Bài viết trình bày ứng dụng kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (kỹ thuật NAT) trong sàng lọc HBV, HCV và HIV ở người hiến máu tại Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI ACID NUCLEIC (KT NAT) TRONG SÀNG LỌC MÁU ĐỂ PHÁT HIỆN HBV, HCV VÀ HIV Hồng Thị Tuệ Ngọc*, Nguyễn Tấn Bỉnh** TĨM TẮT Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (kỹ thuật NAT) sàng lọc HBV, HCV HIV người hiến máu Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Phương pháp: 168619 mẫu máu hiến âm tính với sàng lọc huyết sàng lọc HBV, HCV HIV kỹ thuật NAT theo chế độ pool-6 Các xét nghiệm thực hệ thống Cobas s 201 (Roche) với thuốc thử chứng Cobas Taqscreen MPX version 2.0 theo nguyên tắc real-time PCR, phát đồng thời nhiễm HBV, HCV HIV mẫu thử Trong trường hợp mẫu pool-6 dương tính, xét nghiệm mẫu đơn thực Kết quả: Sàng lọc kỹ thuật NAT phát 182/169619 mẫu dương tính với HBV (chiếm 0,108%), 2/168619 mẫu dương tính với HCV (chiếm 0,001%) 4/168619 mẫu dương tính với HIV (chiếm 0,002%) Kết luận: Kết nghiên cứu cho thấy kỹ thuật NAT sàng lọc HBV, HCV HIV Ngân Hàng Máu, Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học góp phần cung cấp sản phẩm máu an toàn hơn, đóng góp vào cơng tác đảm bảo an tồn truyền máu Từ khóa: kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (kỹ thuật NAT), sàng lọc máu hiến, phát HBV, HCV, HIV ABSTRACT APPLICATION OF THE NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGY ASSAYS (NAT) FOR SCREENING HBV, HCV, AND HIV INFECTIONS Hoang Thi Tue Ngoc, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 414 - 419 Objective: To apply the nucleic acid amplification technology assays (NAT) for screening HBV, HCV, and HIV infections in blood donors at the Blood Transfusion Hematology Hospital Methods: A total of 168,619 samples with seronegative results was screened for HBV, HCV, and HIV infections by NAT in minipool of donations The samples were tested by the Cobas s 201 system (Roche), using Cobas Taqscreen MPX version 2.0 for simultaneous detection of HBV, HCV, and HIV In case of the positive minipool-6, these samples were individually tested Results: Of the 168,619 seronegative samples tested, there were 182 NAT yield cases (0.108%) with HBV; NAT yield cases with HCV (0.001%); and NAT yield cases with HCV (0.002%) Conclusion: Our study indicated that the application of the NAT for screening HBV, HCV, and HIV infections in blood donors at the Blood Transfusion Hematology Hospital distributes to providing the safety blood products Key words: nucleic acid amplification technology assays (NAT), screening donated blood, HBV, HCV, HIV detections * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học ** Sở Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS BS Hoàng Thị Tuệ Ngọc ĐT:0906480935 Email: ngochtt@yahoo.com 414 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 ĐẶT VẤN ĐỀ An toàn truyền máu – nội dung xuyên suốt chiến lược truyền máu