Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN KIM HOÀN NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN EPCA BẰNG CÔNG NGHỆ GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Kim Hoàn NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN EPCA BẰNG CÔNG NGHỆ GEN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ QUANG HUẤN Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT 1.1.1 Giới thiệu chung tuyến tiền liệt 1.1.2 Bệnh ung thƣ tuyến tiền liệt 1.1.2.1 Khái niệm ung thư tuyến tiền liệt 1.1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.2.4 Các kĩ thuật chẩn đoán bệnh 1.1.3 Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ tiền liệt tuyến 1.1.3.1 Điều trị phẫu thuật 1.1.3.2 Phương pháp xạ trị 1.1.3.3 Hormone điều trị UTTLT 1.1.3.5 Phương pháp xạ trị 1.1.3.6 Phương pháp sử dụng thảo dược hay phươn 1.2.KHÁNG NGUYÊN 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Kháng nguyên EPCA 1.3.KHÁNG THỂ 1.3.1 Cấu trúc 1.3.2 Mảnh kháng thể 1.3.3 Kháng thể tái tổ hợp 1.3.4 Kháng thể đặc hiệu loại kháng nguyên 1.3.4.1 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư 19 1.3.4.2 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên cụm biệt hóa 20 1.3.4.3 Kháng thể đặc hiệu thụ thể bề mặt tế bào 20 1.3.4.4 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tế bào gốc 21 1.3.4.5 Kháng t hể đặc hiệu yếu tố phát triển 21 1.3.4.6 Kháng thể đặc hiệu cytokine 21 1.3.4.7 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên virus 22 1.3.5 Các phƣơng pháp tạo kháng thể 22 1.3.5.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma 22 1.3.5.2 Phương pháp tái tổ hợp 23 1.3.5.3 Phương pháp phage display 25 1.4 THƢ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THẾ 25 1.4.1 Giới thiệu chung 25 1.4.2 Thực khuẩn M13 27 1.4.2.1 Cấu tạo 27 1.4.2.2 Chu kì sống 29 1.4.2.3 Vector tách dòng phagemid 30 1.4.3 Các kiểu thƣ viện kháng thể thực khuẩn thể 31 1.4.3.1 Thư viện tự nhiên 31 1.4.3.2 Thư viện sau miễn dịch 32 1.4.3.3 Thư viện tổng hợp 33 1.4.4 Tạo thƣ viện kháng thể bộc lộ thực khuẩn thể 34 1.4.5 Sàng lọc thƣ viện kháng thể bộc lộ thực khuẩn thể 36 1.4.5.1 Khuếch đại thư viện tạo phage 36 1.4.5.2 Cho phage tiếp xúc với đích 36 1.4.5.3 Rửa tách 38 1.4.5.4 Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ 38 CHƢƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 VẬT LIỆU 39 2.1.1 Sinh phẩm 39 2.1.2 Hóa chất 39 2.1.3 Trang thiết bị 39 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Phƣơng pháp nhân gen kĩ thuật PCR 40 2.2.2 Phƣơng pháp cắt gắn DNA 41 2.2.3 Phƣơng pháp tế bào khả biến E.coli TG1 42 2.2.4 Phƣơng pháp biến nạp 42 2.2.5 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật 43 2.2.6 Phƣơng pháp giữ chủng 43 2.2.7 Phƣơng pháp điện di gel agarose 43 2.2.8 Xác định trình tự DNA 44 2.2.9 Chuẩn bị thƣ viện phage 45 2.2.10 Bộc lộ mảnh kháng thể scFv phage M13 46 2.2.11 Phƣơng pháp ELISA 46 CHƢƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Kết nhân gen mã hóa mảnh kháng thể scFv PCR 49 3.2 Kết tạo vector tái tổ hợp pHEN2-scFv 50 3.3 Chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT 52 3.4 Xác định trình tự gen scFv phagemid tái tổ hợp 54 3.5 Kết bộc lộ mảnh kháng thể scFv