod xay dược liệu thành bột theo phương pháp thường quy(2,1) Phương pháp khảo sát độ ẩm, tro tồn phần, tro khơng tan acid(2) Khảo sát độ ẩm (mất khối lượng sấy khô) theo DĐVN IV, phụ lục 9.6, 1g, sấy 70oC đến khối lượng không đổi Lặp lại thí nghiệm lần Khảo sát tro tồn phần theo DĐVN IV, phụ lục 9.8 Lặp lại thí nghiệm lần Khảo sát tro không tan acid theo DĐVN IV, phụ lục 9.7 Lặp lại thí nghiệm lần Định tính phương pháp hóa học(2,1) Lấy g bột dược liệu (rây qua rây số 355), thêm 20 ml ethanol 70% (TT), đun cách thuỷ 15 phút Lọc lấy dịch để làm phản ứng sau: Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cạn, thêm ml nước cất, bịt miệng ống, lắc 15 giây Cột bọt bền vòng 10 phút Lấy ml dịch chiết vào ống nghiệm sạch, cô cạn, hoà tan cắn ml cloroform (TT) Thêm ml anhydric acetic băng (TT), thêm từ từ theo thành ống ml acid sulfuric (TT) Xuất vòng tím đậm lớp dung dịch thử Định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng(3) Điều kiện sắc ký: Bản mỏng nhôm Silicagel 60F254 (dày 0,25 mm, 20 x 20 cm) Merck, Germany 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Bản mỏng: Silica gel G Dung môi khai triển: n - butanol - acid acetic nước (7: 1: 0,5) Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, chiết siêu âm với methanol (20 ml x lần) 30 phút, lọc Tập trung dịch lọc, dịch lọc ml để chấm sắc ký lớp mỏng Dung dịch chuẩn: Hòa tan lobetyolin methanol để dung dịch có chứa mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 20 l dung dịch Sau triển khai sắc ký, để khơ mỏng nhiệt độ phòng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết tắt quang giá trị Rf với vết lobetyolin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol Sấy mỏng 105 oC phút, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu có giá trị Rf với vết lobetyolin chuẩn sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Tính hàm lượng saponin tồn phần (X %) theo cơng thức sau: X%= Trong đó: a khối lượng cắn saponin thu (g); d độ ẩm dược liệu (%); m khối lượng dược liệu dùng (g) Hàm lượng saponin tồn phần khơng nhỏ 3,0 % tính theo dược liệu khơ kiệt KẾT QUẢ Khảo sát đặc điểm thực vật học Chất chiết dược liệu theo DĐVN IV, phương pháp chiết nóng, dùng nước làm dung mơi Mơ tả Rễ hình trụ, mọc thẳng đất, phía có phân nhánh Đầu phát triển to, có nhiều sẹo thân cũ Rễ nạc, màu trắng ngà, có lõi gỗ, có nhựa mủ màu trắng sữa, có rãnh dọc ngang, chia rễ thành đường lồi lõm, dễ bẻ, vết bẻ không phẳng, không mịn, màu vàng nâu nhạt, mùi thơm, vị nhẹ Đường kính 2,5 – 2,8 cm, chiều dài 13,4 -14 cm khối lượng 25, – 25, g Định lượng(2) Đặc điểm vi phẫu Cân xác khoảng g bột dược liệu (đã qua rây số 355), thêm 50 ml ether dầu hỏa (30 oC đến 60 oC) (TT), chiết bình Soxhlet đến hết chất béo (khoảng giờ), lấy bã bay hết ether Chiết tiếp 50 ml cloroform (TT) giờ, lấy bã bay hết cloroform Chiết tiếp 50 ml methanol (TT) Lấy dịch chiết methanol cất thu hồi dung môi áp suất giảm cắn, thêm 30 ml nước cất để hòa tan cắn Lắc dung dịch với n-butanol bão hòa nước lớp nbutanol khơng có màu Gộp dịch n-butanol, rửa lần nước cất Lấy dịch butanol cất thu hồi n-butanol cắn Hòa tan cắn ml ethanol 80 % (TT) chuyển vào cốc xác định khối lượng trước Bốc cách thủy cắn Sấy khô cắn 1050C, Cân cắn Thân 82 Hình Vi phẫu thân Đảng sâm Việt Nam tuổi Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Thân có tiết diện hình bầu dục Cấu tạo vi phẫu thân từ vào ta thấy lớp biểu bì nằm ngồi gồm lớp tế bào hình chữ nhật có lớp cutin Kế đến gồm 2-3 lớp mô dày phiến, mô mềm vỏ gồm 1-2 lớp có vách mỏng nhăn nheo, đai Caspary Có nhiều nhựa mủ Libe libe xếp không rõ ràng Gỗ phát triển đẩy libe đẩy gỗ vào Gỗ phân hóa li tâm Mơ mềm tủy có nhiều hình dạng khơng Ở thân có khuyết rộng Lá Nghiên cứu Y học cấu