quốc gia – kết việc kết hợp nhiều tiến trình: xây dựng sách quốc gia, thiết lập hệ thống quản lý chất lượng, chọn người cho máu tình nguyện, xây dựng quy trình xét nghiệm hiệu sử dụng hợp lý chế phẩm máu Trong tiến trình trên, sàng lọc tác nhân lây truyền qua đường máu xem mục tiêu quan trọng Kỹ thuật NAT (nucleic acid amplification testing), kỹ thuật sinh học phân tử nhiều nước giới áp dụng sàng lọc máu, góp phần giúp giảm nguy lây nhiễm qua đường truyền máu cho người nhận Kỹ thuật sử dụng nước phát triển vào cuối thập niên 1990 đầu năm 2000 Gần đây, có khoảng 33 quốc gia giới sử dụng kỹ thuật NAT cho phát HIV khoảng 27 quốc gia sử dụng kỹ thuật cho phát HBV Kỹ thuật NAT có độ nhạy độ đặc hiệu cao acid nucleic virus Dựa nguyên tắc khuếch đại trình tự mục tiêu acid ribonucleic hay acid deoxyribonucleic, kỹ thuật giúp phát sớm rút ngắn giai đoạn cửa sổ so với phương pháp sàng lọc khác, cho phép xác định trực tiếp HBV-DNA, HCV-RNA HIV-RNA Theo ước tính WHO, với dân số 90 triệu người, năm Việt Nam cần khoảng 450 000 lít máu (2% dân số) để đáp ứng cho nhu cầu điều trị, cấp cứu đề phòng thảm họa(12) Trong đó, Việt Nam, tỉ lệ nhiễm HIV, HBV HCV dân số chung 0,25%; 10% 6,5% (4,9,11) Ở người hiến máu, theo báo cáo từ Ngân Hàng Máu Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học năm 2014, tỉ lệ nhiễm HIV, HBV HCV 0,5%; 3,64% 0,747% Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật NAT nhằm nâng cao hiệu sàng lọc máu Bộ Y Tế quy định thơng tư số 26/2013/TT-BYT, theo “Việc thực xét Nghiên cứu Y học nghiệm sàng lọc HIV-1, HIV-2, vi rút viêm gan B vi rút viêm gan C kỹ thuật NAT sở truyền máu địa bàn thành phố Hà Nội, tỉnh Thừa Thiên - Huế, thành phố Hồ Chí Minh thành phố Cần Thơ phải thực trước ngày 01 tháng 01 năm 2015”(3) Ngân Hàng Máu thuộc Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) trung tâm lớn đầu việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến vào công tác sàng lọc máu Từ tháng 10/2013, việc lắp đặt trang thiết bị cho xét nghiệm sàng lọc NAT hoàn tất tháng 02/2014 BVTMHH trở thành đơn vị nước thực thành công kỹ thuật NAT sàng lọc HIV, HBV HCV cho đơn vị máu hiến Các kết bước đầu triển khai kỹ thuật NAT sàng lọc HBV, HCV HIV BVTMHH bao gồm công tác ngoại kiểm thử nghiệm báo cáo(5) Quy trình sàng lọc tác nhân lây nhiễm, kết hợp kỹ thuật huyết kỹ thuật NAT, thực thường quy BVTMHH cho tất mẫu máu hiến từ tháng 05/2015 Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết công tác ứng dụng kỹ thuật NAT sàng lọc HBV, HCV HIV BVTMHH ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nghiên cứu mô tả triển khai kỹ thuật mới, thực BVTMHH từ tháng 06/2015 đến tháng 03/2016 Từ 01/06/2015 đến 31 /03/2016, có 174763 mẫu máu hiến thực sàng lọc HBsAg, anti-HCV, Ag-Ab HIV, giang mai, HTLV-1, anti-HBc IgM kháng thể bất thường kỹ thuật huyết BVTMHH Các mẫu âm tính sau sàng lọc huyết thực kỹ thuật NAT hệ thống máy tự động Cobas s 201 (Roche) với thuốc thử chứng Cobas Taqscreen