phage M13 55 3.6 Kết phản ứng ELISA 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN STT 10 11 12 LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, ung thƣ đƣợc coi bệnh đe dọa nguy hiểm trầm trọng ngƣời Trong số đó, ung thƣ tuyến tiền liệt loại ung thƣ thƣờng gặp có tỉ lệ tử vong cao nam giới Ung thƣ tuyến tiền liệt gây ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe sinh hoạt nam giới, nhƣng đƣợc phát sớm điều trị kịp thời hạn chế đƣợc nhiều tác hại bệnh Ngày với phát triển y học sinh học phân tử, có thêm nhiều phƣơng pháp chẩn đốn nhƣ điều trị Một phƣơng pháp hữu hiệu phƣơng pháp sử dụng kháng thể phagescFv đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tuyến tiền liệt chẩn đốn điều trị cách nhanh chóng hiệu Kháng thể scFv chuỗi hợp vùng biến thiên chuỗi nặng (V H) vùng biến thiên chuỗi nhẹ (V L) kháng thể nhờ chuỗi peptide ngắn (1025 axit amin) Với cấu trúc này, scFv giữ đƣợc đặc trƣng kháng thể nhƣ ban đầu, loại bỏ vùng định có thêm xuất chuỗi peptide làm cầu nối vùng VH VC Kháng thể phage-scFv khơng có độ bền cao, tạo lƣợng lớn với chi phí thấp mà cịn có ƣu điểm tuyệt vời mà khơng có loại kháng thể có đƣợc, có kết hợp kiểu gen kiểu hình phân tử kháng thể Do đó, với mong muốn góp phần nghiên cứu nhằm đƣa kháng thể vào ứng dụng chẩn đoán điều trị ung thƣ tiền liệt tuyến tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA công nghệ gen.” CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT 1.1.1 Giới thiệu chung tuyến tiền liệt Tuyến tiền liệt quan nằm bụng dƣới hay cổ bàng quang (hình 1) Là tuyến bao quanh đoạn đầu niệu đạo Tuyến tiền liệt khối hình nón mà đáy trên, đỉnh dƣới Tuyến rộng 4cm, cao 3cm dày 2,5cm, nặng trung bình 15-20g thƣờng to lên theo tuổi (hình 2) [1] Hình : Vị trí tuyến tiền liệt nam giới Tuyến tiền liệt tiết chất dịch có màu trắng sữa, mang tính kiềm chứa acid citric, calcium, acid phosphat, enzyme làm đơng vón profibrinolysin Trong thời gian phóng tinh, túi tuyến tiền liệt co bóp với co bóp ống dẫn tinh để đẩy dịch tiết gộp với dịch từ ống dẫn tinh làm tăng thể tích tinh dịch Dịch tiết có tính kiềm trung hòa bớt độ acid tinh dịch (độ acid diện sản phẩm trao đổi chất tinh trùng), mà giúp tinh trùng đạt đƣợc khả vận động thụ tinh mức tối ƣu Một chức khác tuyến tiền liệt giúp kiểm soát nƣớc tiểu cách tạo áp lực trực tiếp phần niệu đạo mà tuyến tiền liệt bao quanh [5,3,2] Hình 2: Hình dạng tuyến tiền liệt Những rối loạn tuyến tiền liệt tăng kích thƣớc gọi phì đại tuyến tiền liệt, viêm tuyến tiền liệt ung thƣ tuyến tiền liệt  Phì đại tuyến tiền liệt: Đây bệnh thƣờng gặp ngƣời sau tuổi 45, phì đại lành tính thƣờng gặp cả, lành tính nhƣng lại ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng sống (hình 3) Khi sinh tuyến tiền liệt có kích thƣớc hạt đậu Hà Lan Tuyến tiếp tục lớn 20 tuổi lúc đạt đến kích thƣớc trƣởng thành bình thƣờng Đến 45 tuổi, tuyến tiền liệt lại tiếp tục lớn thêm, chèn ép niệu đạo dòng nƣớc tiểu, ảnh hƣởng đến khả tiểu tiện [13,21]  Viêm tuyến tiền liệt: Đây bệnh phổ biến niên, có phân cấp mạn tính Viêm tuyến tiền liệt mạn tính biểu chủ yếu cảm giác khó chịu vùng bụng dƣới, đau vùng dƣới thắt lƣng, tiểu nhiều lần phagemid xác định trình tự, đồng thời kiểm tra