Khảo sát một số hoạt tính sinh học của sản phẩm chiết từ lá vối (clelstocalyx operculatus)

KH A O SẮT MỢr SỎ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÙA SẦN PHẨM CHĨÉT TỪLẮ VỎĨ ĐĨNH THỊ CAO KHANH i TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài "KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SẢN PHẨM CHIẾT TỪ LÁ VỐI Cleistoca

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

- oOo -

ĐINH THỊ CAO KHANH

KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA SẢN PHẨM CHIẾT TỪ LÁ VỐI

Trang 2

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Huỳnh Ngọc Oanh

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2 : PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 08 tháng

01 năm 2016

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Trang 3

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Bộ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Số: /BKĐT

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

HỌ VÀ TÊN: ĐINH THỊ CAO KHANH

Ngày tháng năm sinh: 12/08/1986

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1 Đề tài luận văn: KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SẢN PHẦM CHIẾT TỪ LÁ VỐI (Cleistocalyx operculatus) 2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): - Khảo sát sơ bộ nguyên liệu lá vối - Khảo sát một số hoạt tính sinh học của sản phẩm chiết từ lá vối và buớc đầu ứng dụng 3 Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 06 / 07/ 2015 4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04/12/2015 5 Họ tên nguời huớng dẫn: Phần huớng dẫn: TS HT HUỲNH NGỌC OANH Toàn bộ Nội dung và yêu cầu LVTN đã đuợc thông qua Bộ môn Ngày tháng năm 201

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN: Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:

Nơi lưu trữ luận văn:

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

MSSV:11310610 Nơi sinh: Tp.HCM

Mã ngành: 60 42 80

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn TS Huỳnh Ngọc Oanh, khoa Kỹ thuật Hóa học,

Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, tôi đã được thực hiện đề tài "KHẢO SÁT MỘT

SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SẢN PHẨM CHIẾT TỪ LÁ VỐI (Cleistocalyx operculatus)

Để có điều kiện thực hiện đề tài này cũng như hoàn thành chương trình cao học tại trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, tôi đã nhận được những sự chỉ dạy tận tình với những kinh nghiệm quý báu từ quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến:

• Ban Giám Hiệu cùng quý Thầy Cô Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM đã tạo cho tôi một môi trường học tập tích cực và thoải mái

* Quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã truyền dạy cho tôi những kiến thức chuyên môn quý báu là hành trang trong cuộc sống và công việc sau này

* Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn TS Huỳnh Ngọc Oanh, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

• Chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô, các anh chị cán bộ tại Trung Tâm Sâm và bộ môn Vi Sinh, Khoa Dược Trường Đại Học Y Dược TPHCM đã hỗ trợ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

» Bền cạnh đó, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy Cô, các anh chị trong bộ môn, các anh chị cao học và các bạn cùng làm việc trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

ĐINH THỊ CAO KHANH

Trang 5

KH A O SẮT MỢr SỎ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÙA SẦN PHẨM CHĨÉT TỪLẮ VỎĨ ĐĨNH THỊ CAO KHANH

i

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài "KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SẢN PHẨM CHIẾT TỪ LÁ VỐI

(Cleistocalyx operculatus) ”đã thu được một số kết quả như sau:

Sơ bộ thành phần lá vối có nhiều tinh dầu, flavonoid, terpenoid, tanin, hợp chất polyuronic Phân tích thành phần cao chiết Methanol bằng phương pháp GC/MS cho thấy thành phần chính trong cao là Ocimene, phytol và Caryophyllene, cao chiết Henxane-Acetone cho thấy thành phần chính là Ocimene và Caryophyllene Điều kiện tối ưu để trích ly lá vối được xử lý bởi enzyme Viscozyme L theo hàm lượng hợp chất Polyphenol trong đã cho các thông số thích hợp như sau: tỉ

lệ nguyên liệu/nước là V2, nồng độ enzyme là 12 pl/g nguyên liệu và thờj gian trtch lỵ lá 120 phím

ở nhiệt độ 50°C Dịch chiết lá vối được phân tích hàm lượng EGCG (mg/ml) với kết quả có dùng enzyme là 99.39 và không có enzyme là 74.51 Cao chiết có xử lý enzyme và cao chiết không có enzyme thu được hàm lượng chất khô tương ứng là 5.7% và 3.16% Cao chiết từ dịch chiết được xử

lý enzyme thể hiện khả năng kháng khuẩn hiệu quả cao hơn cao chiết từ dịch chiết lá vối không xử

lý enzyme; khả năng kháng oxy hóa cũng cho hiệu quả hơn so với cao chiết không xử lý enzyme tương ứng IC50 là 31.64 ± 1.74 và 92.89 ± 9.37 (pg/ml) bằng phản ứng trung hòa gốc DPPH Tinh dầu trong lá vối được thu nhận bằng chưng cất cho hàm lượng tinh dầu trong lá vối tươi và tinh dầu

lá vối có xử lý enzyme đạt lần lượt 0.18% và 0.23%, cho thấy việc sử dụng enzyme đã làm tăng hàm lượng tinh dầu 27.7%; xác định được 2 thành phần có hàm lượng cao trong tinh dầu là Ocimene và Caryophyllene Khả năng kháng oxy hóa IC50 (mg/ml) của tinh dầu lá vối tươi và tinh dầu lá vối có

xử lý enzyme cho kết quả lần lượt là 3.35+0.11 và 4.56+0.16 Bước đầu ứng dụng thực nghiệm sản xuất nước uống lá vối, nước uống được phối chế thử cảm quan xác định được các hàm lượng syrup 12%, tỷ lệ pha loãng dịch chiết/nước là 1/5 được yêu thích nhiều nhất và được chọn để sản xuất thử nghiệm nước uống lá vối

