Trong khi đó, các nghiên cứu về đài thực vật (thực vật không mạch) ở Việt Nam còn khá mới mẻ. Do đó, bài báo tập trung vào các hoạt tính sinh học và khảo sát sự hiện diện của một số nhóm hợp chất thứ cấp của các cao chiết từ loài Marchantia polymorpha L. thu hái tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
26 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 5, 2018 Khảo sát số hoạt tính sinh học loài địa tiễn Marchantia polymorpha L thu hái Đà Lạt, Lâm Đồng Trần Quốc Tân, Lương Thiện Tâm, Phan Ngơ Hoang, Qch Ngơ Diễm Phương Tóm tắt— Địa tiễn Marchantia polymorpha L sử dụng y học dân gian Ấn Độ, Trung Quốc… để điều trị viêm loét, vết thương hở, lợi tiểu… Hiện nay, giới có nghiên cứu hoạt chất hoạt tính sinh học lồi địa tiễn Trong đó, nghiên cứu đài thực vật (thực vật khơng mạch) Việt Nam mẻ Do đó, báo tập trung vào hoạt tính sinh học khảo sát diện số nhóm hợp chất thứ cấp cao chiết từ loài Marchantia polymorpha L thu hái thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng Trong bốn phân đoạn (n-hexane, chloroform, ethyl acetate ethanol) cao chiết chloroform có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn ức chế tăng sinh dòng tế bào MCF-7 tốt Cao chiết ethyl acetate có khả ức chế enzyme tyrosinase α-glucosidase tốt Các nhóm hợp chất thứ cấp diện chủ yếu phenolic, steroid dẫn xuất glycoside Kết giúp làm rõ số ứng dụng điều trị dân gian tiềm loài địa tiễn Từ khóa— đài thực vật, địa tiễn, Marchantia polymorpha L., bisbenzyl, Marchantin M gan…[2] Các hoạt tính sinh học loài địa tiễn báo cáo giới gồm: kháng oxy hóa, kháng khuẩn, chống béo phì, kháng phân bào số dòng tế bào ung thư, thư giãn bắp…Các nghiên cứu loài M polymorpha L thu hái quốc gia khác thường có thành phần hóa họ c khác [1] Hiện giới, nhóm đài thực vật, đặc biệt ngành địa tiễn nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học phong phú ứng dụng giúp tìm hợp chất có giá trị sinh học từ nhóm thực vật Tuy nhiên, Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chúng Vì thế, nghiên cứu thực nhằm khảo sát sơ thành phần hóa học đánh giá số hoạt tính sinh học như: khả kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế enzyme tyrosinase, enzyme α-glucosidase, kháng phân bào loài M polymorpha L thu hái thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng GIỚI THIỆU archantia polymorpha L (viết gọn M polymorpha L.) lồi địa tiễn điển hình thuộc ngành Rêu tản (Marchantiophyta), ba ngành lớn nhóm đài thực vật (thực vật không mạch) [3] Cũng hầu hết lồi nhóm đài thực vật, M polymorpha L mọc phổ biến vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa, ẩm ướt cường độ ánh sáng thấp [16] Từ lâu, chúng sử dụng dân gian nước Ấn Độ, Trung Quốc, dùng điều trị trường hợp viêm, vết thương hở, vết cắn côn trùng, rắn độc, lợi tiểu số chứng bệnh Ngày nhận thảo 24-11-2017, ngày chấp nhận đăng 1701-2018, ngày đăng 20-11-2018 Trần Quốc Tân, Lương Thiện Tâm, Phan Ngô Hoang, Quách Ngô Diễm Phương – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM *Email: qndphuong@hcmus.edu.vn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Mẫu địa tiễn M polymorpha L thu hái vùng ven Nam Thiên, phường 4, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (Hình 1) Mẫu địa tiễn phân loại dựa hệ thống Crandall -Stotler cộng [3], [4] Hình A: Địa tiễn Marchantia polymorpha L với thể giao tử đực (hình dù) giao tử (hình sao) đan xen B: Các tản M polymorpha L với nhiều chén truyền thể TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 5, 2018 Các chủng vi khuẩn: Acetobacterium sp., Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi Bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh học-Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM cung cấp Điều chế cao chiết phân đoạn Phương pháp điều chế cao phân đoạn thực theo kỹ thuật chiết ngâm dầm (maceration) [18], 2, [12] Mẫu sau thu hái tách khỏi loại đài thực vật khác rửa đất cát vòi nước máy nhiều lần Tiếp theo, phơi khô mẫu nhiệt độ 45oC đến khối lượng không đổi xay nhuyễn tạo bột khô Bột ngâm dung mơi có tính phân cực tăng dần: nhexane, chloroform, ethyl acetate ethanol Dịch chiết lọc sau 48 giờ, tiếp tục ngâm thêm nhiều lần đến chiết kiệt Dịch chiết phân đoạn gộp chung cô quay áp suất thấp để thu cao chiết Khảo sát khả kháng oxy hóa Đánh giá lực khử sắt phân đoạn [13] Hút mL dung dịch chất thử nghiệm vào ống nghiệm, tiếp tục bổ sung 2,5 mL dung dịch đệm phosphate 0,2 M pH 6,6 lắc Bổ sung thêm 2,5 mL dung dịch K3[Fe(CN)6] 1% cho vào hỗn hợp Phản ứng ổn định 50 oC, 20 phút Sau làm nguội, hút 2,5 mL trichloroacetic acid 1% cho vào ống nghiệm Ly tâm dung dịch điều kiện 7000 vòng/phút phút, thu dịch Hút mL dịch vào ống nghiệm riêng biệt, thêm mL nước cất, 0,5 mL dung dịch FeCl3 1% Lắc hỗn hợp vòng phút Ghi nhận kết độ hấp thu bước sóng 700 nm Vitamin C (0,5 mg/mL) làm chứng dương, cao chiết phân đoạn hòa tan đệm DMSO (dimethyl sulfoxide) 10% để đạt nồng độ ban đầu mg/mL Khảo sát khả trung hòa gốc tự DPPH [10] Cao chiết phân đoạn hòa tan ethanol 10% DMSO tạo thành dãy nồng độ chất thử nghiệm khác Hút 0,5 mL chất thử nghiệm vào ống nghiệm riêng lẻ Thêm vào ống mL ethanol tuyệt đối Thêm vào 0,5 mL dung dịch DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 0,6 mM pha ethanol tuyệt đối Lắc hỗn hợp, ủ tối 30 phút nhiệt độ phòng Sau đó, dung dịch đo độ hấp thu (OD -optical density) bước sóng 517 nm Chứng âm ethanol 10% DMSO Mẫu có độ hấp thu bước sóng 517 27 nm cao khả trung hòa thấp ngược lại Phần trăm trung hòa gốc tự DPPH tính theo cơng thức: % EC (Efficiency concentration) = (1- OD mẫu/OD chứng âm) x 100 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn đánh giá thơng qua phương pháp khuếch tán giếng thạch [9] Vi khuẩn hoạt hố ni cấy mơi trường LB (Luria-Bertani broth) đạt OD 625 nm ≥ 0,5 Dịch vi khuẩn điều chỉnh cho độ hấp thu OD bước sóng 625 nm khoảng 0,1 đến 0,15, trải 100 µL dịch vi khuẩn lên đĩa mơi trường LB rắn Đục giếng thạch có đường kính mm đặt 50 µL dung dịch chất thử nghiệm vào giếng Chứng dương kanamycine có nồng độ 30 µg/giếng, cao phân đoạn mg/giếng chứng âm nước cất chứa 10% DMSO Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Thí nghiệm tiến hành dựa theo phương pháp Nguyễn Thị Mỹ Hạnh cộng năm 2017 [5] 70 µL dung dịch cao chiết pha đệm potassium phosphate 50 mM (pH 6,8), DMSO 5% nạp vào dĩa 96 giếng, 30 µL dung dịch enzyme tyrosinase (124,61 U/mL) Hỗn hợp ổn định nhiệt độ phòng 15 phút Sau đó, bổ sung 110 µL chất L-tyrosine (2 mM) Tiếp tục ủ nhiệt độ phòng 15 phút Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 490 nm Mẫu blank mẫu khơng chứa enzyme mẫu chứng âm mẫu không chứa cao chiết Phần trăm ức chế tính theo cơng thức: % IC (Inhibition concentration) = [1- (OD mẫu OD blank mẫu)/(OD chứng âm – OD blank âm)] x 100 (**) Cao chiết phân đoạn chuẩn bị nồng độ mg/mL chứng dương kojic acid 200 µg/mL Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase Hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase tiến hành dựa phương pháp Hogan cộng (2010) [7] 50 µL dung dịch cao chiết pha đệm sodium phosphate 100mM, (pH 6,8), DMSO % nạp lên dĩa 96 giếng, 40 µL dung dịch enzyme α -glucosidase 0,2 U/mL, hỗn hợp ủ nhiệt độ phòng 20 phút Tiếp tục bổ sung 40 µL chất p-NPG (p-nitrophenyl glucopyranoside) 5mM, ủ 20 phút nhiệt độ phòng Cuối 130 µL dung dịch Na 2CO3 0,2 M đặt vào giếng để dừng phản ứng Tiến 28 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 5, 2018 hành đo độ hấp thu 405 nm Mẫu blank mẫu không chứa enzyme, mẫu chứng âm mẫu không chứa cao chiết Phần trăm ức chế tính theo cơng thức (**) Cao chiết phân đoạn so sánh khả ức chế enzyme α-glucosidase nồng độ mg/mL Mẫu chứng dương acarbose nồng độ 10 mg/mL Khảo sát hoạt tính kháng phân bào dòng tế bào MCF-7 Thử nghiệm kháng phân bào thực phương pháp sulforhodamine B (SRB) [11] Tế bào ung thư vú MCF-7 sau 24 nuôi cấy trải lên dĩa 96 giếng để đạt mật độ 10 tế bào/100 µL/giếng Cảm ứng mẫu thử nghiệm nồng độ 100 µg/mL, song song với mẫu chứng âm DMSO 0,25% chứng dương camptothecin 0,05 µg/mL Sau 48 cảm ứng với chất thử nghiệm, tế bào rửa cố định trichloroacetic acid 50% Tiến hành nhuộm sulforhodarmine B (SRB) 0,2 % 20 phút, rửa nhuộm acetic acid 1% hòa tan SRB Tris 10 mM Ghi nhận giá trị OD 492 nm 620 nm Tỷ lệ ức chế phân bào tính theo cơng thức: % IC = [1- (OD mẫu/OD chứng âm)] x 100 Trong đó, giá trị OD mẫu chứng âm tính bằng: (OD 492 nm – OD 620 nm) mẫu – (OD 492 nm – OD 620 nm) blank mẫu Mẫu đánh giá có hoạt tính gây độc tế bào có tỷ lệ ức chế phân bào ≥ 60 % nồng độ 100 µg/mL Định tính diện số nhóm chất thứ cấp có cao chiết Tiến hành thí nghiệm định tính nhằm nhận diện nhóm hợp chất tự nhiên có phân đoạn thuốc thử: nhóm hợp chất phenol (FeCl3 5%), quinone coumarin (KOH 5%/Methanol), tannin (gelatin mặn), nhóm alkaloid (thuốc thử Wagner), flavonoid (H 2SO4 đậm đặc, NaOH 1%/Ethanol, AlCl3 2%/Ethanol, chì acetate 10%, thử nghiệm cyanidin Wilstatter với bột magnesium kim loại bột kẽm), terpenoid-steroid (Roseinhem Salkowski), saponin (phản ứng tạo bọt dung dịch HCl 0,1N, NaOH 0,1N), dẫn xuất glycoside (thuốc thử Molisch) hợp chất lactone vòng (thuốc thử Baljet) [12] Thí nghiệm tiến hành song song mẫu cao chiết có nồng độ mg/mL mẫu chứng âm ethanol 10% DMSO Phương pháp phân tích xử lý số liệu Các số liệu xử lý phần mềm SAS 9.1.3 Service Pack dành cho hệ điều hành Window, đồ thị vẽ phần mềm Microsoft Excel 2010 Các thí nghiệm lặp lại ba lần số liệu trình bày dạng: trung bình ± độ lệch chuẩn Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức P (p-value) < 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu hái định danh Mẫu địa tiễn sau thu hái định danh dựa khóa phân loại Crandall Stotler-cộng sự, cụ thể sau: Marchantia polymorpha L Giới: Plantae Ngành: Marchantiophyta (Stotler & Crand Stotl.) Lớp: Marchantiopsida (Cronquist, Takht & W Zimm.) Bộ: Marchantiales (Limpr.) Họ: Marchantiaceae (Lindl.) Chi: Marchantia L Loài: Marchantia polymorpha L Tên tiếng Việt: địa tiễn, địa tiền Tên tiếng Anh: umbrella liverwort, marchantia liverwort Lồi địa tiễn tìm thấy vùng có khí hậu mát mẻ, ẩm ướt cường độ ánh sáng thấp [16] Theo Asakawa cộng (2013), M polymorpha L có chứa terpenoid, đặc biệt hợp chất sesqui - diterpene Ngoài số nhóm hợp chất khác gồm: flavonoid glycoside, hợp chất aromatic bis(bi)benzyl [1] Các hợp chất lưu trữ khoang chứa đặc biệt gọi thể dầu Ở Ấn Độ, Trung Quốc số nước châu Âu, thuốc dân gian, người ta sử dụng loài địa tiễn cho trường hợp bị viêm, sử dụng thuốc lợi tiểu, dùng cho bệnh gan, vết thương hở, ung nhọt, gãy xương, côn trùng rắn cắn [2] Điều chế cao chiết Các phân đoạn điều chế theo dung mơi có độ phân cực tăng dần Sau cô q uay chân không hút ẩm đến khối lượng không đổi, ethyl acetate phân đoạn cho khối lượng cao hiệu suất thu cao lớn (Bảng 1) Qua đó, đánh giá tỷ lệ nhóm hợp chất: chứa nhiều hợp chất có tính phân cực khá, tiếp đến nhóm chất có tính phân cực trung bình mạnh, cuối hợp chất có tính khơng phân cực TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 5, 2018 Bảng Hiệu suất thu cao phân đoạn thu từ M polymorpha L Khối lượng Hiệu suất thu cao so với khối Dung môi cao (g) lượng khô (330,54 g) (%) n-Hexane 