Bài viết trình bày ứng dụng phương pháp PCR để xác định các gien TLH và TDH của các chủng V.Parahaemolyticus cho phép nhận diện các chủng mang gien gây bệnh. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung bài viết.
42 25(4): 42-46 12-2003 Tạp chí Sinh học Phát gien m hóa hemolysin bền nhiệt không bền nhiệt Vibrio parahaemolyticus phơng pháp PCR Nguyễn Hoàng Uyên, Nguyễn Chí Thuận, Nguyễn Thị Thanh Lợi, Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công nghệ sinh học Vibrio parahaemolyticus vi khuẩn gram âm khu trú môi trờng tự nhiên ven biển Vi khuẩn có khả gây thành dịch bệnh với nhiều đối tợng hải sản nuôi nh tôm, cua, hầu, , Một số chủng có khả gây bệnh ngòi [2] Phơng pháp phân loại vi sinh vật dựa theo đặc điểm sinh lý tiêu sinh hóa, dễ dàng phát V parahaemolyticus, nhng không phân biệt đợc chủng mang gien gây bệnh Kết nghiên cứu gien V parahaemolyticus đ xác định đợc gien m hóa hemolysin không bền nhiệt (tlh) m hóa protein TLH gien đặc hiệu loài [8], gien m hóa hemolysin bền nhiệt (tdh) m hóa protein TDH liên quan đến nguồn gốc gây bệnh nhiễm khuẩn, viêm loét dày ngời [1] Việc ứng dụng phơng pháp PCR để xác định gien tlh tdh chđng V parahaemolyticus cho phÐp nhËn diƯn c¸c chđng mang gien gây bệnh I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Mẫu vi khuẩn Vibrio spp đợc phân lập từ tôm sú thu đầm nuôi bị bệnh (Nam Định, Hải Phòng, Thanh Hóa) có dấu hiệu bệnh lý tôm sú rõ ràng (vỏ mềm, thân biến màu đỏ, vàng , ), có trọng lợng trung bình 10-25 g, thời gian từ tháng 6-8 năm 2001 Phơng pháp a) Phân lập vi khuẩn Vi khuẩn đợc làm giàu môi trờng lỏng pepton kiềm (APW) [10 g bactotrypton, 30g NaCl l; pH = 8,5] ë nhiệt độ 28oC 42 8-16 Phân lập Vibrio spp môi trờng TCBS Định tên dựa ®Ỉc ®iĨm sinh lý sinh hãa b»ng test thư API-20E b) Kü tht PCR ADN tỉng sè cđa vi khn đợc tách chiết làm theo Promega [6] Kiểm tra độ gel agaroza 1%, đệm TAE 1X Cặp mồi Vp tlh-1 dùng để nhân gien tlh đợc thiết kế dựa trình tự gien (tlh) V parahaemolyticus No M36437 [8]: tlh-1: 5' AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3' ; tlh-2: 5'- GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC -3' CỈp måi Vptdh-2 dùng phát gien tdh đợc thiết kế dựa tr×nh tù gien tdh cđa V parahaemolyticus No M10069 [4] : tdh1: 5’-GCT TAC AGC TTG GTA TGC C-3’; tdh2: 5’-GGA GAT AGA AGA AAC CTT CC-3’ Ph¶n øng PCR nhân gien với thể tích 25 àl theo chu tr×nh: biÕn tÝnh ADN ë 95°C phót; (50°C - 1’30; 72°C - phót; 95°C - phót) - 40 chu kú; 72°C - 10 phót, sau ®ã giữ 4C Multiplex PCR với có mặt đồng thời cặp mồi Vptlh-1 Vptdh-2, chu trình nhiệt phản ứng tơng tự nh chu trình nhiệt phản ứng nhân đơn gien tlh tdh Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agaroza 1%, đệm TAE 1X Quan sát chụp ảnh GEL-DOC II Kết thảo luận Kết phân lập phát vi khuẩn Vibrio spp Từ xoang tiêu hóa tôm bệnh, đ phân lập đợc 35 chủng vi khuẩn Vibrio spp môi 43 Bảng Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Tính chất ATCC Vp.PMI Vp.PM2 Vp.PM3 Vp.PM4 V.PM5 Vp.PM7 Vp.TSI VBT 17803 Sinh tr−ëng trªn TCBS Sinh trởng % NaCl 10 Sinh trởng nhiƯt ®é X X X X X X X X X + + + + + + + + + + + + + + + + + 