Trang 6

ii

ABSTRACT

Preliminary components of Cleistocalyx operculatus leaves contain essential oils, flavonoids, terpenoids, tannins, polyuronic compounds Analysis of methanol extracts of c

operculatus leaves by GC/MS determined main ingredients are Ocimene, phytol and Caryophyllene,

main ingredients in hexane-acetone extracts are Ocimene and Caryophyllene Optimal conditions

obtained polyphenol in water extracts treated by enzyme Viscozyme L: ratio of material I water is

Vi, enzyme concentration 12pl /g, extraction conditions: 120 minutes at a temperature 50°C Water

extracts were analyzed levels of EGCG (mg/g dry content) with enzyme extracts were 99.39 and non-enzyme extracts were 74.51 Enzyme-treated extracts get weight 5.7% g/g material; non-enzyme extracts get weight 3.16% g/g material Enzyme-treated extracts shown antibacterial more than non-enzyme extracts from fresh leaves; antioxidant activity corresponding IC50 values are

31.64 ± 1.74 and 92.89 ± 9.37 (pg/ml) by DPPH reation Essential oils from c operculatus fresh

leaves and enzyme-treated leaves were collected by distillation, reached respectively 0.18% w/w and 0.23% w/w; showing that using enzyme has increased oil content up to 27.7%; identified the 2 components which have a high content were Ocimene and Caryophyllene Antioxidant activity IC50 (mg/ml) of essential oil from fresh leaves and from enzyme-treated leaves are respectively 3.35 ±

0.11 and 4.56 ± 0.16 Initial experiments to produce beverages from Cleistocalyx operculatus leaves,

a beverage recipe was made and tested sensory to determine that the final syrup content 12% and dilution ratio between exttacts/water = 1/5 are the most favorable kind and chosen to run the trial test

Trang 7

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Đinh Thị Cao Khanh, học viên cao học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học, khóa

2011, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM Tôi xin cam đoan:

Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Huỳnh Ngọc Oanh

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp của minh

Học viên

Đinh Thị Cao Khanh

Trang 8

iii

MỤC LỤC

Danh mục hình vi

Danh mục bảng vii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN 2

2.1 Tổng quan cây vối 2

2.1.1 Giới thiệu 2

2.1.2 Phân loại khoa học 2

2.1.3 Mô tả thực vật 2

2.1.4 Phân bổ sinh thái 4

2.1.5 Công dụng của cây vối 5

2.2 Thành phần hóa học của cây vối 5

2.3 Tác dụng sinh học 7

2.4 Enzyme Viscozyme L: 11

2.5 Những công trình nghiên cứu về cây vối 10

CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

3.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 13

3.1.1 Nguyên liệu: 13

3.1.2 Hóa chất 13

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 13

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Nội dung nghiên cứu: 14

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.2.1 Phương pháp sơ bộ thành phần hóa thực vật 14

3.2.2.2 Phương pháp chiết bằng dung môi 15

3.2.2.3 Phương pháp phân tích bang GC/MS 15

3.2.2.4 Khảo sát điều kiện sử dụng enzyme thu dịch chiết giàu polyphenol 16

3.2.2.5 Phương pháp khảo sát một so hoạt tính sinh học 18

a) Khảo sát khả năng khảng oxy hóa: 18

b) Phương pháp xác định khả năng khảng khuấn của dịch chiết 21

3.2.2.6 Phương pháp phân tích hàm lượng EGCG, cafein bang HPLC 21

3.2.2.7 Thu cao chiết lá vối 22

Trang 9

iv

3.2.2.8 Phương pháp chưng cẩt tinh dầu 23

3.2.2.9 Thử nghiệm sản xuất nước uống lá vối 24

a) Quy trình thực nghiệm sản xuất đồ uống đóng chai từ dịch chiết lá vối bằng enzyme: 24

b) Thuyết minh quy trình: 25

c) Đánh giá cảm quan sản phẩm: 25

CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ 26

4.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu 27

4.1.1 Phân tích thành phần thực vật sơ bộ 27

4.1.2 Thành phần và hàm lượng các chẩt trong cao chiết 29

4.2 Khảo sát dịch chiết lá vối 30

4.2.1 Kháo sát điều kiện thu dịch chiết giàu polyphenol 30

4.2.1.1 Khảo sát sự ảnh hưởng lượng enzyme đến quá trình trích ly polyphenol 30

4.2.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ nước/nguyên liệu đến quá trình trích ly polyphenol 31

4.2.1.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến quá trình trích ly polyphenol 32

4.2.1.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến quá trình trích ly polyphenol 33

4.2.2 Phân tích hàm lượng EGCG và cafein trong dịch chiết 36

4.2.3 Khả năng khảng oxy hóa của dịch chiết 36

4.3 Khảo sát cao chiết 38

4.3.1 Thu cao chiết 38

4.3.2 Khảo sát khả năng khảng khuấn của cao chiết 38

4.3.3 Khảo sát khả năng khảng oxy hóa của cao chiết 39

4.4 Bước đầu thử nghiệm thu tinh dầu lá vối 40

4.4.1 Hàm lượng và thành phần tinh dầu trong lá voi 40

4.4.2 Khả năng khảng oxy hóa của tinh dầu 42

4.4.3 Khả năng khảng khuấn của tinh dầu 43

4.5 Bước đầu ứng dụng làm nước uống đóng chai: 45

4.5.1 Phổi chế 45

Trang 10

V

4.5.2 Đánh giá cảm quan 45

4.5.3 Kiểm tra tiêu chuẩn vi sinh nước uống lá vối 47

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

5.1 Kết luận: 49

5.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

Trang 11

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cây vối 3

Hình 2.2: Lá, đọt và cành vối 3

Hình 2.3: Hoa vối 4

Hình 2.4: Quả vối 4

Hình 3.1: Máy cô quay 22

Hình 3.2: Sơ đồ chưng cất tinh dầu 23

Hình 3.3: Sơ đồ thử nghiệm sản xuất nước uống lá vối 24

Hình 4.1: Cao chiết MeOH và Hexane-Acetone 30

Hình 4.2: Khảo sát sự ảnh hưởng của lượng enzyme đến quá trình trích ly polyphenol31 Hình 4.3: Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/nước trích ly polyphenol 32