gen mã hóa scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA UTTLT gắn vào pHEN2 có chiều khung đọc hay không 3.4 Xác định trình tự gen scFv phagemid tái tổ hợp pHEN2/scFv Trong dịng TG1 có khả mang phagemid tái tổ hợp xác định sơ phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc số cho băng sắc nét để nhân nuôi mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) tách chiết phagemid Kết tách chiết phagemid tái tổ hợp đƣợc thể hình 19 Hình 19 Kết tách chiết phagemid tái tổ hợp Giếng 1,2: Các phagemid tách chiết từ khuẩn lạc số Phagemid thu đƣợc đƣợc tiến hành xác định trình tự với mồi LabF sử dụng kit “Big Dye Terminator sequencing kit” (ABI, Mỹ) thực máy xác định trình  tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer theo phƣơng pháp Sanger cs Kết thu đƣợc đƣợc thể hình 20 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 ATCCTATTGC GGCCATGGCC CGCTGACGCC GGCGGTTCAG GACCCAGACT TCTCCTGCAG TTGAGTTGGC TAAGATTTCT GGTCAGGGAC GTCGGGGTTT CGGCCAGGGG ACCACCACCA CTACGGCAGC ATTGCGGGCC ATGGCCCAGG GCGGAGGTGG CCACTCTCCT GTCTAGTCAA TTCAGCAGAG AACCGGTTCT AGATTTCACA ATTACTGCAT ACCAAGCTGG CCACTGA CGCTGGATTG TGGCGACCCC TGCAGCTGCA CTCTGGCGGT CACCTGTCAC AGCCTCGTAC GCCAGGCCAG CTGGAGTGCC CTGAAAATCA GCAAGCTGCA AAATCAAACG TTATTACTCG GGGCTGGAGC GGTCGACCTC AGTGCACTTG CCTTGGACAG ACAGTGATGG CCTCCAAGAC AGATAGGTTC GCAGGGTGGA CAATTTCGCC TGCGGCCGCA CGGCCCAGCC CATTGGCTGG GAGTGGTGGA AGATTGTGAT CCGGCCTCCA AAACACCTAC TCCTAATTTA AGTGGCAGCG AGCTGAGGAT GTTCTACGTT CTCGAGCACC Hình 20: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA UTTLT Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: phần trình tự phagemid pHEN2 Từ trình tự gen thu đƣợc để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2 chiều khung đọc hay chƣa, chúng tơi tiến hành suy diễn trình tự amino acid phần mềm chuyên dụng, kết thu đƣợc nhƣ sau: ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG 51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY 101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED 151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH* Hình 21: Trình tự amino acid suy diễn Kết thu đƣợc giúp chúng tơi khẳng định chắn gen mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA đƣợc gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều khung đọc đảm bảo cho trình bộc lộ scFv bề mặt phage 3.5 Kết bộc lộ mảnh kháng thể scFv phage M13 E.coli chủng TG1 chứa phagemid-scFv chọn đƣợc đƣợc nhân nuôi o 37 C đến đạt OD600 = 0,5 sau đƣợc hiễm helper phage M13 vào để hỗ trợ việc hình thành phage-scFv cách hoàn chỉnh theo phƣơng pháp 2.2.10 Một điểm mạnh kỹ thuật phage display mối tƣơng quan kiểu gen kiểu hình, gen phage thực chất phagemid vector (pHEN2 vector) Các đoạn kháng thể (trong trƣờng hợp đoạn scFv) đƣợc gắn vào vị trí đa nối nằm trƣớc gen mã hóa protein vỏ pIII phage Do đó, đoạn scFv đƣợc biểu vỏ phage, gắn với protein vỏ pIII Vì vậy, để kiểm tra kết bộc lộ mảnh kháng thể scFv bề mặt phage có đƣợc hay không ta cần thực phản ứng PCR với cặp mồi LABF LABR đƣợc thiết kế nằm hai bên sƣờn vùng mã hóa kháng thể Dựa nguyên lý này, ADN phage thu đƣơc đƣợc sử dụng làm khn nhân đoạn gen mã hóa đoạn kháng thể phản ứng PCR với cặp mồi LABF/LABR