MPX version 2.0, theo chế độ pool-6, nhằm phát HBV, HCV HIV Trong trường hợp mẫu pool-6 dương tính, mẫu pool-6 tách để thực sàng lọc NAT mẫu đơn Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 415 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Quy trình xét nghiệm sàng lọc mẫu máu hiến BVTMHH trình bày Hình Mẫu máu hiến Sàng lọc huyết (HBsAg, anti-HCV, Ag-Ab HIV, giang mai, HTLV-1, anti-HBc IgM kháng thể bất thường) Dương tính Âm tính Loại bỏ Sàng lọc NAT Pool-6 (HBV, HCV, HIV) Dương tính Âm tính Sàng lọc NAT mẫu đơn Sử dụng (HBV, HCV, HIV) Dương tính Âm tính Loại bỏ Sử dụng Hình Quy trình sàng lọc mẫu máu hiến Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học bỏ Các mẫu âm tính với kỹ thuật huyết KẾT QUẢ sàng lọc NAT Đối với sàng lọc HBV, HCV HIV Trong thời gian nghiên cứu từ 01/06/2015 mẫu máu hiến BVTMHH, quy trình sàng lọc đến 31 /03/2016, có 174763 mẫu máu hiến huyết kết hợp với quy trình sàng lọc thực sàng lọc huyết Quy trình NAT Theo đó, mẫu máu hiến sàng lọc phát 4809/174763 mẫu máu hiến dương huyết trước Các mẫu dương tính với tính với HBV (chiếm tỷ lệ 2,752%); 868/174763 sàng lọc kỹ thuật huyết loại mẫu máu hiến dương tính với HCV (chiếm tỷ lệ 416 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 0,497%) 654/174763 mẫu dương tính với HIV (chiếm tỷ lệ 0,374%) (xem Bảng 1) Bảng Kết phát HBV, HCV, HIV xét nghiệm sàng lọc huyết 174763 mẫu máu hiến Xét nghiệm sàng lọc huyết Dương Âm Tổng tính tính cộng HBV 4809 169954 174763 HCV 868 173895 174763 HIV 654 174109 174763 Nghiên cứu Y học Bảng Kết phát HBV, HCV, HIV quy trình kết hợp xét nghiệm sàng lọc huyết sàng lọc NAT 174763 mẫu máu hiến Xét nghiệm sàng lọc huyết Dương Âm Tổng kết hợp sàng lọc NAT tính tính cộng HBV 4991 169772 174763 HCV 870 173893 174763 HIV 658 174105 174763 Theo quy trình sàng lọc kết hợp kỹ thuật huyết kỹ thuật NAT, túi máu Tổng cộng 168619 mẫu máu âm tính với xét nghiệm huyết tiến hành sàng lọc NAT Sàng lọc kỹ thuật NAT phát 182/168619 mẫu dương tính với HBV (chiếm tỷ lệ 0,108%); 2/168619 mẫu dương tính với HCV (chiếm tỷ lệ 0,001%) 4/168619 mẫu dương tính với HIV (chiếm tỷ lệ 0,002%) Kết trình bày bảng 2: dương tính hai kỹ thuật bị Bảng Kết phát HBV, HCV, HIV xét nghiệm sàng lọc NAT 168619 mẫu máu âm tính với sàng lọc huyết HCV sau sàng lọc NAT tiến hành xét Xét nghiệm sàng lọc NAT HBV HCV HIV Dương tính 182 Âm tính 168437 168617 168615 Tổng cộng 168619 168619 168619 Việc kết hợp kỹ thuật huyết kỹ thuật NAT vào quy trình sàng lọc tác loại bỏ Trong giai đoạn đầu ứng dụng kỹ thuật sàng lọc NAT, nhằm có thêm thơng tin khả phát HBV, HCV với quy trình sàng lọc hệ thống Cobas 201, 182 mẫu máu dương tính với HBV mẫu dương tính với nghiệm định lượng virus kỹ thuật realtime PCR (thuốc thử Sacace hệ thống máy CFX96-Biorad) Kết định lượng cho thấy có 16/182 mẫu dương tính HBV (chiếm tỷ lệ 8,79%) 1/2 mẫu dương tính với HCV (chiếm tỷ lệ 50%) BÀN LUẬN nhân HBV, HCV, HIV, khoảng thời Trong thời gian