Hình 4.4: Khảo sát thời gian trích ly polyphenol 33

Hình 4.5: Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol 34

Hình 4.6: Dịch chiết có xử lý enzyme (A) và không xử lý enzyme (B) 35

Hình 4.7: Cao chiết lá vối có xử lý enzyme (A) và không xử lý enzyme (B) 38

Hình 4.8: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết 39

Hình 4.9: Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu 43

Hình 4.10: Kết quả MIC kháng khuẩn của tinh dầu 44

Hình 4.11: Cảm quan ở tỷ lệ syrup 8% 45

Hình 4.15: Nước uống lá vối 47

Trang 12

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần tính dầu trong các bộ phận cây vối ố

Bảng 3.1: Nội dung nghiên cứu 14

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm xác định lượng enzyme thích hợp 17

Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm xác định lượng nước thích hợp 17

Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp 18

Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp 18

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm kháng oxy hóa của dịch chiết 20

Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm kháng oxy hóa của tính dầu 20

Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm kháng oxy hóa của cao chiết 21

Bảng 3.9: Cảm quan nước uống lá vối 25

Bảng 4.1: Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học 27

Bảng 4.2: Thành phần cao chiết Methanol 29

Bảng 4.3: Thành phần cao chiết Hexane-Acetone 29

Bảng 4.4: Hàm lượng PPT trong dịch chiết lá vối 35

Bảng 4.5: Kết quả hàm lượng EGCG và cafein trong dịch chiết lá vối 36

Bảng 4.6: Khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết 37

Bảng 4.7 Hàm lượng cao chiết thu được 39

Bảng 4.8: Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết có xử lý enzyme 39

Bảng 4.9: Kết quả kháng oxy hóa của cao chiết lá vối không xử lý enzyme 40

Bảng 4.10: Hàm lượng tính dầu 40

Bảng 4.11: Thành phần chính của tính dầu 41

Bảng 4.12: Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH của tính dầu 42

Bảng 4.13: Đường kính kháng khuẩn của tinh dầu lá vối (mm) 43

Bảng 4.14: Kết quả MIC tinh dầu lá vối 44

Bảng 4.15: Kết quả cảm quan cao nhất theo hàm lượng syrup 47

Bảng 4.16: Kết quả kiểm tra vi sinh nước uống lá vối 48

Trang 13

EGCG: Epigallocatechin gallate

FGB: Fungal Beta-Glucanase unit

GC/MS: Gas chromatography/mass spectrometry

HPLC: high performance liquid chromatography

IC50: nồng độ ức chế 50%

MBC: Nồng độ vi khuẩn tối thiểu bị ức chế

MHA: Mueller-Hinton Agar

MIC: Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn

MRSA; Staphylococcus aureus kháng methicillin

MSSA: Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus

NB: Nutrient Broth

OD: optical density

PPT: polyphenol tong

RSM: Response Surface Methodology

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam

TPHCM: thành phố Hồ Chí Minh

TSA: Tryptic Soy Agar

TSB: Tryptic Soy Broth

TT: thuốc thử

Trang 14

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU

Từ ngàn xưa con người đã sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên để tăng cường sức khỏe, ngăn ngừa lão hóa, bồi bổ cơ thể như ngậm sâm, uống trà, sử dụng mật ong; dùng các sản phẩm tinh dầu giúp giảm đau, sát khuẩn vết thương, hỗ trợ điều trị viêm, tiêu hóa, giúp sảng khoái tinh thần, làm nước hoa, tạo hương Hiện nay, trong xu hướng điện đại, con người vẫn tiếp tục mong muốn gần gũi thiên nhiên, sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên với các công năng hữu ích và an toàn dài lâu Ngày nay xã hội phát triển, công nghệ hiện đại giúp đa dạng hóa sản phẩm, chiết xuất với cách trích ly dưỡng chất sinh học hiệu quả Do đó, thực phẩm chức năng có nguốn gốc thiên nhiên được đặc biệt quan tâm ửong thời gian gần đây vì những công dụng không những trong hỗ trợ điều trị mà còn phòng ngừa bệnh hiệu quả

Những dược liệu thiên nhiên như Thông đỏ, Dừa cạn, Trinh nữ hoàng cung, Trà đều hiện diện khá nhiều tại Việt Nam và hơn thế nữa vẫn còn nhiều dược liệu thiên nhiên quý theo kinh nghiệm dân gian Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tìm theo những bài thuốc truyền

miệng và nhận thấy cây vối (Cleistocalyxoperculatus, Myrtaceae) đang được người dân sử dụng với

nhiều công dụng có lợi cho sức khỏe Góp phần vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và tác động

dược lý của cây vối, chúng tôi thực hiện luận văn “KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH

HỌC CỦA SẢN PHẨM CHIẾT TỪ LÁ VỐI Cleistocalyx operculatus”.

Trang 15

CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN

2.1.1 Giới thiệu

Tên Việt Nam: cây vối

Tên nước ngoài: Lid eugenia (Anh)

Tên khoa học: Cleỉstocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry

Đồng tên: EugeniaoperculataRữxlo., Syzygium nervossum DC., Syzygium

operculatum (Roxb.) Nied

2.1.2 Phân loại khoa học

Trong hệ thống phân loại của A L Takhtajan (2009) [5], vị trí phân loại của loài Cleis-

tocalyxoperculatus như sau:

Loài: Cỉeistocaỉyx opercuỉatus

2.1.3 Mô tả thực vật

Cây nhỡ, cao 5 - 6 m, có khi hơn, cành non, tròn hơi hình 4 cạnh, nhẵn Lá có cuống, dài 8-20 cm, hình trứng, rộng 5-10 cm Hai mặt lá có những đốm màu nâu, cuống dài 1-1,5 cm Hoa gần như không có cuống, màu lục, trắng nhạt hợp thành cụm hoa hình tháp tỏa ra ở những lá đã rụng Quả hình cầu hay hơi hình trứng, đường kính 7 - 12 cm, khi chín màu tím Toàn lá, cành non và nụ vối

có mùi thơm đặc biệt dễ chịu của vối [2], [3],

Trang 16

Hình 2.1: Cây vối

Hình 2.2: Lá, đọt và cành vôi

Trang 17

Hình 2.3: Hoa vối

Hình 2.4: Quả vối

2.1.4 Phân bố sinh thái

Vối là cây đặc hữu của vùng Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc O Việt Nam, vối mọc tự nhiên dọc theo các bờ suối hay ao hồ ở vùng núi thấp và trung du, thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Thông Nông, Thạch An ); Lạng Sơn (Đồng Mô, Hữu Lũng ), Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế ); Vĩnh Phúc (Lập Tạch, Tam Dương); Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình Cây vối còn được ừồng rải rác các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ Cây được ttồng ở bờ ao để chống sạt lở đất, vừa tận dụng khoảng không gian

Vối thuộc loại cây ưa ẩm, ưa sáng, sinh trưởng và phát triển nhanh; ừong vòng 03 năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5m Cây phân cành nhiều, chồi và lá non ra nhiều ửong mùa xuân hè Những cây mọc ở chỗ được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt khỏe Ngoài ra, để cho cây có nhiều cành lá người ta thường chặt bớt cành hàng năm, nhằm kích thích cho

sự sinh chồi mới Chồi mới mọc ra theo kiểu lưỡng phân; những chồi phát triển thành cánh có hên

Trang 18

một năm tuổi mới ra hoa quả [2],

2.1.5 Công dụng của cây vối

Hàm lượng tinh dầu dao động ttong khoảng 0.1 - 0.4% Hàm lượng tinh dầu vối ở Quế Phong (0.4%) là cao nhất, thấp nhất là tinh dầu vối ở thành phố Vinh (0.1%) Trong các bộ phận khác nhau của cây vối thì hàm lượng tinh dầu cao nhất tập trung ở nụ hoa 0.48%, hoa nở có hàm lượng tinh dầu

là 0.28% và hoa già có hàm lượng tinh dầu thấp nhất với 0.18% [4],

Trang 19

KHẰO SĂT MỢr SỔ HOẠT TÍNH SINH HỌC CŨA SĂN PHẰM GHiỀT TỪLĂ VỚI BINH THỊ CAO KHANH

é

e

Trang 20

3'-formyl-Từ phân đoạn nước của cao chiết methanol, bằng kĩ thuật sắc kí điều chế đã phân lập được

5 flavonoid bao gồm: myricetin-3methylether 3-O-P-D-galactopyranosid, myricetin-3 dimethylether 3-O-P-D-galactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin [9], Byung và cộng

’-sự cũng phân lập được 7 hợp chất từ phân đoạn này [13],

Tác dụng dược lý của polyphenol

Polyphenol là một nhóm hợp chất lớn ttong cấu trúc có nhiều nhóm hydroxy gắn vào nhân thơm, hiện diện nhiều ttong thực vật bậc cao Đây thường là những chất chuyển hóa thứ cấp của cây,

có khả năng chống tia uv và các mầm bệnh Những chất này được chia thành nhiều phân nhóm dựa hên chức năng của các vòng phenol bao gồm phenolic, flavonoid, stiben và lignan trong đó flavnonoid là phân nhóm lớn nhất Tác dụng sinh học của các polyphenol được giải thích là do chúng

có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất chống oxy hóa Các gốc tự do được sinh ra và tích luỹ trong cơ thể, là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá

Trang 21

cơ thể con người

Ngoài ra, hợp chất polyphenol thường có trong các loại hoa quả, rau củ, các loại hạt, ngũ cốc Hợp chất này có đặc tính chống oxy hóa, kháng viêm và chống ung thư Chất polyphenol cũng giúp động mạch co giãn để duy trì lưu lượng máu và giữ cho động mạch không bị xơ vữa [20], [21], [23],

Tác dụng dược lý của flavonoid

Flavonoid là một phân nhóm của polyphenol trong cấu trúc có 2 vòng thơm (vòng A và vòng B) liên kết với nhau và liên kết với vòng thơm c qua 3 carbon Flavonoid được chia thành 6 nhóm nhỏ hơn bao gồm flavonol, flavon, isoflavon, flavanon, anthocyanidin và flavanol

Các dẫn chất flavonoid có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO., ROO Các gốc này sinh

ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin >quercetin> rhammetin> morin> diosmetin> naringenin> apigenin> catechin> 5,7 dihydroxy-3', 4', 5' trimethoxy flavon> robinin> kaempferol> flavon

Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hoá Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị pe- roxyd hoá, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự huỷ hoại tế bào Đưa các chất chống oxy hoá như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, tổn thương do bức xạ, thoái hoá gan [16],[17], [18], [19], [22],

Tác dụng dược lý của cây vôi

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng sinh học in vitro và in vivo của lá và nụ vối như

tác động chống ung thư, hạ đường huyết và tác động tăng trương lực cũng như làm giảm nhịp tim [11], Trong nghiên cứu của Byung và cộng sự trên phân đoạn nước dịch chiết methanol từ nụ vối, hợp chất 5,7,8,4'-tetrahydroxy-3',5'- dimethoxyflavone-3-ơ-P-D galactopyranosid, gossypetin-8,3'-dimethylether-3-ơ-P-D- galactosid và myricetin-3'-methylether-3-ơ-P-D galactopyranosid được

đánh giá tác động gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư Hela, HL-60 và A549 bằng

phương pháp thử nghiệm MTT đã cho thấy tác động gây độc tế bào yếu ưên tế bào Hela với IC50 38.7; 42.1 và 45.5 pM, tác động gây độc tế bào trung bình trên dòng tế bào HL-60, IC50 đo được từ 13.7 đến 18.1 pM và tác động gây độc tế bào yếu ưên dòng tế bào A549 với IC50 lớn hơn 100 pM [13], Byung và cộng sự cũng nghiên cứu phân đoạn ethyl acetat từ dịch chiết methanol của nụ vối và