vector pHEN2 chu trình nhiệt phù hợp Nếu biểu thành cơng kết kiểm tra sau PCR thu đƣợc băng điện di có kích thƣớc 700bp Kết điện di gel agarose đƣợc biểu hình 22: M 750bp Hình 22: Kết điện di sản phẩm PCR M: Marker DNA 1kb ( Fermetas); G 1,2: Mẫu PCR kiểm tra với nồng độ khuôn khác Từ kết hình 22 cho thấy thu đƣợc băng có kích thƣớc mong muốn khoảng 700bp Chứng tỏ kháng thể scFv biểu đƣợc thành công bề mặt phage Để xác định xác lƣợng kháng thể tạo tiến hành đo nồng độ máy nanodrope bƣớc sóng 269nm Kết sau lần chuẩn phage tính giá trị trung bình cho kết 3.10 mũ phân tử kháng thể ml dịch thu phage Nhƣ vậy, chứng tỏ trình bộc lộ kháng thể ung thƣ tiền liệt tuyến scFv bề mặt phage M13 thành công 3.6 Kết thực phản ứng ELISA kháng thể phage-scFv với huyết bệnh nhân Với kháng thể phage-scFv thu đƣợc sử dụng để chẩn đoán bệnh nhân ung thƣ tiền liệt tuyến cách thực phản ứng ELISA kết hợp với huyết máu bệnh nhân Huyết bệnh nhân bị bệnh có chứa kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA kết hợp đặc hiệu với kháng thể thu đƣợc Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng 20 mẫu huyết bệnh nhân bị bệnh ung thƣ tiền liệt tuyến u xơ tiền liệt tuyến lành tính đƣợc cung cấp từ bệnh viện Bạch Mai Nhƣ biết, ELISA – phƣơng pháp đơn giản thƣờng đƣợc áp dụng kỹ thuật phage display để xác định lực phage bộc lộ kháng thể với kháng nguyên huyết bệnh nhân Trong nghiên cứu này, tiến hành cố định huyết bệnh nhân khay ELISA 96 giếng, ủ giếng với dung dịch phage-svFv riêng biệt thu đƣợc Các kháng thể phage kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên EPCA bệnh nhân bị ung thƣ tiền liệt tuyến thông qua đoạn kháng thể bộc lộ Sau bƣớc rửa để loại bỏ kháng thể không gắn gắn không đặc hiệu, bổ sung kháng thể cộng hợp HRP kháng M13 (anti – M13 horseradish peroxidase-conjugate) vào giếng Kháng thể cộng hợp với enzyme horseradish peroxidase gắn với phage thông qua đoạn peptide đƣợc thiết kế nằm phagemid vector Khi có mặt H 2O2, horseradish peroxidase oxy hóa TMB tạo chất có màu xanh, sau dừng phản ứng H2SO4 1N dung dịch chuyển sang màu vàng hấp thụ bƣớc sóng 450nm Tồn q trình thực ELISA đƣợc thể ngắn gọn hình 23 HRP+H2O2 [HRP.H2O2]+(TMB)H2 [HRP.H2O2] HRP+2H2O2+ TMB Hình 23: Phương trình phản ứng TMB HR Hình 24: Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng xác định lực Phage-scFv với huyết bệnh nhân ung thư Hình 25: Phản ứng ELISA cho ch ất TMB vào có màu xanh Kết phản ứng Elisa thu đƣợc Hình 26: Khi dừng ELISA phản ứng H2SO4 có màu vàng Bảng 2: Kết ELISA mẫu huyết bệnh nhân: Huyết O nm Giếng từ số 1-20 : Mẫu huyết bệnh nhân, mẫu 1-8 bệnh nhân bị bệnh UTTLT, mẫu 9-20 mẫu bệnh nhân không bị bệnh Giếng 21-31 : Mẫu huyết thƣờng Giếng 32 : Mẫu không phủ huyết Các mẫu đối chứng dƣơng sử dụng mẫu huyết thƣờng ( giếng 21-31) ngƣời nam giới âm tính với ung thƣ tiền liệt tuyến có độ tuổi từ 50 trở lên, độ tuổi có tỉ lệ mắc bệnh cao tƣơng đồng với độ tuổi mẫu bệnh nhân thí nghiệm Kết biểu thị sơ đồ: OD 450 0,25 20 mẫu huyết 0,2 0,15 0,1 0,05 Hình 27: Kết phản ứng ELISA đo bước sóng 450nm Kết cho thấy: Trong 20 mẫu bệnh nhân, mẫu từ số 1-8 bệnh nhân bị bệnh có lực cao hẳn so với mẫu lại từ 9-20 bệnh nhân âm tính với UTTLT Các giếng đối