tạo tế bào nhỏ hơn, có nhiều lơng nhám Dưới lớp biểu bì có lớp mơ giậu chứa nhiều lục lạp, mô giậu mô mềm khuyết Rễ Vi phẫu cắt ngang rễ hình tròn, từ ngồi vào gồm có: Bần gồm nhiều lớp tế bào có vách dày màu nâu hình chữ nhật tẩm suberin Lục bì gồm 1-3 lớp tế bào màng mỏng cấu tạo cellulose Mô mềm vỏ phát triển gồm tế bào vách mỏng hình đa giác, xếp lộn xộn Thỉnh thoảng có khe nứt Ống nhựa mủ có tiết diện nhỏ, nằm rải rác vùng libe vùng mơ mềm vỏ Tế bào libe nhỏ xếp xít Libe vừa đồng tâm xuyên tâm Tầng phát sinh libe gỗ không liên tục Gỗ tập trung miền tủy bó gỗ xếp rải rác nằm riêng lẻ vùng tủy to nhỏ khơng Vùng mơ mềm vỏ hẹp, có nhiều khe nứt thể rõ vùng mô mềm vỏ, tầng phát sinh libe-gỗ phát triển đặc biệt gỗ nên libe gỗ khơng Tia tủy xuất loe rộng chia vùng libe gỗ thành chùy hẹp Mạch gỗ xếp thành hàng tạo thành hệ thống hình nan quạt tỏa từ tâm Hình Vi phẫu Đảng sâm Việt Nam tuổi Cấu tạo gân chính: Gân mặt lồi, lồi Ngồi lớp biểu bì biểu bì cấu tạo lớp tế bào hình chữ nhật đứng Biểu bì có lơng che chở to Dưới biểu bì có 1-2 lớp mơ dày góc làm nhiệm vụ nâng đỡ Mơ mềm gồm tế bào hình đa giác, kích thước khơng Bó libe gỗ xếp gần hình lưỡi liềm Bó gỗ nằm sát kề nhau, phân cách tế bào mô mềm Libe nằm gỗ tạo thành hình vòng cung Cấu tạo phiến lá: Phía ngồi biểu bì biểu bì Biểu bì cấu tạo tế bào hình chữ nhật to nằm Biểu bì Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Hình Vi phẫu rễ Đảng sâm Việt Nam tuổi 83 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Soi bột - Bột rễ Đảng sâm Việt Nam có màu vàng nâu, mùi thơm, vị nhẹ - Quan sát kính hiển vi thấy: Mảnh bần gồm tế bào hình đa giác vách dày, mảnh mơ mềm gồm hình đa giác vách mỏng, khối inulin hình quạt, mảnh mạch mạng, tinh thể calci oxalat, khối nhựa màu, hạt tinh bột đơn lẻ có rốn phân nhánh, mảnh mạch điểm tế bào mô cứng riêng lẻ màu vàng nhạt thành dày Mảnh bần Mảnh mô mềm Khối inulin Mạch mạng Khối nhựa màu Calci oxalat Hạt tinh bột Tế bào mơ cứng Mảnh mạch điểm Hình Các cấu tử có bột rễ Đảng sâm Việt Nam cấu tử DĐVN IV chưa đề cập đến - Nhận xét: Bột rễ Đảng sâm Việt Nam trồng mảnh bần, mạch mạng, khối nhựa màu tế bào hoang dại có cấu tử tương tự mơ cứng có đầy đủ cấu tử theo DĐVN IV chuyên luận Đảng sâm Việt Nam(2) Tuy nhiên số Độ ẩm, tro tồn phần, tro khơng tan HCl Bảng Độ ẩm, độ đồng khối lượng chế phẩm Chỉ tiêu Độ ẩm (%) Tro tồn phần (%) Tro khơng tan HCl (%) Số lần lặp lại thí nghiệm 3 Trung bình 6,24 ± 0,26 3,44 ± 0,15 0,05 ± 0,01 Yêu cầu DĐVN IV ≤ 15 ≤6 ≤ 2,5 Định tính phản ứng hóa học Bảng Định tính phản ứng hóa học STT 84 Yêu cầu Cột bọt bền vòng 10 phút Xuất vòng tím đậm lớp dung dịch thử Kết + + Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Định tính sắc ký lớp mỏng n - butanol - acid acetic - nước (7: 1: 0,5) Lobetyolin Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm Kết luận: Qua kỹ thuật phân tích sắc ký lớp mỏng chứng minh Đảng sâm có diện lobetyolin Định lượng Bảng Hàm lượng chất bột rễ Đảng sâm Việt Nam Chỉ tiêu 2 Dịch chiết Đảng sâm Phun dung dịch acid sulfuric 10 % ethanol Số lần lặp lại Trung bình u cầu thí nghiệm DĐVN IV Hàm lượng chất chiết 66,14± 1,73 ≥ 2,5 (%) Hàm lượng saponin 8,93 ± 0,69 ≥3 toàn phần (%) o (TT) Sấy mỏng 105 C phút Nhận xét: Hàm lượng chất chiết theo DĐVN IV khơng 2,5 % Trong Đảng sâm Bắc (Codonopsis pisula) DĐVN IV quy định không 55,0% dược liệu chuẩn Hồng Kông quy định không 41,0% theo phương pháp chiết nguội dùng nước làm dung mơi(3) Vì cần xem lại quy định DĐVN IV phần TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM ĐỀ NGHỊ ĐẢNG SÂM NĂM TUỔI Các tiêu chí Mơ tả u cầu Rễ nạc hình trụ có phân nhánh, đường kính 0,5-2 cm, dài 6-15 cm Đầu phát triển to, có nhiều sẹo thân Mặt ngồi màu vàng nâu nhạt, có rãnh dọc