4°C 28oC 42oC Nhuém gram + + + + + + + + + + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + - + + - Ghi chú: +: dơng tính, -: âm tính, X: khuẩn lạc màu xanh Bảng Kết test thử sinh hóa API 20E PhÐp thư Ph¶n øng/enzym ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RNA MEL AMY ARA Beta-galactosidase Aginine dihydrolase Lysine decarboxydase Ornithin decarboxydaza Sư dơng Citrate Sinh H2S Ureaza Trytophan deaminaza Sinh Indon Sinh acetoni Gelatinaza Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá Lên men oxy hoá ATCC Vp.P Vp.P Vp.P Vp.P V.PM Vp.P Vp.TSI VBT M7 17803 MI M2 M3 M4 + + + + + + + - + + + + + + +/- + + + + + + +/- + + + + + + +/- + + + + + + +/- + + + + + - + + + - + + + - + + + - + + + +/+ + + + +/- + 43 44 tr−êng TCBS Dựa theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa test thử API 20E (các bảng 1, 2) đ xác định đợc chủng thuộc loài V parahaemolyticus 28 chủng Vibrio spp Kết PCR xác định gien tlh tdh PCR đoạn gien tlh 450 bp với cặp mồi Vp tlh-1 cho kết dơng tính víi chđng V parahaemolyticus (ATCC17803; VpPM1; VpPM2; VpPM3; VpPM4; VpTSI; VpPM7) âm tính với tất chủng Vibrio spp khác (V alginolyticus, V harveyi, V anguillarum 28 chủng khác thuộc nhóm Vibrio spp (bảng 2, hình 1) Nh vậy, sử dụng gien tlh để phát chủng V parahaemolyticusph cho kết hoàn toàn phù hợp với sử dụng test API 20E Kết PCR gien tdh sư dơng cỈp måi Vptdh-2 víi chđng V parahaemolyticus, phát có chủng VpPM4 chủng ATCC17803 cho kết dơng tính (đờng 3; hình 2) Gien tdh chủng VpPM4 (đờng 3; hình 2) có độ dài gần1000 bp, ngắn so với gien tdh chủng chuẩn ATCC17803 (đờng 5; hình 2) Tuy gien tdh chủng VpPM4 có độ dài ngắn hơn, nhng cặp mồi Vptdh-2 gien tdh đợc thiết kế dựa trình tự gien tdh V parahaemolyticus No M10069 [ 4] sử dụng phù hợp Nghiên cứu tác giả khác {5,3} tìm đợc gien tdh với độ dài khác từ 721 bp đến 1261 bp Nh− vËy gien tdh cđa chđng VpPM4 cã ®é dài tơng tự với chủng công bố Bằng phơng pháp PCR cho phép phát phân biệt đợc chủng mang gien tdh gây bệnh mà phơng pháp phân loại vi sinh vật không xác định đợc Hình Điện di sản phẩm PCR đoạn gien tlh V parahaemolyticus Hình Điện di sản phẩm multiplexPCR đoạn gien tlh vµ gien tdh cđa V parahaemolyticus Ghi chó: 44 Multiplex PCR đoạn gien tlh gien tdh thực với chủng VpPM4 ATCC17803 cho kết dơng tính với hai gien (đờng 7; hình 2) hoàn toàn phù hợp với kết PCR riêng gien tlh gien tdh Nh sử dụng phơng pháp multiplex PCR để đồng thời phát đợc hai gien tlh tdh trªn bé genom cđa V parahaemolyticus Ghi chó: Marker ADN1kb; tlh-VpPM4; Marker ADN1kb; VpPM1; VpPM2; tdh-VpPM4; tlh + tdh VpPM4; VpPM3; VpPM7; VpPM4; VpTSI; tlh-ATCC17803; tdh-ATCC17803; ATCC17803 tlh + tdh- ATCC17803 45 B¶ng KÕt PCR xác định gien tlh tdh STT Tên chủng Ký hiệu Số lợng Gien tlh Gien tdh Multilex PCR V harveyi HW400 - - V alginolyticus HW284 - - V anguillarum HW72 - - V alginolyticus Va.TSI - - V parahaemolyticus ATCC17803 + + + V parahaemolyticus VpPM1 + + + V parahaemolyticus VpPM2 - - V parahaemolyticus VpPM3 + - V parahaemolyticus VpPM4 + - 10 V parahaemolyticus VpPM6 + - 11 V parahaemolyticus VpPM7 + - 12 V parahaemolyticus