nghiên cứu từ 01/06/2015 gian từ tháng 06/2015 đến tháng 03/2016, đến 31 /03/2016, có 174763 mẫu máu hiến phát thêm số trường hợp dương thực sàng lọc huyết với HBV, HCV tính HBV, HCV HIV so với sử HIV Tỷ lệ phát HBV 2,752%; phát dụng kỹ thuật sàng lọc huyết (phát HCV 0,497% HIV 0,374% Tỷ lệ thêm 182 trường hợp dương tính với nhiễm HBV, HCV HIV nghiên cứu HBV, trường hợp dương tính với HCV thấp báo cáo năm 2014 Ngân Hàng trường hợp dương tính với HIV) Như vậy, Máu BVTMHH, theo người hiến máu có tỷ kết nghiên cứu cho thấy quy trình sàng lệ nhiễm HBV, HCV HIV 3,64%, lọc kết hợp phát tổng cộng 4991 0,747% 0,5% trường hợp dương tính với HBV, 870 trường Kết sàng lọc NAT cho 168619 mẫu âm hợp dương tính với HCV 658 trường hợp tính với sàng lọc huyết phát thêm dương tính với HIV số 174763 mẫu máu 182 mẫu dương tính với HBV(chiếm 0,108%), hiến (tỷ lệ dương tính với HBC, HCV HIV mẫu dương tính với HCV (chiếm 0,001%) 2,856%; 0,498% 0,376%) Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 417 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học mẫu dương tính với HIV (chiếm 0,002%) Kết NAT với mẫu máu âm tính huyết chế phù hợp với nghiên cứu bước đầu độ pool-6 có ưu điểm tiết kiệm chi phí so với triển khai kỹ thuật sàng lọc NAT BVTMHH quy trình sàng lọc NAT với tất mẫu máu năm 2015, theo tỷ lệ nhiễm HBV hiến, nhiên thời gian cho quy trình lâu mẫu máu âm tính với sàng lọc huyết hơn, đòi hỏi xếp cơng việc chặt chẽ để có 0,0996% Kết cho thấy độ nhạy cao thể đảm bảo công tác điều chế sản phẩm sàng lọc NAT phát HBV, có khả máu kịp thời cho nhu cầu sử dụng (5) phát ca nhiễm HBV với Các mẫu máu hiến cho kết dương tính nồng độ thấp, gần thấp giới hạn kỹ thuật nào, huyết hay phát xét nghiệm sàng lọc huyết NAT, loại bỏ Vì vậy, việc kết hợp Đối với nhiễm HBV, nghiên cứu 12 sàng lọc huyết sàng lọc NAT giúp 224 mẫu máu hiến Ấn Độ ghi nhận tỉ lệ túi máu BVTMHH cung cấp an toàn cao mẫu (+) HBV với sàng lọc NAT (- so với trước sàng lọc huyết ) với sàng lọc huyết Tuy nhiên tỉ lệ KẾT LUẬN (7) thấp so với nghiên cứu (0,049% so với 0,108%) Kết nghiên cứu cho thấy bên cạnh công tác sàng lọc tác nhân lây nhiễm sàng Tổng số 182 trường hợp phát HBV với lọc kháng thể bất thường, việc ứng dụng kỹ kỹ thuật NAT sàng lọc huyết thuật NAT vào quy trình sàng lọc HBV, HCV âm tính thực xét nghiệm định lượng HIV góp phần cung cấp sản phẩm máu DNA-HBV Tuy nhiên, có 16/182 mẫu cho an tồn hơn, đóng góp vào cơng tác đảm bảo an kết định lượng dương tính với HBV Kết tồn truyền máu BVTMHH tiên đốn trước thời TÀI LIỆU THAM KHẢO điểm nghiên cứu, BVTMHH sử dụng kít định lượng HVB có ngưỡng phát 300 copies/mL huyết Như vậy, trường hợp phát HBV kỹ thuật NAT nồng độ thấp có kết định lượng ngưỡng phát Tương tự cho trường hợp nhiễm HCV phát thêm kỹ thuật NAT, có trường hợp cho kết định lượng HCV-RNA dương tính (với ngưỡng phát 1000 copies/mL huyết thanh) Quy trình sàng lọc HBV, HCV HIV BVTMHH quy trình kết hợp sàng lọc huyết sàng lọc NAT, theo sàng lọc huyết thực trước Bất mẫu dương tính với sàng lọc huyết hay sàng lọc NAT loại bỏ Quy trình sàng lọc 418 Abrol P and Lal H (2005), Transfusion-Transmitted Bacterial, Viral and Protozoal Infections, Blood Transfusion in Clinical Practice, 143 – 153 American Red Cross (2014), History of Blood Transfusion, available at http://www.redcroosblood.org/learn-aboutblood/history-blood-transfusion Bộ Y Tế (2013), Thông tư số 26/2013/TT-BYT - Hướng dẫn hoạt động truyền máu José M Bengoa Hepatitis in Saigon – Vietnam, available at http://www.kfpe.ch/projects/success_stories/electronic_appen dix/bengoa.php Phan Nguyễn Thanh Vân CS (2015), Bước đầu triển khai kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (KT NAT) sàng lọc máu để phát HIV, HCV HBV bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Y Học thành phố Hồ Chí Minh, phụ tập 19, số 4, 2015trang 373 – 376 R N Makroo (2008), Multicenter evaluation of individual donor nucleic acid testing (NAT) for simultaneous detection of human immunodeficiency virus -1 & hepatitis B & C viruses in Indian blood donors, The Indian Journal of Medical Research, 127: 140-147 Strobl F (2011), NAT in blood screening around the world The Indian Journal of Medical Research The History of Blood Transfusion Medicine (2005), available at http://www.bloodbook.com/trans-history.html Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 10 11 12 Tình hình dịch HIV/AIDS năm 2013 Việt Nam, available at http://tapchiyhocduphong.vn/vi/tin-tuc/thong-baodich/2014/06/81E21059/ti-nh-hi-nh-dich-hiv-aids-nam-2013o-viet-nam/ WHO (2010), Screening Donated Blood for Transfusion – Transmissible Infections – Recommendation WHO (2013), Đây bệnh viêm gan – Biết điều – Đối đầu với – Ngày Viêm gan Thế giới, available at http://www.wpro.who.int/vietnam/mediacentre/releases/201 3/worldhepatitisday2013/vi/ WHO (2014), Blood safety and availability, Available at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs279/en/ 13 Nghiên cứu Y học Wiedemann M, KluWick S, Walter M (2007), HIV-I, HCV and HBV window reduction by the new Roche Cobos (R) Taqscreen MPX test in (sero-converting donors), J Clin Vir, 39: 282 – 287 Ngày nhận báo: 15/03/2016 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/04/2016 Ngày báo đăng: 15/04/2016 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch năm 2016 419 ... kết hợp kỹ thuật huyết kỹ thuật NAT vào quy trình sàng lọc tác loại bỏ Trong giai đoạn đầu ứng dụng kỹ thuật sàng lọc NAT, nhằm có thêm thơng tin khả phát HBV, HCV với quy trình sàng lọc hệ thống... tính hai kỹ thuật bị Bảng Kết phát HBV, HCV, HIV xét nghiệm sàng lọc NAT 168619 mẫu máu âm tính với sàng lọc huyết HCV sau sàng lọc NAT tiến hành xét Xét nghiệm sàng lọc NAT HBV HCV HIV Dương... thêm số trường hợp dương thực sàng lọc huyết với HBV, HCV tính HBV, HCV HIV so với sử HIV Tỷ lệ phát HBV 2,752%; phát dụng kỹ thuật sàng lọc huyết (phát HCV 0,497% HIV 0,374% Tỷ lệ thêm 182 trường