Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men chủng candida bombicola​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPIDS QUA QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG Sinh viên thực MSSV: 1151110044 : HUỲNH THỊ DIỄM TRINH Lớp: 11DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2015 LỜI CAM ĐOAN Người thực đề tài: Huỳnh Thị Diễm Trinh Sinh viên trường: Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh Khoa: Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi Trường Ngành: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 11DSH01 MSSV: 1151110044 Người thực đề tài xin cam đoan nội dung đồ án tốt nghiệp người thực đề tài làm Viện Sinh học Nhiệt đới, hướng dẫn TS Nguyễn Hoàng Dũng Các số liệu thu thập kết phân tích trung thực, không chép từ báo cáo công bố trước Một số nội dung đồ án tốt nghiệp có tham khảo sử dụng liệu, thông tin đăng tải trang web, tác phẩm, báo theo danh mục tài liệu tham khảo đồ án Nếu có chép khơng trung thực báo cáo này, người thực đề tài xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước khoa Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trước ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Tp Hồ Chí Minh Ngày ….tháng….năm… Sinh viên thực (ký ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, anh chị bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Các thầy Bộ môn khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường thầy cô trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, trực tiếp giảng dạy truyền đạt kiến thức cho học trường Thầy Nguyễn Hồng Dũng, phịng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, người thầy, người anh tận tình hướng dẫn ln động viên tơi q trình thực đồ án tốt nghiệp Thầy Hồng Quốc Khánh thầy Ngơ Đức Duy, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Chị Nguyễn Lương Hiếu Hòa, chị Lê Quỳnh Loan, bạn Trần Lê Việt Hà, bạn Lê Văn Tâm bên cạnh giúp đỡ, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm niềm vui nỗi buồn Tất anh chị, bạn nghiên cứu phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới nhiệt tình giúp đỡ dạy cho nhiều điều suốt nghiên cứu Tập thể lớp 11DSH01, trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, sát cánh bên suốt năm tháng giảng đường đại học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn Ba, Mẹ em gia đình chăm sóc, lo lắng dõi theo bước Sẵn sàng bên cạnh động viên khích lệ lúc khó khăn nhất, để vững tin bước tiếp đường chọn Huỳnh Thị Diễm Trinh MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm men 1.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào nấm men 1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men 1.1.3 Sinh sản nấm men 1.1.4 Ứng dụng nấm men 1.1.5 Sơ lược nấm men Candida bombicola 1.2 Tổng quan chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) 1.2.1 Khái quát chất hoạt động bề mặt sinh học 1.2.2 Khái quát sophorolipids (SLs) 10 1.2.2.1 Giới thiệu chung SLs 10 1.2.2.2 Cấu trúc hóa học SLs 11 1.2.2.3 Sinh tổng hợp SLs 12 1.2.2.4 Hoạt tính SLs 13 1.2.2.5 Ứng dụng SLs 15 i 1.3 Tình hình nghiên cứu SLs 17 1.3.1 Nước 17 1.3.2 Trong nước 18 1.4 Thực trạng nguồn dầu thải Việt Nam 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 20 2.2.3 Hóa chất 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Tăng sinh bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214 23 2.3.2 Nuôi cấy thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 23 2.3.3 Định tính SLs thu kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 25 2.3.4 Xác định thành phần SLs thu kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 26 2.3.5 Khảo sát số hoạt tính SLs thu 27 2.3.5.1 Khả nhũ hóa 27 2.3.5.2 Khả kháng oxy hóa 28 2.3.5.3 Khả kháng khuẩn 29 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải glucose 32 3.2 Kết ảnh hưởng thời gian ni lên q trình thu nhận Sophorolipids 32 3.3 Kết định tính SLs thu kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 33 3.4 Kết khảo sát thành phần SLs thu kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 35 ii 3.5 Kết khảo sát khả nhũ hóa SLs thu 37 3.6 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa SLs thu 37 3.7 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu 38 3.7.1 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu phương pháp khuếch tán đĩa thạch 38 3.7.2 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 39 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CHĐBM Chất hoạt động bề mặt CHĐBMHH Chất hoạt động bề mặt hóa học CHĐBMSH Chất hoạt động bề mặt sinh học CMC Critical micelle concentration DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl HPLC High performance liquid chromatography IC Inhibitory concentration IC50 Inhibitory concentration 50% OD Optical density (mật độ quang học) LB Luria bertani MIC Minimum inhibitory concentration SLs Sophorolipids SDO Soybean dark oil TLC Thin layer chromatography YM Yeast malt medium iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại CHĐBMSH chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình Bảng 1.2 Khả nhũ hóa SLs sản xuất C.bombicola với chất kỵ nước 14 Bảng 3.1 Kết khảo sát khả nhũ hóa hỗn hợp SLs thu 37 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu đĩa thạch 39 Bảng 3.3 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) v 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tế bào nấm men C.bombicola Hình 1.2 Cấu trúc sophorolipid 11 Hình 1.3 Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids 12 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 22 Hình 2.2 Quy trình thu nhận sophorolipids 24 Hình 2.3 Quy trình phân tích mẫu SLs sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .27 Hình 2.4 Cơ chế phản ứng DPPH 28 Hình 3.1 Sophorolipids thu 32 Hình 3.2 Biểu đồ sản lượng SLs thu thời gian lên men lên men khác 33 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu SLs thu 34 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu SLs thu kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao .36 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate 36 Hình 3.6 Biểu đồ thể khả bắt gốc tự DPPH hỗn hợp SLs thu 38 Hình 3.7 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs thu đĩa thạch 39 vi MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) đóng vai trị quan trọng sống ngày người Chúng có mặt hầu hết sản phẩm thiết yếu, ngành cơng nghiệp, góp phần phát triển mang lại lợi nhuận vô to lớn cho ngành cơng nghiệp hóa chất Chất hoạt động bề mặt nhóm hóa chất cơng nghiệp sản xuất nhiều nay, với tổng sản lượng toàn giới vượt 15 triệu tấn/năm tăng dần theo thời gian Chất hoạt động bề mặt ứng dụng nhiều lĩnh vực chất tẩy rửa, mỹ phẩm, dược phẩm, thưc phẩm, nông nghiệp, sản xuất giấy, tăng hiệu suất thu hồi dầu thô… Phần lớn chất hoạt động bề mặt sản xuất đường tổng hợp hóa học từ dầu mỏ Việc thường gây ảnh hưởng xấu đến môi trường khả phân hủy sinh học chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) Vì vậy, việc tổng hợp ứng dụng chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học quan tâm nhiều năm gần Trong sophorolipids (SLs) – dạng chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) thuộc nhóm glycolipid - xem có triển vọng nhiều nguyên nhân: Vi sinh vật sản xuất tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm hóa Những đặc tính ưu việt SLs so với chất hoạt động bề mặt học khả phân hủy sinh học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với mơi trường SLs có hoạt tính chun biệt điều kiện khác nhiệt độ, pH nồng độ muối cao Hiện nay, vấn đề đặt việc sản xuất sophorolipids phương pháp sinh học chi phí sản xuất cịn cao khơng thể cạnh tranh với chất hoạt động bề mặt hóa học Để giải vấn đề trên, hướng sản xuất sophorolipds từ nguyên 44 [30] Magdalena P P, Grazyna A.P, Zofia P.S, Swaranjit S.C (2011) Environmental applications of biosurfactants: Recent Advances, Int J Mol Sci, 12, 633-654 [31] Mager H, Rothlisberger R, Wzgner F (1987) Use of sophorolse-lipid lactone for the treatment of dandruffs and body odeur, European patent 0209783 [32] Marchal R, Lemal J, Sulzer C, Davila AM (1999) Production of sophorolipid acetate acids from oils or esters, US patent 5900366 [33] Maria S.K and Irena B.I (2010) Rhodococcus biosurfactants: Biosynthesis, Properties and Potential Application Bio Rhodococcus, 16, 291-313 [34] (2001) Masaru K, Takashi N, Yoji A, Kazuo N, Tatsu N, Sumiko T, Jotaro N Composition for high-density cold storage transportation, Japanese patent 2001131538 [35] Morya VK, Park JH, Kim TJ, Jeon S and Kim EK (2013) Production and characterization of low molecular weight sophorolipid under fed-batch culture, Bioresource Technology, 143, 282-288 [36] (2008) Muthuswami K, Gopalkrishnan S, Ravi T.K and Sivachidambaram P [37] Otto R.T, Daniel H.J, Pekin G, Pekin et al (1999) Production of sophorolipids from whey, Appl Biochem Biotechnol, 52, 495-501 [38] Parul Dubey, Kaliaperumal Selvaraj, Asmita Prabhune (2013) Sophorolipids: in self assembly and nanomaterial synthesis, World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 2, (3), 