Trang 22

chứng minh được các hợp chất 3'- formyl-4,4',6'-trihydroxy-2'-methoxy-5'-methylchalcon,

(2S)-8-formyl-ố- methylnaringenin, và (2S)-8-formyl-ố-methylnaringenin7-ơ-P-D-glucopyranosid có tác động chống oxy hóa với IC50 22.8 và 27.1 pM [14],

Tinh dầu trong cây vối ở Nepal hầu như không có tác động kháng khuẩn đối với Bacillus

cereus, Staphylococcus aureus, cũng như không thể hiện tác động kháng nấm đối với Aspergillus niger và Candida albicans và không có tác động gây độc tế bào đáng kể trên các dòng tế bào ung

thư MCF-7, MDA-MB-231 và 5637 [10]

Thành phần tinh dầu trong nụ vối có tác dụng ngăn ngừa thức ăn thối rữa, ức chế mầm bệnh

ttền da, kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Enterococci kháng vancomycin

và vi khuẩn đa đề kháng (MARB) Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) và nồng độ vi khuẩn tối thiểu bị ức chế (MBC) ttong khoảng từ 1 - 20 pl/ml Dịch chiết cồn cho thấy khả năng ức chế vi

khuẩn gram âm và p aeruginosa Giá trị MIC và MBC của dịch chiết cồn ttong khoảng từ 0.25 - 32

mg/ml

Flavonoid 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- dimethylflavanon, 2',4dihydroxy-6 methoxy-3 ',5 dimethylchalcon, 2',4'-dihydroxy-3 '-methyl-6'-methoxychalcon và 2,2',4'-trihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon có khung chalcon cho thấy khả năng ức chế trên enzyme neurominidase của virut H1N1 và H9N2 Chất 2,2',4'- trihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon thể hiện tác động mạnh nhất trên neuraminidase H1N1 và neuraminidase H1N1 kháng oseltamivir với giá trị IC50 là 8.15 ±

'-1.05 và 3.31 ± 1.34 pM Hợp chất 7-hydroxy-5-methoxy-6,8- dimethylflavanon, 2',4'-

methoxychalcon và 2,2',4'-trihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon cho thấy tác động ức chế

không cạnh tranh trong những nghiên cứu động học Flavonoid methyl hóa phân lập từ c operculatus

có tiềm năng phát triển thành những chất ức chế neuraminidase của H1N1 [8],

Tác động ngăn ngừa Alzheimer được đánh giá qua thử nghiệm ức chế hai enzyme acetylcholinesterase và butylrylchilineaterase, cả 5 flavonoid: myricetin-3’-methylether 3-0-0-D-galactopyranosid, myricetin-3 ’-dimethylether 3-0-0-D-galactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin đều thể hiện tác động ức chế enzyme acetylcholinesterase với IC50 lần lượt là 19.9; 37.8; 25.9; 30.4 và 22.3 pM, trong khi đó tác động ức chế butylrylchilineaterase chỉ thể hiện với flavonoidmyricetin-3’-methylether 3-0-0- D-galactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin

Trang 23

với giá trị IC50 lần lượt là 152.5; 177.8; 62.5 và 160.6 pM [9],

Hoàng Văn Lựu đã xác định hàm lượng và thành phần tinh dầu lá, nụ, hoa vối ở một vùng tại Nghệ An; tách và xác định cấu trúc một số flavonoid (2’ 4’-dihydroxy-6’- methoxy-3’ 5’-dimethyl chaicone, 5,7-dihydroxy-6,8-dimethyl flavanone, 7-Hydroxy-5- methoxy-6,8-dimethyl flavanone, acid cinnamic, acid oleanic) từ nụ và (acid oleanic, 0- sitosterol) từ vỏ vối [5],

Đào Thị Thanh Hiền đã nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của lá vối bao gồm tác dụng kháng khuẩn, tác dụng lợi mật và khả năng gây độc tế bào Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn cho

thấy lá vối đối với E coli, loại vi khuẩn hay gây bệnh đường ruột, hai vi khuẩn Gram dưomg thử

nghiệm, loại vi khuẩn hay gặp ở bệnh viêm da Nước sắc lá vối ủ có tác dụng lợi mật rất mạnh, tác dụng độc tế bào của 4 mẫu thử chiết từ lá vối bước đầu cho thấy cả tinh dầu và cao khô toàn phần đều có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư (ung thư gan, ung thư màng tim, ung thư tử cung) Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới đối với dược liệu lá vối [7],

Nhóm tác giả Trong Tuan Dao, Bui Thanh Tung và các cộng sự đã cho thấy flavonoid methyl

hóa phân lập từ c operculatus có tiềm năng phát triển thành những chất ức chế neurominidase của

virus cúm gia cầm H1N1 [7],

Nhóm tác giả Byung Sun Min và cộng sự đã đánh giá qua thử nghiệm ức chế hai enzyme acetylcholinesterase và butylrylchilineaterase (thuộc nhóm tác nhân gây bệnh Alzheimer), cả 5 flavonoid tách từ nụ vối: myricetin-3’-methylether 3-0-0-D- galactopyranosid, myricetin-3’-dimethylether 3-0-0-D-galactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin đều thể hiện tác động

ức chế enzyme acetylcholinesterase với IC50 lần luợt là 19.9; 37.8; 25.9; 30.4 và 22.3 pM, trong khi

đó tác động ức chế butylrylchilineaterase chỉ thể hiện với flavonoid myricetin-3’-methylether O'P-D- galactopyranosid, quercetin, kaempfrol và tamarixetin với giá trị IC50 lần luợt là 152.5; 177.8; 62.5 và 160.6 pM [9],

3-Trà nụ vối đã đuợc nghiên cứu cho thấy có khả năng ức chế Na+, K+, Ca2+ - AT- Pase trong tim chuột làm tăng sụ co bóp và giảm tần số co bóp của tim chuột Cơ chế tác động của trà nụ vối tuơng đối chậm hơn tuy nhiên hiệu quả ổn định hơn Ouabain (là một glucosid chiết xuất từ hạt cây

Strophantus gratus, họ trúc đào (Apocynaceae) có tác dụng chữa trụy tim mạch nhanh bằng cách

tiêm tĩnh mạch) [35]

Trang 24

Tinh dầu đuợc phân lập từ các nụ vối ức chế đáng kể sụ phát triển của vi khuẩn Gram âm (P

aeruginosa) và Gram duơng, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), kháng Vancomycin Enterococci (VRE) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

(MBC) của tinh dầu kháng lại các vi sinh vật thử nghiệm đã được tìm thấy trong khoảng 1-20 pl /ml [36]

Viscozyme L của hãng Novozyme Đan Mạch, là hỗn hợp đa enzyme từ chủng nấm mốc

Aspergillus aculeatus, chứa các carbohydrase arabanase, cellulase, beta-glucanase, hemicellulase và

Viscozyme L được sản xuất chuyên dùng cho xử lý nguyên liệu rau quả và trái cây [31], Enzyme

Viscozyme được chứng minh là có hiệu quả (tăng gần gấp đôi lượng tinh dầu so với phương pháp không xử lý enzyme) khi xử lý tỏi thu tinh dầu mà không gây ảnh hưởng nhiều về hương vị và tính chất hóa lý của tinh dầu [32], Park M.K đã thử nghiệm xử lý enzyme Viscozyme và Pectinex đối với

vỏ quả táo để thu polyphenol tổng và chất chống oxy hóa Kết quả cho thấy rằng Viscozyme hiệu quả hơn Pectinex ở mọi nhiệt độ thử nghiệm, và hỗn hợp Viscozyme-Pectinex thu được hàm lượng polyphenol tổng cao nhất ở 50°C, hàm lượng chất chống oxy hóa cũng gia tăng đáng kể (từ 0.10 lên đến 0.40mM vít C) [33] Enzyme Viscozyme L được nghiên cứu tối ưu hóa chiết protein từ yến mạch bằng mô hình đáp ứng bề mặt RSM đã xác định được điều kiện tối ưu nồng độ Viscozyme 300 FBG/10 g yến mạch, pH 4.6, thời gian ủ 2.8 giờ ở nhiệt độ 44°c Lượng protein đã tăng 56.2% hiệu quả hơn so với phương pháp kiềm hóa ở điều kiện pH 9 chỉ đạt 14.76% [34],

Trang 25

CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1.1 Nguyên liệu:

Lá vối tươi: được lấy từ cây vối ửồng tại TPHCM có nguồn gốc từ Ninh Bình

Enzyme Viscozyme L: của Novozyme Đan Mạch

Các chủng vi sinh vật làm kháng khuẩn: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Streptococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicilin (MSSA) ATCC 29213, Staphylococcus aureus đề kháng methicilin (MRSA) ATCC 43300

3.1.2 Hóa chất

Hóa chất: DPPH, acid ascorbic, (Sigma, Mỹ); n-hexane, methanol, xylene, acetone, n- butanol, diethyl ether, cloroform, DMSO (Merck)

FeSO4, KNaC4H4O6,Na2HPO4, KH2PO4 (Trung Quốc)

Bộ phân tích thành phần hóa thực vật của Bộ Môn Dược,trường Đại Học Y Dược

Môi trường: TSA, TSB, MHA, NB

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Máy cô quay Rotor Buchi

Máy OD CT Chromtech

Kính hiển vi quang học CX-21 (Olympus)

Máy GC/MS- QP2010 Ultra Shimadzu

HPLC Agilent C2000

Cân sấy ẩm Satorius

Các dụng cụ thường quy trong phòng thí nghiệm

Trang 26

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu:

3.2.1 Nội dung nghiên cứu :

Bảng 3.1: Nội dung nghiên cứu

ũ

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phương pháp sơ bộ thành phẩn hóa thực vậ t

a) Phương pháp xác định độ ẩm

Nguyên tắc: xác định khối lượng dược liệu trước và sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi Từ đó

suy ra phần trăm khối lượng nước mất đi

Cách thực hiện: xác định mất khối lượng do làm khô bằng cách dùng cân sấy ẩm hồng ngoại

(Satorius) Kết quả tính trung bình 3 lần thử

b) Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật:

Nguyên tắc: chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độ phân

cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt với các dung môi: diethyl ether, ethanol và nước Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng

Cách thực hiện : xem phụ lục 1

3.2.2.2 Phương pháp chiế t bằng dung môi

Trang 27

Nguyên tẳc; Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi nguyên liệu thực

vật Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan ưong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Quá trình chiết xuất xảy ra chủ yếu ở hai khu vực: bên trong nguyên liệu và lớp dung môi Trong đó, quá trình xảy ra bên trong nguyên liệu có ảnh hưởng quyết định và phụ thuộc vào bản chất nguyên liệu (cấu trúc, tính chất lý hoá ) Các phương pháp chiết xuất thường chỉ tác động đến các yếu tố bên ngoài, nhằm đạt được hiệu quả chiết xuất cao trong thời gian ngắn đối với mỗi loại nguyên liệu Trong quá trình chiết bằng dung môi có thể sử dụng các tác nhân khác hỗ trợ chiết nhanh và hiệu quả hơn như sóng siêu âm

Cách thực hiện; Khoảng 300g lá vối tươi được rửa sạch hong khô, ngâm vào khoảng 400ml dung môi

Methanol trong 1 tuần, hỗn hợp được đặt trong bể siêu âm để tăng hiệu quả chiết, gạn bỏ bã thu được mẫu dịch chiết Methanol Thực hiện tương tự với dung môi là Hexane-Acetone thu được dịch cao Hexane-Acetone Dịch chiết được cho bay hơi tự nhiên trong tủ hút đến khi khô thu được cao Methanol, cao Hexane-Acetone