chứng từ 21-31 cho giá trị OD thấp tƣơng đƣơng với mẫu không bị bệnh Mặt khác, thấy tất giếng ngƣời bình thƣờng khơng có kháng ngun EPCA (9-31) giếng đối chứng cho giá trị OD450 dƣới 0.05, mẫu bị bệnh cho giá trị OD 450 cao 0.15 Điều chứng tỏ sử dụng kháng thể phage-scFv chẩn đoán bệnh ung thƣ tiền liệt tuyến cho kết ổn định xác, hồn tồn thử nghiệm thành cơng với số lƣợng bệnh phẩm lớn có ý nghĩa thống kê KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN  Đã thiết kế thành công phagemid tái tổ hợp pHEN2 mang gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA bệnh ung thƣ tuyến tiền liệt  Đã thu nhận đƣợc kháng thể tái tổ hợp phage-scFv gắn đặc hiệu với kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA kỹ thuật phage display  Kiểm tra thành cơng tính đặc hiệu kháng thể scFv thu đƣợc phản ứng ELISA KIẾN NGHỊ  Tiếp tục nghiên cứu quy trình chẩn đốn bệnh ung thƣ tiền liệt tuyến kĩ thuật ELISA xác để ứng dụng vào y học  Nghiên cứu biểu kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến chẩn đoán TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT http://truongton.net/forum/showthread.php?t=250851 http://truongton.net/forum/showthread.php?t=45671 http://www.angelfire.com/ks3/hodacduy0/yhoc_03_UngThuTuyenTienLiet.htm Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009) - Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Hà Nội, 2009 Nguyễn Văn Tuấn, Ung thư tuyến tiền liệt vấn đề thông tin y khoa Phạm Văn Ty (2004) - Miễn dịch học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Tôn Thất Hứa (2005), Ung thư tiền liệt tuyến : Phát sớm – kết tốt, Đại học y khoa Wuerzburg, CHLB Đức TÀI LIỆU TIẾNG ANH A Heidenreich, M Bolla, S Joniau et al (2010), Guidelines on Prostate Cancer, European Association of Urology Andris-Widhopf, Steinberger, Barbas, (2001), “Bacteriophage display of combinatorial antibody libraries”, Encyclopedida of Life Sciences 10 Anna M Wu, Tove Olafsen, Andrew A Raubitschek (2007), Engineered antiCD20 antibody fragments for in vivo targeting and therapeutics, United States Patent Application Publication, Pub No US 2007/0280882 Pub date Dec 2007 p 1-12 11 Clackson T, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Winter G (1991), “Making antibody fragments using phage display libraries”, Nature 352: 624–8 12 David M Glodenberg, Robert M Sharkey, Jaques Barbet, Jean Francois Chatal ( 2007), Radioactive antibodies: selective targeting and treatment of cancer and other diseases, Appl Radiol 2007; 36(4) 13 Drudge-Coates L, Turner B (2012), “Prostate cancer overview Part 2: metastatic prostate cancer”, pp.11-24 14 Gregore and Louis (2005) Review on “ Monoclonal antibody therapy of cancer” Nature Biotechnology 23, 1147-1157 15 Griffiths, Dand Duncan, (1998), “Strategies for selection of antibodies by phageDisplay”, Curr Opin Biotechnol Vol 9, pp 102–108 16 Griffiths, Andrew, David Hoogenboom, Hendricus, Renerus, Jacobus, Mattheus Marks, James, David McCafferty, John Winter, Gregory, Paul Grigg, Geoffrey, Walter (1993), “Productiion of anti-sefl antibodies from antibody segment repertories and displayed on phage” WIPO 17 Guan, Zhang, Wang, (1995), “Electrostatic potential distribution of the gene V protein from Ff phage facilitates cooperative DNA binding: a model of the GVPssDNA complex”, Protein Sci 4:187 18 Hoogenboom, Chames, P (2000), “Natural and designer binding sites made by phage display technology”, Immunology Today 21, 371 19 Hoogenboom, de Bruine AP, Hufton SE, Hoet RM, Arends JW, Roovers RC (1998), “Antibody phage display technology and its applications”, Immunotechnology 4:1–20 20 Jame boye, T Elter & A Engert ( 2003) An overview of the current clinical use of the anti- CD20 monoclonal antibody rituximab Annals of Oncology 14 p 520-535, 2003 21 J Ramon Denis (Eds) (2007), Prostate cancer, Belgium 22 Janice M R, et al ( 2005) Monoclonal antibody successes in the clinic Nature Biotecnology, 23(9), p.1073-1078 23 Jingjing You, Paul Cozzi, Bradley Walsh, Mark Willcox, John Kearsley, Pamela Russell, Yong Li (2009), Innovative biomarkers for prostate cancer early diagnosis and progression, Introduction p11 24 Johns M, George, Ritter (2000), “In vivo selection of scFv from phage display libraries”, J Immunol Meth 239:137-151 25 Jordan E., Hust M., Roth A., Biedendieck R., Schirrmann T., Jahn D., Dübel S (2007) “Production of recombinant antibody fragments in Bacillus megaterium”, Microbial Cell Factories 26 Jurol., Hansel DE, DeMarzo AM, Platz EA, Jadallah S, Hicks J, Epstein JI, Partin AW, Netto GJ (2007) May, “Early prostate cancer antigen expression in predicting presence of prostate cancer in men with histologically negative biopsies”, 177(5):1736-40 27 Kehoe, J Wash, Kay, (2005), “Filamentous phage display in the new millennium”, Chem Rev 105:4056-4072 28 Knappick, L.; Honegger, A.; Pack, P.; Fischer, M.; Wellnhofer G.; Hoess A,; Wolle; Pluă ckthun, A.; Virnekas, B (2000), Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides”, J Mol Biol 296 29 Kohler G., Milstein C (1975), “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”, Nature, 256, pp.495- 497 30 Kohler, Milstein (1975).Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefines specificity Nature 256, 495-497 31 Konings, Folmer, Folkers, P J Nilges, Hilbers, (1995), “Three-dimensional structure of the single-stranded DNA-binding protein encoded by gene V of the filamentous bacteriophage M13 and a model of its complex with single-stranded DNA”, FEMS Microbiol Rev 17:57-72 32 Mead DA, Kemper B (1988), “Chimeric single-stranded DNA phage-plasmid cloning vectors”, Biotechnology 10:85–102 33 Morrow AL, Rangel JM Semin Pediatr Infect Dis 2004 “Human milk protection against infectious diarrhea: implications for prevention and clinical care” 34 Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J Biotechnol 74, 277 35 Nakamura, M., Tsumoto, K., Kumagai, I., Ishimura, K (2003), “A morphologic study of filamentous phage infection of Escherichia coli using biotinylated phages”, FEBS Lett 536:167-172 36 Neri D, Petrul H, Roncucci G (1995), “Engineering recombinant antibodies for immunotherapy”, Cell Biophys 27:47–61 37 Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, et al (1994), “Antibody fragments from a ’single pot’ phage display library as immunochemical reagents”, EMBO 13:692–8 38 Pacini, L., Vitelli, A., Filocamo, G., Bartholomew, L., Brunetti, M., et