ngang, chia rễ thành đường lồi lõm, thể chất chắc, dễ bẻ, vết bẻ không phẳng, không mịn Mùi thơm, vị nhẹ Vi phẫu Lớp bần gồm - hàng tế bào hình chữ nhật xếp đặn thành hàng đồng tâm dãy xuyên tâm, có nhiều chỗ bị nứt rách Mô mềm vỏ cấu tạo tế bào nhiều cạnh, dài dẹt Tế bào libe nhỏ xếp xít Mạch gỗ xếp thành hàng tạo thành hệ thống hình nan quạt toả từ tâm Tia ruột có tế bào thành mỏng Soi bột Màu vàng nâu, mùi thơm, vị nhẹ Mảnh mô mềm, khối inulin có nhiều hình dạng, hạt tinh bột đơn lẻ có rốn phân nhánh, mảnh mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình khối Mất khối lượng sấy khơ Khơng q 15% Tro tồn phần Khơng q 6% Tro khơng tan acid Khơng q 2% Định tính Lấy g bột dược liệu (rây qua rây số 355), thêm 20 ml ethanol 70% (TT), đun cách thuỷ 15 phút Lọc lấy dịch để làm phản ứng sau: Phương pháp hóa học Cho ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cạn, them ml nước cất, bịt miệng ống, lắc 15 giây Cột bọt bền vòng 10 phút Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 85 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Các tiêu chí Yêu cầu Lấy ml dịch chiết vào ống nghiệm sạch, cạn, hồ tan cắn ml cloroform (TT) Thêm ml anhydric acetic băng (TT), thêm từ từ theo thành ống ml acid sulfuric (TT) Xuất vòng tím đậm lớp dung dịch thử Sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel G Dung môi khai triển: n - butanol - acid acetic - nước (7: 1: 0,5) Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, chiết siêu âm với methanol (20 ml x lần) 30 phút, lọc Tập trung dịch lọc, dịch lọc 2ml để chấm sắc ký lớp mỏng Dung dịch chuẩn: Hòa tan lobetyolin methanol (TT) để dung dịch có chứa mg/ml Dung dịch thử: Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 20 l dung dịch Sau triển khai sắc ký, để khô mỏng nhiệt độ phòng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết tắt quang giá trị Rf với vết lobetyolin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Phun dung dịch acid sulfuric 10 % o ethanol (TT) Sấy mỏng 105 C phút, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết màu có giá trị Rf với vết lobetyolin chuẩn sắc ký đồ dung dịch đối chiếu Chất chiết dược Khơng 55% liệu 10 Hàm lượng saponin tồn Khơng nhỏ 3,0 % phần Lời cám ơn: Tập thể thực chân thành cám ơn tài trợ Sở KHCN tỉnh Lâm Đồng cho đề tài TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 Bộ môn dược liệu Trường Đại học Y dược TP HCM (2006) Giáo trình “Phương pháp nghiên cứu dược liệu Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất bản, tr 752754 Deparment of Health, Hong Kong special administrative region, The people's republic of China (2013), Hong Kong chinese materia medica standards, 2, pp 138 Viện dược liệu (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc, tập 1” Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, tr.739-743 Ngày nhận báo: 27/02/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 15/05/2015 Ngày báo đăng: 08/09/2015 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền ... lobetyolin Đảng sâm (Codonopsis javanica) năm tuổi trồng Lâm Đồng Từ đó, góp phần tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng Đảng sâm (Codonopsis javanica) năm tuổi trồng làm nguyên liệu Lâm Đồng ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU... liệu Đảng sâm Việt Nam, nghiên cứu này, tiến hành xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Đảng sâm (Codonopsis javanica) năm tuổi trồng làm nguyên liệu Lâm Đồng Áp dụng phương pháp lý hóa để khảo sát độ... ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Rễ Đảng sâm năm tuổi trồng Công ty TNHH Cao Lâm, Đà Lạt, Lâm Đồng Lobetyolin phân lập từ Rễ Đảng sâm năm tuổi Trung tâm Sâm dược liệu Tp.HCM Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền