Nghiên cứu trình bày việc tiến hành thu nhận và khảo sát một số hoạt tính sinh học của sophorolipids từ quá trình lên men chủng Candida bombicola sử dụng mỡ cá tra - nguồn phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến thủy sản.
Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SOPHOROLIPIDS TỪ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHỦNG CANDIDA BOMBICOLA SỬ DỤNG MỠ CÁ TRA Nguyễn Thanh Loan*, Nguyễn Phương Huyền, Phạm Hồng Hạnh, Lê Thị Hằng Viện Kỹ thuật Công nghệ Cao, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành *Tác giả liên hệ: thanhloannguyen1995@gmail.com TÓM TẮT Sophorolipids (SLs) dạng chất hoạt động bề mặt sinh học thuộc nhóm glycolipid, tổng hợp từ trình lên men vi sinh vật không gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm sản xuất từ nguồn phụ phẩm ngành khác Trong nghiên cứu này, tiến hành thu nhận khảo sát số hoạt tính sinh học sophorolipids từ trình lên men chủng Candida bombicola sử dụng mỡ cá tra - nguồn phụ phẩm ngành công nghiệp chế biến thủy sản Kết cho thấy sản lượng SLs cao thu nhận vào ngày lên men thứ với nhiệt độ thích hợp 25oC, 10% glucose, 10% mỡ cá tra pH 6,0 Khảo sát hoạt tính sinh học SLs cho thấy SLs có khả kháng chủng vi khuẩn S aureus, E coli P aeruginosa Bên cạnh đó, SLs cho thấy khả bắt gốc tự với IC50= 4,45 mg/ml cho khả tạo nhũ với số chất kỵ nước Từ khóa: Candida bombicola, Sophorolipids, chất hoạt động bề mặt sinh học, cá tra THE STUDY OF PRODUCTION AND BIOLOGICAL ACTIVITIES OF SOPHOROLIPIDS FROM Candida bombicola USING CATFISH FAT Nguyen Thanh Loan*, Nguyen Phuong Huyen, Pham Hong Hanh, Le Thi Hang Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University *Corresponding author: thanhloannguyen1995@gmail.com ABSTRACT Sophorolipids (SLs) are type of biosurfactants belong to glycolipids group which is synthesized from the fermentation process by non-pathogenic microorganisms, easily to recover the products and can be produced from the by-products in other fields In this study, we produced and surveyed some biological activities of sophorolipids from Candida bombicola using catfish fat – the by-product of the seafood processing industry The results showed that the highest SLs yield was obtained on the 7th fermentation day at 25°C, 10% glucose, 10% of catfish fat and pH 6,0 In addition, SLs exhibited the ability to resistant S aureus, E coli and P aeruginosa SLs also showed free radical scavenging with IC50= 4,45 mg/ml and the ability to emulsify with some hydrophobic agents Keywords: Candida bombicola, Sophorolipids, biosurfactant, Pangaius hypophthalmus TỔNG QUAN Giới thiệu chung sophorolipids (SLs) Sophorolipids (SLs) glycolipid ngoại bào tổng hợp từ trình lên men chủng nấm men Candida bombicola, C apicola, C bogoriensis, Wickerhamiella domericqiae Sophorolipids phân tử lưỡng cực gồm nhóm disaccharide sophorose liên kết với gốc hydroxyl carbon kế cuối chuỗi acid béo C16 - C18 Hai dạng cấu trúc SLs dạng acid tự dạng vịng lactone (Hình 1) SLs acidic hình thành cacbonxyl acid béo dạng tự SLs lactonic hình thành ester hố bên cacbonxyl acid béo nhóm spophorose vị trí 4” 6’ hay 6” Sự khác biệt cấu trúc hoá học dẫn tới khác biệt đặc tính lý hố SLs lactonic có hoạt tính kháng khuẩn, giảm sức căng bề mặt SLs acidic có khả tạo bọt có tính tan tốt 433 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Hình Cấu trúc dạng hoá học lactonic sophorolipid acid sophorolipid Hiện nay, SLs nhận quan tâm glucose, g yeast extract, g KH2PO4, 0,5 g nghiên cứu nhà khoa học nhiều MgSO4, 0,1 g NaCl, 0,1 g CaCl2, 0,7 g khả ứng dụng nhiều lĩnh vực peptone 10% (v/v) mỡ cá tra 100 ml môi sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, mỹ trường lên men chứa bình erlen phẩm, dược phẩm, dệt may, xây dựng 250 ml, bổ sung 5% (v/v) chủng giống vào đặc tính ưu việt chúng so với chất hoạt môi trường tiến hành lên men động bề mặt hoá học khả phân huỷ ngày 25oC lắc 180 vòng/phút sinh học tốt có độc tính thấp thân Phương pháp tách chiết thu nhận SLs thiện với môi trường Bên cạnh SLs cịn Dịch sau lên men tiến hành ly tâm thu sinh sản xuất từ nguyên liệu rẻ tiền khối tế bào, dịch phần cặn sinh khối tái sử dụng lại Việc nghiên cứu sản chiết với n-hexane tỷ lệ 1:1 xuất SLs khơng góp phần giải đáng (v/v) nhằm loại bỏ dầu thừa cịn sót lại kể vấn đề cạn kiệt nguồn nguyên liệu dầu mỏ q trình lên men Sau đó, dịch phần mà tận dụng nguồn phế thải từ cặn sinh khối chiết tiếp với ngành cơng nghiệp khác góp phần cải ethyl acetate tỷ lệ 1:1 (v/v) để thu nhận SLs thiện môi trường Trong nghiên cứu này, Phần dung môi sau chiết với ethyl acetate tận dụng nguồn phụ phẩm mỡ cá có chứa SLs đem quay nhiệt độ tra cho lên men sản xuất SLs từ chủng 40oC nhằm loại bỏ dung môi, thu nhận sản Candida bombicola khảo sát số hoạt phẩm SLs tính sinh học SLs thu nhận Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Các chủng vi khuẩn nuôi cấy VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP mơi trường thích hợp có nồng độ tác Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm men Candida bombicola ATCC nhân kháng khuẩn khác Nồng độ thấp 22214 Các dung tách chiết hexane, tác nhân kháng khuẩn xác methanol, ethyl acetate cung cấp định có tác dụng ức chế hồn cơng ty hóa chất Xilong (Trung Quốc) Mỡ toàn phát triển vi khuẩn cá tra cung cấp Công ty Cổ phần Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Xuất nhập Thủy sản AGIFISH An Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Giang cao chiết dựa phương pháp khuếch tán đĩa thạch Aibinu cộng Phương pháp nghiên cứu (2007) Phương pháp xử lý mỡ cá tra Nguồn nguyên liệu mỡ cá tra sau thu Phương pháp DPPH nhận từ nhà máy trải qua q trình Thí nghiệm tiến hành theo phương tiền xử lý, loại bỏ tạp chất, cặn trước tiến pháp Von Gadow, Joubert Hansmann hành lên men thu nhận (1997) Phương pháp hoạt hóa chủng nấm men Phương pháp xác định số nhũ hóa Chủng nấm men C bombicola hoạt hóa Chỉ số nhũ hóa sau 24 tính theo môi trường MGYP (0,3% malt extract, công thức: 1% glucose, 0,3% yeast extract, 0,5% E24 = 𝐶ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐ủ𝑎 𝑙ớ𝑝 𝑛ℎũ 𝑡ươ𝑛𝑔 𝑡ạ𝑜 𝑡ℎà𝑛ℎ × 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑑ị𝑐ℎ peptone) 48 25oC lắc 180 100 vòng/phút Phương pháp xử lý số liệu Phương pháp lên men Môi trường lên men sản xuất SLs (g/l): 100 g Các số liệu tính tốn Excel xử 434 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học lên men chủng C bombicola với nguồn chất mỡ cá tra bổ sung chủng giống với tỷ lệ 5% (v/v) Kết khảo sát ảnh hưởng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến yếu tố đến sản lượng SLs thể trình lên men SLs thu nhận từ trình bảng Bảng Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng SLs Các yếu tố khảo sát Kết Thời gian lên men ngày Nhiệt độ lên men 25oC pH môi trường 6,0 Hàm lượng glucose 10% Hàm lượng mỡ cá tra 10% Kết khảo sát cho thấy điều kiện tối ưu (2004) cho sản xuất SLs sử dụng mỡ cá tra sau Hoạt tính kháng khuẩn SLs ngày lên men 25oC, pH 6.0 nồng độ Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chất 10% Kết thu giống với phương pháp khuếch tán đĩa thạch kết nghiên cứu Daverey SLs mô tả Bảng Pakshirajan (2009), Solaiman cộng Bảng Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu đĩa thạch Nồng độ ức chế Đường kính vịng STT Chủng vi khuẩn tối thiểu kháng khuẩn (mm) (mg/ml) Staphylococcus aureus 21 ± 2,3 4,5 Pseudomonas aeruginosa 11 ± 0,5 10 lý phần mềm SigmaPlot Eschericha coli 10 ± 0,3 Bacillus subtilis Hỗn hợp SLs thu có khả kháng lại chủng vi khuẩn thuộc Gram (+) mạnh so với chủng vi khuẩn thuộc Gram () Về nồng độ ức chế tối thiểu, SLs thu có hoạt tính ức chế mạnh là S aureus (4,5 mg/ml) yếu P aeruginosa E coli (10 mg/ml) Mặc dù hoạt tính kháng khuẩn SLs nghiên cứu thấp, nhiên cho thấy tiềm ứng dụng SLs chất sát trùng, dung dịch làm trái rau kết hợp với kháng sinh để tăng cường hiệu điều trị Xác định khả kháng oxy hoá Để khảo sát khả kháng oxy hố SLs, thí nghiệm DPPH thực Kết