3.2.2.3 Phương pháp phân tích bằng GC/MS

Nguyên tẳc; Mẩu được bơm vào trong, khí hóa mẫu, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích

hợp Ion tạo thành theo dòng khí mang (trong trường hợp này là N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) trong

bộ phân tích khối của máy khối phổ Mẩu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh Sau đó, các chất làn lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích, trong trường hợp này là đầu dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry) , từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ

Cách tiến hành; Mẩu dịch chiết được lọc qua mảng lọc 0.45pm bằng ống xilanh sử dụng 1 làn rồi cho

vào các ống vial chuyên dùng để chạy GC/MS Mẩu cao chiết được phân tích bằng thiết bị sắc ký khí đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC/FID) và sắc ký khí ghép khối pho (GC/MS), được thực hiện tại phòng thí nghiệm của trung tâm Vinaconttol Việt Nam và phòng Thí Nghiệm Trọng điểm Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM Phân tích GC/MS được tiến hành trên máy QP2010 Ultra Shimadzu Cột HP-5 (30 m, 0.32 mm, 0.25 pm film) Sử dụng nitrogen làm khí mang ở áp suất 8.7 psi Nhiệt độ buồng tiêm 250°C Nhiệt độ đầu dò 300°C Tỉ lệ chia dòng 1/20, thể tích tiêm 1 pl Chương trình nhiệt: Nhiệt độ đầu 45°c, tăng 2.5°c/phút đến 270°C sắc ký đồ thu được dùng để xác định hàm lượng (%) các cấu tử có trong mẫu cao chiết Ghi nhận khối phổ m/z trong khoảng 30-500, năng lượng ion hóa 70 eV Sử dụng sắc ký đồ của dãy đồng đẳng n-alkan để tính toán chỉ số số học, AI (Arithmetic Index) theo Adams, kết hợp với

Trang 28

thư viện phổ NIST 2008 của máy để nhận danh các cấu tử trong cao chiết

3.2.2.4 Khả o sát điề u kiệ n sử dụ ng enzyme thu dị ch chiế t giàu polyphenol a) Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần

Nguyên tẳc: dựa vào phản ứng tạo màu giữa hợp chất polyphenol với dung dịch muối tartrate

Hóa chất: Dung dịch muối tartrate: lg FeSO4 và 5g KNaQHịOô hòa tan trong nước cất và định mức lên lOOOml

Dung dịch đệm phosphate: bao gồm 85% (v/v) Na2HPO4 IM và 15% (v/v) KH2PO4 1M [24],

Thực hiện:

Hút lml dịch chiết lá vối, 4ml nước cất, 5ml dung dịch muối tartrate định mức lên 25ml bằng đệm phosphate Đo OD ở 540nm, mẫu trắng dịch lá vối được thay bằng nước cất Kết quả được tính toán như sau:

Trang 29

b) Khảo sát điều kiện:

Nguyên tẳc: Dịch chiết được khảo sát hàm lượng polyphenol theo các điều kiện thay đổi là nhiệt độ, tỷ

lệ nước nguyên liệu, nồng độ enzyme và thời gian phản ứng

Cách tiến hành: thực nghiệm ở với lOg nguyên liệu lá vối hên 1 mẫu, các điều kiện được thay đổi như

trong các bảng

Lô 1: thực hiện 06 thí nghiệm với điều kiện như bảng sau Xác định lượng enzyme thích hợp, tiếp tục

áp dụng cho các Lô thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm xác định lượng enzyme thích hợp

Mẩu (LÔI) Thông số cố định Thông số thay đổi: lượng enzyme (|11)

1 Nguyên liệu tươi: lOg Lượng nước là 20ml

Nhiệt độ: 50°C Thời gian phản ứng 120 phút

Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm xác định lượng nước thích hợp

1 Nguyên liệu tươi: lOg

Tỷ lệ enzyme (|11): xác định từ lô 1

Nhiệt độ: 50°C Thời gian phản ứng 120 phút

1 Nguyên liệu tươi: lũg

Tỷ lệ enzyme (p.1): xác đinh từ lô 1

30

Trang 30

Thực hiện tương tự với mẫu không có enzyme ở cùng điều kiện nhiệt độ, lượng nước, và thời gian

3.2.2.5 Phương pháp khảo sát một số hoạt tính sinh học

a) Khảo sát khả năng khảng oxy hóa:

Nguyên tắc: là phương pháp nhằm xác định khả năng kháng oxy hóa của hợp chất dựa trên khả năng

bắt gốc tự do của nó l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong methanol Khi cho mẫu thử vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc

tự do sẽ làm DPPH chuyển từ màu tím sang vàng Tín hiệu này được đo bằng máy đo quang Hoạt tính kháng oxy hoá của chất thử nghiệm được đánh giá thông qua phần trăm làm giảm giá trị hấp thụ ánh sáng của mẫu thử nghiệm so với đối chứng

Cách thực hiện:

- Chuẩn bị dung dịch DPPH 150 pM pha ưong methanol 80%, sử dụng ngay

- Cho mẫu vào ống theo bố trí thí nghiệm

- Thêm DPPH 150 pM vào ống cho đủ 3ml

Trang 31

- Đo độ hấp thu quang học A tại bước sóng 517 nm, sau 30 phút, thực hiện lặp lại 3 lần

Tính toán kết quả’

Phần trăm bắt gốc tự do DPPH được tính theo công thức:

Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH% =(A đối chứng -( A náu - A blank))* 100%/A đối chứng

A đái chứng' là độ hấp thu của dung dịch methanol và DPPH

A mẫu: là độ hấp thu của dung dịch mẫu và DPPH

A blank' là độ hấp thu của dung dịch methanol và mẫu

Cách tính giá trị IC50: Pha một giai mẫu có ít nhất 5 nồng độ, trong đó phải bao hàm nồng độ cho IC50

vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của IC theo nồng độ chất khảo sát bằng phần mềm Excel Từ đồ thị suy ra giá trị nồng độ có IC50 tức là IC50 (từ phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + bthếy =

50 vào để suy ra IC50)

Trang 32

Bố trí thí nghiệm:

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm kháng oxy hóa của dịch chiết

(111)

Nồng độ (mg/ml)

Trang 33

Cao chiết lá vối khá đặc nên được pha loãng và thực hiện theo bảng sau: Bảng 3.8: Bố trí thí nghiệm kháng oxy hóa của cao chiết

Mau Lượng mẫu đã pha loãng (pl) Nồng độ (pg/ml)

b) Phương pháp xác định khả năng khảng khuẩn của dịch chiết

Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [27,28], xem phụ lục 3

3.2.2.6 Phương pháp phân tích hàm lượng EGCG, cafein bằng HPLC

Nguyên tac: HPLC (High Performance Liquid Chromatography), sac ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật

sắc ký tách hỗn hợp các hợp chất để nhận dạng, định lượng và làm sạch các thành phần của hỗn hợp HPLC sử dụng các dạng pha tĩnh (chất hấp phụ) khác nhau trong cột, bơm đẩy pha động và các thành phần mẫu qua cột, đầu dò có khả năng nhận biết thời gian lưu đặc trưng của các thành phần, hàm lượng chất phân tích

Cách thực hiện: Dịch chiết lá vối được lọc qua giấy lọc giấy lọc cellulose 0.45 pm và bằng syringe 5ml

dùng 1 lần để loại bỏ các phần tử rắn Dung dịch lọc được chuyển vào các lọ chứa mẫu và được bơm tự động trực tiếp vào hệ thống phân tích HPLC Ket quả là giá trị được biểu diễn theo lượng chất được phân tích tính bằng mg trên g mẫu dịch chiết lá vối khô (mg/g) [6],

Hệ thống HPLC được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC Agilent trong đó sự phân tách

Trang 34

các thành phần hóa học được thực hiện trên cột HPLC

- Cột pha đảo ZORBAX Eclipse XDB - C18 (150 X 4.6mm, 5pm)

3.2.2.7 Thu cao chiế t ỉá vối

Nguyên tẳc: làm giảm hàm lượng nước của dịch chiết bằng máy cô quay

Cách thực hiện; Xử lý lá vối thu cao chiết ở điều kiện như mục 3.2.2.4 Khảo sát điều kiện sử dụng

enzyme thu dịch chiết giàu polyphenol Dịch chiết được cô quay ở điều kiện nhiệt độ tương ứng, thu được cao chiết nước Thực hiện tương tự cùng điều kiện với dịch chiết không enzyme

Hình 3.1: Máy cô quay

3.2.2.8 Phương pháp chưng cấ t tinh dầu

Nguyên tẳc: Dựa trên nguyên tắc cất một hỗn hợp 2 chất lỏng bay hơi được không trộn lẫn vào nhau

(nước và tinh dầu) Khi áp suất hơi bão hoà bằng áp suất khí quyển, hỗn hợp bắt đầu sôi và hơi nước kéo theo hơi tinh dầu [1],

Cách thực hiện; Cho 200g lá vối tươi xay nhuyễn và nước vào bình cầu, đun sôi bằng bếp đun Tinh dầu

được chưng cất kéo hơi nước như hệ thống chưng cất tinh dầu Dịch cất được hứng vào một ống chia độ,

sử dụng xylen để giữ lại tinh dầu, pha nước được chảy tự động ưử lại bình cất Thực hiện tương tự với lá

Trang 35

vối có xử lý enzyme hỗn hợp 200g lá vối tươi nguyên liệu với điều kiện xử lý enzyme như mục 3.2.2.4

đã xác định, tỷ lệ nguyên liệu/nước là ‘/2, nhiệt độ là 50°C, nồng độ enzyme 12pl/g nguyên liệu phản ứng trong 2h

Nước ra

) õng ngưng hơi c J Nước vào

Trang 36

3.2.2.9 Thửnghiệm sản xuất nước uống ỉá vối à) Quy trình thực nghiệm sản xuất đồ uống đóng chai từ dịch chiết lá vối bang enzyme:

Trang 37

b) Thuyết minh quỵ trình:

Lá vối tươi được chọn kỹ các là không quá già, không quá non, không sâu bệnh rửa sạch để ráo nước Nước được đổ vào nồi và gia nhiệt lên nhiệt độ thích hợp Lá được xay nhuyễn và enzyme được cho vào nồi, khuấy nhẹ nhàng đảo trộn nguyên liệu tốt Sau thời gian xử lý với enzyme, toàn

bộ hỗn hợp được lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lá vối trong

Đường saccharose được chọn mua từ thương hiệu uy tín như đường Biên Hòa Nấu syrup từ đường với hàm lượng đường tăng dần đến khi đường không tan nữa, giữ nhiệt độ khoảng 70-80°C, khuấy nhẹ đều đến khi đường tan hết, làm nguội, lọc qua vải lọc nếu dịch đường không trong Phối chế dịch chiết và syrup đường theo các tỷ lệ đường thích hợp Hỗn hợp được thanh trùng

ở 60°C trong 15 phút Chiết rót vào chai và đóng nắp Điều vị bằng acid citric thực phẩm với hàm lượng hợp lý

c) Đánh giá cảm quan sản phẩm:

Các chỉ tiêu cảm quan được xác định bằng phương pháp cho điểm, phương pháp lượng hóa chất lượng bằng điểm số dựa trên cảm nhận về ngoại quan, trạng thái, mùi, vị của sản phẩm Phương pháp đánh giá dựa trên mức độ cảm nhận sản phẩm dựa theo thang điểm từ 1 đến 9, với các mức độ yêu thích sản phẩm tăng dần

Mẩu nước uống được phục vụ cho người thực hiện cảm quan ở các hàm lượng syrup (v/v)

từ 8%, 10%, 12%, 14% và dịch chiếửnước được pha loãng ở các tỷ lệ (v/v) 1/3, 1/4, 1/5, 1/6 như trong bảng, một mẫu được cảm quan bởi 10 người

Bảng 3.9: Cảm quan nước uống lá vối

Định dạng
Số trang	75
Dung lượng	1,76 MB
File đính kèm	123.rar (12 MB)