Vp.TSI + - 13 Vibrio.sp V.sp 28 Tỉng céng 40 Ghi chó: HW: Heriot-Watt University; ATCC: Americal Type Culture Collection; TSI: ViÖn nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, III Kết luận Tài liệu tham khảo Sử dụng phơng pháp PCR phát chủng V parahaemolyticus đ phân lập định tên theo phơng pháp vi sinh vật test thư API 20E ®Ịu cã gien tlh Nh− vËy chứng tỏ gien tlh đặc hiệu cho V parahaemolyticus sử dụng gien đặc hiệu thị cho PCR để phát V parahaemolyticus Với cặp mồi Vp-tdh thiết kế phù hợp cho PCR gien tdh để phát chủng có khả gây bệnh Phơng pháp multiplex PCR cho phép phát đồng thời hai gien tlh tdh, đem lại kết xác, nhanh chóng Gien tdh chủng VpPM4 phân lập từ mẫu tôm sú, có khác biệt độ dài so với gien tdh chủng ACTT 17803 cần thiết khảo sát thêm tính đa dạng gien tdh chủng khác Asim K Bej, 1999: J Microbio Methods, 36: 215-225 De Paola A., Hopkin L H., 1990: Apply Environ Microbiol., 56: 2299-2302 Honda T., 1991: J.Gen Microbiol., 137(2): 253–259 Nishibuchi M., 1985: J Bacteriol., 162: 558-564 Nishibuchi M., 1995: Infection and Immunity, 63(6): 2093-2099 Promega, 1996: Protocols and applications Guide; Third Edition; 175-176 Taniguchi H., Ohra H., 1985: J Bacteriology, 162: 510-515 Taniguchi H., 1986: Microbiol Pathogen, 1: 425-432 45 46 Detection of the Thermolabile hemolysin (tlh) and thermostable drect hemolysin (tdh) gene of Vibrio parahaemolyticus by pcr Nguyen Hoang Uyen, Nguyen Chi Thuan, Nguyen Thi Thanh Loi, Nguyen Thi Hong Hanh Summary Vibrio parahaemolyticus is a halophytic bacterium found in black tiger shrimp culture ponds and is associated with shrimp diseases All V parahaemolyticus strains carry the thermolablile hemolysin (tlh) that appears to be species specificgene The production of the thermostabile direct hemolysin (tdh) by V parahaemolyticus is associated pathogenically qith the organism and is encoded by the tdh gene The V parahaemolyticus biochemical indentication method requires 58 days and did not detect the pathogen strains The PCR and multiplex PCR methods which amplify tlh and tdh genes are used to detect various strains of V parahaemolyticus All isolated V parahaemolyticus strains are controlledby the API 20E showed and by PCR method, show the presemee of the tlh gene, however only two strains VpPM4 and ATCC17803 carry the tdh gene The multiplex PCR method is also and successfully to detect these two strains VpPM4 and ATCC17803 Ngày nhận bài: 18-6-2002 Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình nghiên cứu 46 ... công bố Bằng phơng pháp PCR cho phép phát phân biệt đợc chủng mang gien tdh gây bệnh mà phơng pháp phân loại vi sinh vật không xác định đợc Hình Điện di sản phẩm PCR đoạn gien tlh V parahaemolyticus. .. hiệu thị cho PCR để phát V parahaemolyticus Với cặp mồi Vp-tdh thiết kế phù hợp cho PCR gien tdh để phát chủng có khả gây bệnh Phơng pháp multiplex PCR cho phép phát đồng thời hai gien tlh tdh,... pháp PCR phát chủng V parahaemolyticus đ phân lập định tên theo phơng pháp vi sinh vật test thử API 20E có gien tlh Nh chứng tỏ gien tlh đặc hiệu cho V parahaemolyticus vµ cã thĨ sư dơng lµ gien