0,67 0,20 Chloroform 1,66 0,50 Ethyl acetate 4,96 1,42 Ethanol 1,30 0,39 Khảo sát khả kháng oxy hóa cao phân đoạn Đánh giá lực khử sắt Kết khảo sát lực khử cho thấy loại cao chiết có khả kháng oxy hóa Tr ong đó, phân đoạn chloroform có lực khử cao (0,58 ± 0,03), theo sau ethyl acetate (0,39 ± 0,03), ethanol (0,28 ± 0,02) Phân đoạn n-hexane thể lực khử yếu bốn phân đoạn (0,08 ± 0,00) Ở nồng độ mg/ mL cao chiết khơng có trội khả khử sắt so với chứng dương vitamin C (2,38 ± 0,12) (Hình 2) Hình Biểu đồ thể lực khử cao phân đoạn vitamin C thông qua độ hấp thụ OD 700nm Khảo sát khả trung hòa gốc tự DPPH cao phân đoạn 29 Các loại cao chiết chứng dương vitamin C tiến hành xác định khả trung hòa gốc tự DPPH thơng qua EC50 (Half-maximal effficiency concentration) Tỷ lệ phần trăm trung hòa gốc tự thông qua chế làm màu dung dịch DPPH thể hiệ n qua hình 3, với vitamin C (tại dãy nồng độ 0; 7,81; 15,62; 31,25; 62,5; 125 µg/mL) cao chiết phân đoạn chloroform, ethyl acetate ethanol (tại dãy nồng độ 0; 62,5; 125; 250; 500; 1000 µg/mL) Kết Bảng cho thấy có trùng khớp với kết thí nghiệm khảo sát lực khử sắt: cao chloroform cao có EC50 thấp (358, 35 b ± 8,68 µg/mL), phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa cao ba phân đoạn lại Năng lực trung hòa gốc tự n-hexane yếu với EC 50 > 5000 µg/mL Có thể thấy hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa tập trung phân đoạn có tính phân cực trung bình mạnh, bật phân đoạn chloroform Remya Krishnan cộng (2013) tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa M polymorpha L thơng qua nhiều mơ hình khác Nhóm nghiên cứu nhận định lồi địa tiễn nguồn dược liệu tự nhiên tiềm có hoạt tính trung hòa gốc tự do, bảo vệ DNA chứa hợp chất đóng vai trò chất cho electron tự thân giúp chặn đứng chuỗi oxy hóa khử [14] Dù khả kháng oxy hóa mức trung bình khơng thể phủ nhận tiềm kháng oxy hóa lồi địa tiễn Bảng Các giá trị EC50 phân đoan cao chiết vitamin C Vitamin C n-Hexane Chloroform Ethyl acetate Ethanol EC50 (µg/mL) 17,76a ± 3,63 > 5000 358,35b ± 8,68 578,35c ± 4,66 693,82d ± 65,26 Các ký tự a, b, c, d thể khác biệt có ý nghĩa với mức P (p-value) < 0,05 Hình Phần trăm trung hòa gốc tự DPPH mẫu thử nghiệm Các ký hiệu: VTC (vitamin C), CHL (chloroform), ETA (ethyl acetate) ETH (ethanol) 30 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 5, 2018 Khảo sát khả kháng khuẩn Thí nghiệm khảo sát khả kháng khuẩn với hàm lượng cao chiết giếng thạch mg, chứng dương kanamycin 30 µg n-Hexane phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn yếu nhất, có khả kháng lại chủng Staphylococcus aureus Acetobacterium sp (Bảng 3) Ba phân đoạn lại (chloroform, ethyl acetate ethanol) có khả kháng tốt tất chủng vi khuẩn Trong đó, hai phân đoạn có tính phân cực trung bình chloroform ethyl acetate cho thấy khả kháng tốt Đường kính vòng vơ khuẩn hai loại cao chiết dao động từ khoảng đến 11 mm tương đương với đường kính chứng dương (từ khoảng đến 12 mm) Các chủng vi khuẩn gram dương dễ dàng bị tác động vo với chủng gram âm Asakawa cộng (2013) nhấn mạnh khả kháng khuẩn, kháng nấm virus HIV hợp chất thuộc nhóm bisbenzyl, đại diện marchantin A C tìm thấy nhiều lồi Marchantia MICnồng độ ức chế tối thiểu hai hợp chất loài gram dương Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus…dao động từ 2,0 µg/mL đến 50 µg/mL; loài gram âm Escherichia coli, Enterobactercloacae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium… dao động từ 25 µg/mL đến 100 µg/mL [1] Kết thu cho thấy khả ứng dụng theo hướng kháng khuẩn loài địa tiễn khả hỗ trợ loài địa tiễn điều trị cho vết thương hở mà dân gian số nước hay sử dụng Vì cần tiến hành thêm mơ hình khác để tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn tiềm Bảng Đường kính vòng kháng khuẩn loại cao chiết kanamycin chủng vi khuẩn khác Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Kanamycin n-Hexane Chloroform Ethyl acetate Ethanol E coli 11,33a ± 0,76 - 9,17bc ± 1,53 10,00b ± 1,00 8,50c ± 0,00 P aeruginosa 10,83a ± 0,76 - 6,83b ± 0,58 6,67b ± 0,29 6,33b ± 0,76 S typhi 9,17a ± 1,44 - 10,00a ± 0,00 10,17a ± 1,53 8,97a ± 0,45 a B subtilis 11,00 ± 1,50 - 11,17 ± 2,57 10,83 ± 1,26 8,00bc ± 1,73 S aureus 12,00a ± 0,00 2,33d ± 2,00 11,17ab ± 1,04 10,00a ± 1,00 9,50b ± 1,00 8,17a ± 0,29 6,50b ± 0,50 a Acetobacterium sp 9,83 ± 1,04 2,00 ± 2,00 11,33ab ± 1,12 10,33a ± 1,53 Streptococcus sp 7,116ab ± 0,763 - 8,00a ± 0,00 a b ab 8,67a ± 1,04 Chú thích: (-): khơng có khả kháng khuẩn; Đường kính vòng kháng khuẩn = Đường kính vòng vơ khuẩn - mẫu chứng âm (dung mơi hòa tan cao chiết) Kết so sánh theo hàng ngang Các số trung bình với ký tự khác có khác biệt có ý nghĩa với mức P (p-value) < 0,05 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Kết khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase phân đoạn trình bày biểu đồ Hình Với phần trăm ức chế nhỏ 0, thấy phân đoạn n-hexane hồn tồn khơng có k ức chế tyrosinase Cả phân đoạn lại có hoạt tính Trong ethyl acetate phân đoạn ức chế tốt (65,030 b±7,607 %) Ethanol có hoạt tính ức chế trung bình (36,113±5,310 %), cuối chloroform (22,117±3,058 %) Ở mức mg/mL, so với chứng dương kojic acid 200 µg/mL, phân đoạn có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mức thấp Các nghiên cứu giới chưa đề cập tới hoạt tính lồi Marchantia polymorpha L Nhìn chung, hoạt chất có khả ức chế tyrosinase tập trung phân đoạn có tính phân cực trung bình mạnh Hình Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase cao chiết phân đoạn Khảo sát khả ức chế enzyme α -glucosidase Enzyme α -glucosidase ruột động vật tham gia vào trình phân cắt oligosacharide giải phóng glucose vào máu Việc ức chế hoạt động enzyme α-glucosidase biện pháp việc kiểm soát lượng đường huyết làm chậm hấp thu glucose sau bữa ăn Các hợp chất có khả ức chế enzyme cao, có TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ: CHUN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 5, 2018 tiềm việc điều trị bệnh đái tháo đường tuýp Ở nồng độ mg/mL bốn loại cao chiết cho kết ức chế enzyme đến 100% Trong chứng dương acarbose với nồng độ mg/mL ức chế 69,00 ± 2,92 % Chúng tiến hành xác định IC50, để thuận lợi cho việc so sánh phân đoạn đó, kết thể Hình Cả bốn phân đoạn có IC 50 thấp nhiều so với acarbose Trong phân đoạn, cao ethanol có hoạt tính thấp (với IC 50 cao nhất, 92,320±6,592 µg/mL) ethyl acetate có hoạt tính mạnh (IC50 thấp nhất, 10,269±0,346 µg/mL) Hoạt tính kháng α -glucosidase điểm quan trọng đánh giá tiềm ứng dụng để điều trị đái tháo đường tuýp Acarbose xem chất ức chế enzyme α -glucosidase điển hình Người ta thấy cao chiết từ loại thực vật sử dụng dân gian có hoạt tính ức chế tương đương acarbose Nguyễn Xuân Hải cộng (2015) báo cáo cao 31 chiết methanol từ thân gòn (Ceiba pentandra L.) thân dâu tằm ( Morus alba L.)- đối tượng bật 20 loài thực vật dược liệu từ Đồng Tháp với IC50 thấp chứng dương acarbose từ 22 đến 29 lần [6] Báo cáo Đái Thị Xuân Trang nhàu, cho thấy cao chiết ethanol phận toàn mạnh chứng dương, đặc biệt cao chiết từ rễ mạnh gấp 24,3 lần [17] Một báo cáo ổi, cao chiết ethanol mạnh chứng dương 1,36 lần [18] Trong báo cáo này, cao chiết ethyl acetate M polymorpha cao chiết bật cả, kết IC50 cho thấy hoạt tính mạnh chứng dương khoảng 53 lần Trên giới, nghiên cứu ức chế enzyme α-glucosidase loài thực vật bậc thấp hạn chế Kết cho thấy lồi địa tiễn Marchantia polymorpha L có khả ức chế tốt enzyme Phân đoạn ethyl acetate phân đoạn tiềm