1107-1133 [39] Pellecier F, André P (2004) Cosmetic use of sophorolipids as subcutaneous adipose cushion regulation agents and slimming application, World patent 2004/108063 [40] Pierce D, Heilman T.J (1998) Germicidal composition, World patent 98/16192 45 [41] Price NP, Ray KJ, Vermillion KE, Dunlap CA, Kurtzman CP (2012) Structural characterization of novel sophorolipid biosurfactants from a newly identified species of Candida yeast, Carbohydrate Research, 348, 33-41 [42] Rosenberg E and Ron EZ (1999) High and low molecular mass microbial surfactants, Appl Microbiol Biotechnol, 52, 154-162 [43] Shah V, Doncel GF, Seyoum T, Eaton KM, Zalenskaya I, Hagver R, Azim A, Gross R (2005) Sophorolipids, microbial glycolipids with anti – human immunodeficiency virus and sperm – immobilizing activities, Antimicrob Agents Chemother, 49, 4093-4100 [44] Shal V, Mia J and Daniel B (2007) Utilization of Restaurant Waste Oil as a Precursor for Sophorolipid Production, Department of Biology, Dowling College, Idle Hour Blvd, Oakdale, New York 11769 [45] Shao L, Song X, Ma X, Qu Y (2012) Bioactivities of Sophorolipid with Different Structures Against Human Esophageal Cancer Cells, Journal of Surgical Research, 173, 286-291 [46] Solaiman D.K.Y (2005) Applications of microbial surfactants, Inform, 16, 408-410 [47] Spencer JFT, Gorin PAJ and Tulloch AP (1970) Torulopsis bombicola sp N Antonie Van Leeuwenhoek, 36, 129-133 [48] Tulloch AP and Spencer JFT (1968) Fermentation of long chain compounds by Torulopsis apicola IV Products from estersand hydrocarbons with 14 and 15 carbon atoms and from methyl palmitoleate, Can J Chem, 46, 1523-1528 [49] Van Bogaert INA, Zhang J and Soetaert W (2011) Microbial synthesis of sophorolipids, Process Biochem, 46, 821-833 [50] Van Bogaert IN, Saerens K, De-Muynck C, Develter D, Soetaert W, Vandamme E.J (2007) Microbial production and application of sophorolipids, Appl Microbiol Biotechnol, 76, 23-34 46 [51] Yoo DS, Lee BS, Kim EK (2005) Characteristicộng of microbial biosurfactant as an antifungal agent against plant pathogenic fungus, J Microbiol Biotechnol, 15, 1164-1169 Tài liệu Internet [52] http://bioinformaticộng sự.psb.ugent.be/genomes/ [53]http://tietkiemnangluong.com.vn/tin-tuc/khoa-hoc-cong-nghe/t11930/biodieseltu-dau-ran-phe-thai.html 47 PHỤ LỤC Phụ lục A : Bảng kết khảo sát hoạt tính sophorolipids Lƣợng sophorolipids thu đƣợc theo thời gian Ngày Lần 1,783 1,849 2,070 10 1,748 Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch Vi khuẩn khảo sát S.aureus B.subtilis P.aeruginosa Kết khảo sát khả kháng khuẩn SLs phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ SLs Ban đầu (mg/ml) Lần Đối chứng (-) 2,5 1,25 0,625 Đối chứng (+) Nồng độ SLs (mg/ml) Đối chứng (-) 0,8 0,6 0,4 Đối chứng (+) Kết khảo sát khả nhũ hóa sophorolipids Lần Xăng 22 Dầu 35 hạt cải Dầu 35 nành Kết khảo sát khả kháng Nồng độ SL (mg/ml) control 0,078 0,156 0,3125 0,625 1,25 2,5 10 20 Phụ lục B: Các loại môi trƣờng Môi trƣờng giữ giống C.bombicola (Pre-culture media-YM media) - Glucose % - Yeast extract 0,3 % - Malt extract 0,3 % - Peptone 0,5 % Môi trƣờng nuôi cấy C.bombicola sản xuất sophorolipids (sophorolipid production media) - Oil 10 % (dầu thải nhà hàng KFC) - Glucose 10 % - Yeast extract 0,5 % - KH2PO4 0,1 % - MgSO4.7H2O 0,05 % - CaCl2.2H2O 0,01 % - NaCl 0,01 % - Peptone 0,07 % - Tỷ lệ cấy giống % (v/v) Môi trƣờng LB (Luria Bertani) - Tryptone % - Yeast extract 0,5 % - NaCl % Môi trƣờng LB - thạch (Luria Bertani agar) - Tryptone % - Yeast extract 0,5 % - NaCl % - Agar % Phụ lục C: Một số hình ảnh thiết bị thí nghiệm Dịch lên men chủng C.bombicola sau ngày Sản lượng sophorolipids theo thời gian lên men Thí nghiệm xác định khả chống oxy hóa sophorolipids Hệ nhũ tương sophorolipids chất kỵ nước Máy sắc ký lỏng hiệu cao Các loại đầu dò kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao Máy cô quay chân không ... đó, đề tài nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua trình lên men chủng Candida bombicola từ nguồn dầu thải thực Tình hình nghiên cứu Một số cơng trình nghiên cứu thu nhận SLs từ trình lên men C.bombicola... dầu thải Khảo sát số hoạt tính sophorolipids Nhiệm vụ nghiên cứu - Lên men chủng C.bombicola ATCC 22214 môi trường chứa glucose dầu thải - Thu nhận sophorolipids từ dịch lên men - Định tính xác... nhiễm dầu Tuy nhiên, cơng trình liên quan đến việc sản xuất ứng dụng SLs chưa nghiên cứu thấu đáo Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua trình lên men chủng C.bombicola ATCC 22214