thể Hình 10 14,5 ± 0,5 Theo biểu đồ cho thấy khả bắt gốc tự DPPH hỗn hợp SLs thu tăng dần theo nồng độ SLs từ 0,078 – 20 mg/ml Ở nồng độ 20 mg/ml SLs có khả kháng oxy hóa 84,32% Nồng độ SLs thu ức chế gốc tự DPPH 50% (IC50) xác định 4,4531 mg/ml Từ kết cho thấy SLs có tiềm ứng dụng ngành cơng nghiệp mỹ phẩm với cơng dụng trẻ hố da Hoạt tính nhũ hoá SLs Khả tạo nhũ coi hoạt tính chất hoạt động bề mặt Kết thấy nhiệt độ 30oC - 10 phút, hỗn hợp SLs thu tạo lớp nhũ tương có khả nhũ hoá vài chất khảo sát Hỗn hợp SLs thu có khả tạo nhũ mạnh dầu hạt cải yếu tween Điều chứng minh khả tạo nhũ SLs phụ thuộc vào tương tác trực tiếp giữ phần kị nước phần ưa nước Hình Khả bắt gốc tự DPPH 435 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Bảng Kết nhũ hoá SLs thu với chất kị nước Chỉ số nhũ hoá STT Cơ chất kị nước (%) Xăng 37,39% ± 1,08 Dầu hạt cải 61,67% ± 1,80 Dầu đậu nành 63,23% ± 1,82 Tween 24,25% ± 1,76 Như vậy, hỗn hợp SLs thu có khả nhũ hố số chất kị nước dầu đậu nành, dầu hạt cải, xăng Khả nhũ hoá SLs thu có số (E24) = 24,25% 63,23% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kỷ yếu khoa học Bước đầu nghiên cứu thu nhận sophorolipids từ trình lên men chủng C bombicola sử dụng nguồn nguyên liệu mỡ tra glucose quy mơ phịng thí nghiệm, thu nhận sản lượng SLs cao 1,05 g/100 ml sau ngày lên men 25oC, pH = 6, tốc độ lắc 180 vòng/phút SLs thu nhận có số hoạt tính : khả kháng số vi khuẩn S aureus, E coli P aeruginosa Bên cạnh đó, SLs cho thấy khả bắt gốc tự với IC50= 4,45 mg/ml cho khả tạo nhũ với số chất kỵ nước như: xăng, dầu hạt cải, dầu đậu nành tween Kết cho thấy SLs có tiềm ứng dụng lĩnh vực mỹ phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO ASHBY R.D, NUNEZ A, SOLAIMAA D.K.Y AND FOGLIA T.A (2005), “Sophorolipid biosynthesis from a biodiesel co-product stream”, J Am Oil Chem Soc, 82, 625-630 DAVEREY A AND PAKSHIRAJAN K (2009), “Production, characterization, and properties of sophorolipids from the yeast Candida bombicola using a low-cost fermentative medium”, Appl Biochem Biotechnol, 158: 663-674 DEVELTER D AND LAURYSSEN L.M.L (2010), “Properties and industrial applications of sophorolipids”, Eur J Lipid Sci Technol, 112, 628-638 FELSE A.P, SHAH V, CHAN J, RAA K.J AND GROSS R.A (2007), “Sophorolipid biosynthesis by Candida bombicola from industrial fatty acid residues”, Enzyme Microb Technol, 40(2), 316-323 HIRATA Y, RYU M, ODA Y, IGARASHI K, NAGATSUKA A, FUTURA T (2009), “Novel characteristics of sophorolipids, yeast glycolipid biosurfactants, as biodegradable lowfoaming surfactants”, J Biosci Bioeng, 108, 142-146 KIM H S, KIM Y B , LEE B S, KIM E K (2005), “Sophorolipid production by Candida bombicola ATCC 22214 from a corn-oil processing byproduct”, J Microbiol Biotechnol, 15: 55-58 LÊ VĂN TRỊ, PHẠM THỊ THU HIỀN, NGUYỄN THỊ BÍCH LIÊN, VŨ THỊ MÌNH ĐỨC (2008), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 46(4), 49-55 SOLAIMAN D K Y, ASHBY R D, NUNEZ A, FOGLIA T A (2004), “Production of sophorolipids by Candida bombicola grown on soy molasses as substrate”, Biotechnol Lett, 26: 1241-124 TAKAHASHI M, MORITA T, WADA J, HIROSE N, FUKUOKA T, IMURA T AND KITAMOTO D (2011), “Production of sophorolipid glycolipid biosurfactants from sugarcane molasses using Starmerella bombicola” NBRC 10243, J Oleo Sci, 60(5), 267-273 436 ... hoá SLs thu có số (E24) = 24,25% 63,23% KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kỷ yếu khoa học Bước đầu nghiên cứu thu nhận sophorolipids từ trình lên men chủng C bombicola sử dụng nguồn nguyên liệu mỡ tra glucose... tận dụng nguồn phụ phẩm mỡ cá có chứa SLs đem cô quay nhiệt độ tra cho lên men sản xuất SLs từ chủng 40oC nhằm loại bỏ dung môi, thu nhận sản Candida bombicola khảo sát số hoạt phẩm SLs tính sinh. .. SLs sử dụng mỡ cá tra sau Hoạt tính kháng khuẩn SLs ngày lên men 25oC, pH 6.0 nồng độ Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn chất 10% Kết thu giống với phương pháp khuếch tán đĩa thạch kết nghiên cứu