năng, cần tìm hiểu sâu để tìm hợp chất có khả ứng dụng điều trị bệnh đái tháo đường tuýp Hình Biểu đồ thể IC 50 ức chế enzyme α-glucosidase loại cao chiết acarbose Khảo sát hoạt tính kháng phân bào dòng tế bào MCF-7 Thí nghiệm khảo sát tiến hành nồng độ 100 µg/mL cho bốn cao chiết với chứng dương camptothecin nồng độ 0,05 µg/mL Kết trình bày Bảng Bảng Tỷ lệ % ức chế phân bào loại cao chiết camptothecin Mẫu thử Camptotheci n n-Hexane Chloroform Ethyl acetate Ethanol Tỷ lệ % ức chế 65,14a ± 3,26 -8,64d ± 4.42 65,56a ± 1,58 48,87b ± 2,14 4,64c ± 5,14 Các số trung bình với ký tự khác có khác biệt ý nghĩa với mức P (p-value) < 0,05 Kết Bảng cho thấy phân đoạn n-hexane hồn tồn khơng có khả ức chế tăng sinh dòng tế bào MCF-7 Trong đó, mẫu cao chloroform có tỷ lệ phần trăm ức chế cao (65,56 ± 1,58 %) khác biệt với kết camptothecin (65,14 ± 3,26 %), ethyl acetate với 48,87 ± 2,14 % Phân đoạn ethanol ức chế yếu Trong bốn phân đoạn nồng độ 100 µg/mL có phân đoạn chloroform có khả gây độc ức chế tăng trường dòng tế bào ung thư vú MCF -7 Trong trình sàng lọc Marchantia polymorpha L số loài khác thuộc chi Marchantia, người ta thấy bên cạnh hợp chất thuộc nhóm terpenoid hợp chất aromatic bis(bi)benzyl đặc trưng có tác động mạnh đến dòng tế bào ung thư Các hợp chất gây độc, ức 32 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 5, 2018 chế tăng sinh gây chết theo chu trình apoptosis số dòng tế bào như: ung thư biểu mô, bạch cầu (Marchantin A), tuyến tiền liệt (Marchantin M, H) … [1] Huang cộng (2010) báo cáo hợp chất marchantin A có khả gây độc tế bào ung thư vú MCF -7 với IC50 µg/mL Hợp chất gây cảm ứng apoptosis dòng tế bào MCF-7 thơng qua đường phụ thuộc caspase [8] Có thể phân đoạn chloroform phân đoạn tập trung nhiều hợp chất nhóm marchantin số hợp chất khác có khả gây độc tế bào Vì vậy, cần đánh giá thêm hoạt tính kháng phân bào phân đoạn chloroform để thấy tiềm ức chế tế bào ung thư lồi Marchantia polymorpha L Định tính diện số nhóm hợp chất thứ cấp phân đoạn Kết định tính cho thấy, Marchantia polymorpha L ngồi tự nhiên có chứa hợp chất phenol, quinone, coumarin, flavonoid (flavone, flavonol, aurone, chalcone …), steroid, hợp chất glycoside lacton vòng (Bảng 5) Bảng Kết định tính diện số nhóm hợp chất thứ cấp có bốn phân đoạn cao chiết Nhóm hợp chất Thuốc thử n-Hexane Chloroform Ethyl acetate Ethanol Phenol Quinone, coumarin Tanin Alkaloid FeCl3 Bortrager Gelatin mặn Wagner - +(xanh nhạt) +(vàng) - +(xanh nhạt) +(vàng) - ++ (xanh) +(vàng) - H2SO4 đđ - + (nâu đen) + (nâu đỏ) + (đỏ) Saponin NaOH 1%/ Ethanol AlCl3 2%/ Ethanol Chì acetate 10% Wilstatter-Mg Wilstatter-Zn Roseinhem Salkowshi Tạo bọt (Saponin) - ++ (vàng) +(xanh nhạt) + (tủa đục) + (xanh) - +(vàng nhạt) +(tủa đục) + (đỏ) - +(vàng nhạt) +(tủa đục) + (nâu) - Glycoside Molisch + (hơi đỏ) ++ (đỏ đậm) ++ + Lacton vòng Baljet - +(vàng) +(vàng) +(vàng cam) Flavonoid Terpenoid-Steroid Ghi chú: (+): dương tính; (-): âm tính Số lượng dấu (+): cao có nhiều hợp chất cần khảo sát dựa mức độ phản ứng Phân đoạn n-hexane khơng có diện tất hợp chất Điều thú vị phân đoạn mùi hăng nồng, phân đoạn có hợp chất lipophilic terpenoid-nhóm hợp chất tạo mùi đặc trưng cho loài địa tiễn [1], [15] Người ta tìm thấy nhiều acid béo lạ lồi Marchantia polymorpha L., acid béo góp phần tạo mùi cho phân đoạn [15] Khả khai thác hợp chất có hoạt tính sinh học phân đoạn tương đối thấp, lại mang tiềm ứng dụng lĩnh vực tạo mùi, điều hương mỹ phẩm trị liệu Ở ba phân đoạn lại có diện đầy đủ nhóm hợp chất, phản ứng dương tính nhóm lại khác Điều cho thấy phổ phân cực phong phú hợp chất có lồi địa tiễn M polymorpha L thu hái ngồi tự nhiên Các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm lồi địa tiễn tập trung nhiều phân đoạn chloroform ethyl acetate, kết thu nhận cao lần xác định cho nhận định Bên cạnh từ kết hoạt tính dự đốn phía trên, nhóm hợp chất bis(bi)benzyl đặc trưng tập trung nhiều phân đoạn chloroform, góp phần vào hoạt tính kháng khuẩn kháng phân bào trội phân đoạn KẾT LUẬN Thông qua khảo sát, kết cho thấy Marchantia polymorpha L thu hái Đà Lạt, Lâm Đồng có khả kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế tyrosinase, α-glucosidase kháng phân bào Các nhóm hoạt chất lồi địa tiễn tương đối đơn giản, tập trung vào nhóm hợp chất phenolic (các hợp chất quinone, coumarin, flavonoid, bis(bi) benzyl), terpenoid (steroid, số nhóm terpene tạo mùi) dẫn xuất glycoside Các hoạt chất có hoạt tính tập trung phân đoạn chloroform, ethyl acetate TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ: CHUN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 5, 2018 ethanol Phân đoạn chloroform trội hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn ức chế tăng sinh dòng tế bào MCF -7 Bên cạnh đó, phân đoạn ethyl acetate lại có hoạt tính kháng enzyme tyrosinase tốt bật hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase với IC50 = 10,269 ± 0,346 µg/mL, thấp nhiều lần so với chứng dương acarbose Các kết giúp hiểu thêm cách sử dụng dân gian số nước điều trị bệnh thấy tiềm ứng dụng Marchantia polymorpha L số bệnh phổ biến Vì cần tiếp tục tìm hiểu thêm thành phần hoạt chất, sâu vào hoạt tính khảo sát tiến hành thêm hoạt tính sinh học khác loài địa tiễn Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Đại học Quốc gia - TP Hồ Chí Minh (ĐHQG -HCM) khn khổ đề tài mã số C2017 -18-20 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] Y Asakawa, A Ludwiczuk, F Nagashima, “Phytochemical and biological studies of bryophytes”, Phytochemistry, vol 91, pp 52–80, 2013 S Chandra, D Chandra, A Barh, R.K Pandey, and I.P Sharma, “Bryophytes: Hoard of remedies, an ethnomedicinal review”, Journal of Traditional and Complementary Medicine, vol 7, no 1, 94-98 (2017) B Crandall-Stotler, R.E Stotler and D.G Long, “Morphology and classification of the Marchantiophyta”, In B Goffinet & A J Shaw (eds.), Bryophyte Biology, pp 1–54, 2009 B Crandall-Stotler, R.E Stotler and D.G Long, “Phylogeny and classification of the Marchantiophyta”, Edinburgh Journal of Botany, vol 66, pp 155–198, 2009 N.T.M Hanh, N.K.P Phung, and Q.N.D Phuong, “Studying on tyrosinase inhibition activity of some Vietnamese folk plants aims to use in skin-whitening cosmetics”, American Journal of Plant Sciences, vol 8, 1319–1328, 2017 N.X Hải, N.T.T Mai, “Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase số thuốc Đồng Tháp”, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học, vol 20, no 4, pp 289–296, 2015 S Hogan, L Zhang, J Li, S Sun, C Canning, K Zhou, “Antioxidant rich grape pomace extract suppresses postprandial hyperglycemia in diabetic mice by [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] 33 specifically inhibiting alpha-glucosidase”, Nutrition & Metabolism, vol 7, pp 71–79, 2010 W.J Huang, C.L Wu, C.W Lin, L.L Chi, P.Y Chen, C.J Chiu, C.Y Huang, C.N Chen, “Marchantin A, a cyclic bis(bibenzyl ether), isolated from the liverwort Marchantia emarginata subsp tosana induces apoptosis in human MCF-7 breast cancer cells”, Cancer Lett., vol 291, pp 108–119, 2010 N.T.H Lan, B.Q Thuật, L.D Tuyên, N.T.N Duyên, “Khả kháng khuẩn tinh dầu tía tơ”, Tạp chí Khoa học Phát triển, vol 13, no 2, pp 245–250, 2015 P Molyneux, “The use of the Stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity”, Songklanakarin Journal of Science and Technology, vol 26, no 2, pp 211–219, 2004 N.T.M Nuong, H.H.T Duong, “Selective cytotoxicity of a Vietnamese traditional formula, Nam Dia Long, against MCF-7 cells by synergistic effects”, BMC Complementary and Alternative Medicine, vol 16, no 1, p 220, 2016 N.K.P Phụng “Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2007 Q.N.D Phương, H.T.T Minh, L.P Yến, N.K.P Phụng B.V Lệ, “Sàng lọc thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết Drosera indica L nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, vol 14, 30–37, 2011 R Krishnan and K Murugan, “Polyphenols from Marchantia polymorpha L a bryophyte: a potential source as antioxidants”, World journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, vol 2, no 6, 5182–5198, 2013 S Marko, B Aneta, G Dragoljub, “Bryophytes as a potential source of medicinal compounds”, LEK SIROW (Vol.XXI), no 21, pp 17–29, 2001 M Shimamura, “Marchantia polymorpha: taxonomy, phylogeny and morphology of a model system”, Plant and Cell Physiology, vol 57, no 2, pp 230–256, 2015 Đ.T.X Trang, N.T.L Phương, “Khả ức chế enzyme α-glucosidase điều trị bệnh đái tháo đường cao chiết nhàu Morinda citrifolia L.”, Y học Thực hành, no 944, pp 77–80, 2014 Đ.T.X Trang, P.T.L Anh, T.T Mến B.T Anh, “Khảo sát khả điều trị bệnh tiểu đường cao chiết ổi Psidium guajava L.”, Tạp chí Khoa học, trường ĐH Cần Thơ, no 22b, 163–171, 2012 B Trusheva, D Trunkova and V Bankova, “Different extraction methods of biologically active components from propolis: a preliminary study”, Chemistry Central Journal, vol 7, pp 1–13, 2007 34 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCES, VOL 2, ISSUE 5, 2018 Biological activities of the liverwort Marchantia polymorpha L collected at Da Lat, Lam Dong province Tran Quoc Tan, Luong Thien Tam, Phan Ngo Hoang, Quach Ngo Diem Phuong University of Science, VNU-HCM Corresponding author: tqtan.herb@gmail.com Received 24-11-2017; Accepted 17-01-2018; Published 20-11-2018 Abstract—Marchantia polymorpha L is used as a folk medicine in India, China and some European countries for the treatment of inflammation, cure cuts, wounds, diuretics, etc Natural compounds and biological activities of this liverwort have been studied in the world for few years At present time, the studies on bryophytes (non-vascular plants) are quite limited, especially in Vietnam Therefore, this research focused on investigating some biological activities and analyzing of major secondary metabolites of M polymorpha L collected at Da Lat, Lam Dong Among four extracted fractions (nhexane, chloroform, ethyl acetate and ethanol), the chloroform extract exhibited the best antioxidant, antibacterial, anti-proliferation of MCF-7 cell line activities The ethyl acetate extract exhibited better activity of tyrosinase and α-glucosidase inhibition than others Main secondary compounds in this species were phenolics, steroids and glycosidederivatives These results were scientific evidences that might help us to understand rigorously about the ultilization of Marchantia liverwort in the traditional treatment and new potential applications in the contemporary medicine Keywords—bisbenzyl, bryophytes, Marchantin, Marchantia polymorpha L liverwort, ... phản ứng dương tính nhóm lại khác Điều cho thấy phổ phân cực phong phú hợp chất có loài địa tiễn M polymorpha L thu hái tự nhiên Các hợp chất có hoạt tính sinh học tiềm loài địa tiễn tập trung... qua khảo sát, kết cho thấy Marchantia polymorpha L thu hái Đà Lạt, Lâm Đồng có khả kháng oxy hóa, kháng khuẩn, ức chế tyrosinase, α-glucosidase kháng phân bào Các nhóm hoạt chất loài địa tiễn. .. tiềm ứng dụng Marchantia polymorpha L số bệnh phổ biến Vì cần tiếp tục tìm hiểu thêm thành phần hoạt chất, sâu vào hoạt tính khảo sát tiến hành thêm hoạt tính sinh học khác lồi địa tiễn Lời cảm