al 2000 In vivo selection of protease cleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries J Virol 74:10563-10570 39 Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), Engineered antibody fragment and the rise of single domains, natural biotechnology 40 Rader, C (2001), “Antibody libraries in drug and target discovery”, Drug Discovery Today 6, 36 41 Riechmann, L., Holliger, P (1997) "The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E coli”, Cell 90:351-360 42 Rodney J.Y.HO, Milo Gibaldi ( 2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals, transforming proteins and genes into drugs, Wiley- liss, p 271- 311 43 Skerra A, Pluăckthun A (1988), “Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli”, Science 240:1038–41 44 Soderlind E; Simonsson; Borrebaeck (1992), “Phage display technology in antibody engineering: design of phagemid vectors and in vitro maturation systems”, Immunol Rev 130, 109 45 Tordsson JM, Ohlsson LG, Abrahmsen LB, Karlstrom PJ, Lando PA, Brodin TN (2000), “Phage-selected primate antibodies fused to superantigens for immunotherapy of malignant melanoma”, Cancer Immunol Immunother 48:691– 702 46 Urban, Schneider, Compte, M., Finger, C., Cichutek, K., et al (2005), “Selection of functional human antibodies from retroviral display libraries” J Nucleic Acids Res 33:e35 47 Vaughan, Williams ; Pritchard, K.; Osbourn, J.K.; Pope, A.R.; Earnshaw, J.C.; McCafferty, J.; Hodits, R.A.; Wilton, J.; Johnson, K.S (1996), “Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library”, Nature Biotechnol 14 48 Watters, Telleman, P., Junghans, (1997), “An optimised method for cell based phage display panning”, Immunotechnology 3:21-29 49 Wezenbeek, Hulsebos, Schoenmakers, (1980), “Nucleotide sequence of the filamentous bacteriophage M13 DNA genome: comparison with phage fd”, Gene 11:129-148 50 Willats, Wurrel G (2002), “Phage display: practicalities and prospects”, Plant Mol Biol 50:837-854 51 Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR (1994), “Making antibodies by phage display technology”, Annu Rev Immunol 12:433–55 52 Zhigang Zhao and Guohua Zeng (2010), “increased serum level of early prosate cancer antigen is associated with subsequent cancer risk in men with high-grade prostatic intraepithelial neoplasia” 17: 505-512 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kháng sinh môi trƣờng tăng sinh Kháng sinh: Dung dịch kháng sinh Ampicilin (50mg/ml) Kanamycine (50mg/ml) Mụi trng tng sinh Môi tr-ờng LB lỏng LB đặc 2xTY TYE Phụ lục 2: Đệm dung dịch Đệm Tªn PBS (10X) Đệm Citrate (10X) Dung dch Tên CaCl2 PEG/NaCl MPBS TPBS Triethylamine TMB stock Dung dÞch nhuém TMB ... đề tài: ? ?Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA công nghệ gen. ” CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT 1.1.1... 1.3.4 Kháng thể đặc hiệu loại kháng nguyên 1.3.4.1 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư 19 1.3.4.2 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên cụm biệt hóa 20 1.3.4.3 Kháng thể đặc hiệu. .. - Nguyễn Kim Hoàn NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN EPCA BẰNG CÔNG NGHỆ GEN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN