Tế bào gốc phôi bò hiện nay được phân lập và nuôi cấy ở giai đoạn phôi nang từ 7-9 ngày hoặc giai đoạn phôi từ 12-14 ngày. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc phôi bò ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả 9 phôi dâu và 3 phôi nang giai đoạn sớm đã được thử nghiệm nuôi cấy phôi nguyên cho thiết lập tế bào gốc phôi. Tuy nhiên, các blastomere trong 9 phôi dâu không thể bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển, chỉ có 1 trong 3 phôi nang giai đoạn sớm bám được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển thành quần thể tế bào gốc phôi bò. Quần thể tế bào gốc phôi bò sơ cấp được cấy chuyền 2 lần. Ở lần cấy chuyền thứ nhất, 6 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát thấy và kích thước các quần thể này dao động từ 50-100 µm. Chỉ có 2 trong 6 quần thể tế bào ở lần cấy chuyển thứ nhất duy trì được hình thái của quần thể tế bào gốc phôi. Ở lần cấy chuyền thứ hai, 5 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát và kích thước các quần thể này dao động từ 70-140 µm. Các quần thể tế bào gốc phôi bò trên đều có đường bao quanh rõ tuy nhiên bề mặt của các quần thể này không trơn bóng như quần thể tế bào gốc phôi chuột. Cả 5 quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ 2 bị thoái hoá chỉ sau một tuần nuôi cấy. Tế bào gốc phôi bò được thử nghiệm biệt hoá in vitro và chúng có khả năng biệt hoá thành thể phôi. Đây là một đặc điểm quan trọng cho thấy tế bào gốc phôi bò thu được có tính đa tiềm năng.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 NGHIÊN CỨU THU NHẬN, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI QUẦN THỂ TẾ BÀO GỐC PHƠI BỊ VIỆT NAM Lê Thành Long*, Đoàn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Hoàng Nghĩa Sơn Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, (*)lelong2510@gmail.com TĨM TẮT: Tế bào gốc phơi bò phân lập nuôi cấy giai đoạn phôi nang từ 7-9 ngày giai đoạn phôi từ 12-14 ngày Bài báo trình bày kết nghiên cứu phân lập ni cấy tế bào gốc phơi bò giai đoạn phôi dâu phôi nang Kết phôi dâu phôi nang giai đoạn sớm thử nghiệm nuôi cấy phôi nguyên cho thiết lập tế bào gốc phôi Tuy nhiên, blastomere phôi dâu bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng phát triển, có phơi nang giai đoạn sớm bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng phát triển thành quần thể tế bào gốc phơi bò Quần thể tế bào gốc phơi bò sơ cấp cấy chuyền lần Ở lần cấy chuyền thứ nhất, quần thể tế bào gốc phôi quan sát thấy kích thước quần thể dao động từ 50-100 µm Chỉ có quần thể tế bào lần cấy chuyển thứ trì hình thái quần thể tế bào gốc phôi Ở lần cấy chuyền thứ hai, quần thể tế bào gốc phơi quan sát kích thước quần thể dao động từ 70-140 µm Các quần thể tế bào gốc phơi bò có đường bao quanh rõ nhiên bề mặt quần thể khơng trơn bóng quần thể tế bào gốc phôi chuột Cả quần thể tế bào gốc phơi bò lần cấy chuyền thứ bị thối hố sau tuần ni cấy Tế bào gốc phơi bò thử nghiệm biệt hố in vitro chúng có khả biệt hố thành thể phôi Đây đặc điểm quan trọng cho thấy tế bào gốc phơi bò thu có tính đa tiềm Từ khóa: Phơi bò, đa tiềm năng, ni cấy phôi nguyên, tế bào gốc phôi MỞ ĐẦU Tế bào gốc phôi (embryonic stem cells ESCs) tế bào đa tiềm thường thu nhận từ phôi nang (blastocyst) giai đoạn tiền làm tổ (pre-implantation) Chúng có khả tự làm (re-newal) để tạo thành số lượng lớn tế bào mà không thay đổi đặc tính đa tiềm có khả biệt hóa thành loại tế bào khác thể [5] Chúng biểu makers hay đặc tính chuyên biệt bao gồm kháng nguyên đặc hiệu cho giai đoạn phôi, hoạt động enzyme alkaline phosphatase telomerase gene đặc trưng cho tính đa tiềm Oct4 Nanog [1] Hơn nữa, chúng có khả biệt hố in vivo thành khối u quái (teratomas), khối u chứa tế bào có đặc điểm giống tế bào ba lớp mầm phơi: nội bì, trung bì, ngoại bì chúng có khả biệt hóa in vitro trực tiếp thành 200 loại tế bào khác thể trưởng thành [12] Các dòng tế bào gốc phôi phân lập thành công từ phôi nang chuột, khỉ người, việc thu nhận thực từ phơi giai đoạn trước compact [4, 3, 18] Hầu hết cố gắng phân lập nuôi cấy tế bào gốc phơi bò thực phơi nang giai đoạn ngày 7-9 [172,11, 9] phân lập từ phôi giai đoạn ngày thứ 1214 [6] Tuy nhiên, thời gian tối ưu cho viêc phát triển phôi giai đoạn tiền làm tổ để thu nhận tế bào gốc phôi chưa biết rõ Những cố gắng thu nhận tế bào gốc phơi bò từ hợp tử phơi phân chia giai đoạn sớm hầu hết thất bại [18, 8], có dòng tế bào tế bào gốc phơi bò tăng sinh từ phôi giai đoạn hai tế bào, nuôi cấy năm [8] Trong đó, phơi bò giai đoạn phôi dâu sử dụng cho việc phân lập tế bào gốc phơi có hiệu hình thành quần thể từ 60-70% [17,18] Cho đến nay, dòng tế bào gốc phơi bò chưa thiết lập cách bền vững số đặc điểm hình thái quần thể tế bào gốc phơi bò chưa đánh giá cách đầy đủ Do đó, cơng trình này, chúng tơi bước đầu nghiên cứu phân lập ni cấy tế bào gốc phơi bò Việt Nam số giai đoạn khác nhau, đồng thời đánh giá khả tăng sinh đặc điểm hình thái số quần thể tế bào gốc phơi bò PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 277 Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son Ni chín trứng bò Trứng bò thu nhận từ lò mổ sau chuyển phòng thí nghiệm Phức hợp trứng-cumulus (Cumulus - Oocyte complex) thu nhận phương pháp chọc hút Phức hợp trứng-cumulus nuôi môi trường TCM199 (Sigma) bổ sung 20% FBS (Gibco), 1% Pen/Strep (Gibco), µg/ml βestradiol (Sigma), 10IU FSH (Sigma) 10IU LH (Sigma) 38,5oC, 5% CO2 vòng 2224 Thụ tinh in vitro trứng bò Trứng sau ni chín sử dụng cho thụ tinh in vitro Tinh trùng swim-up môi trường TALP-HEPES (chứa mM sodium pyruvate, 1% pen/strep 3mg/ml BSA) 38,5oC Trứng thụ tinh với tinh trùng vi giọt thụ tinh với mật độ × 106 tinh trùng/ml Q trình thụ tinh diễn 38,5oC, 5% CO2 Sau trứng thụ tinh loại bỏ tinh trùng nuôi cấy môi trường nuôi phôi sofa 38,5oC, 5% CO2 Chuẩn bị lớp tế bào nuôi dưỡng Tế bào nuôi dưỡng (nuôi dưỡng cells) sử dụng nghiên cứu nguyên bào sợi phôi chuột phân lập nuôi cấy từ thai chuột nhắt trắng 12,5-13,5E Nguyên bào sợi phôi chuột lần cấy chuyển thứ sử dụng làm tế bào nuôi dưỡng Nguyên bào sợi phôi chuột bất hoạt mitomycin C 10 µg/ml vòng 2,5 Sau ngun bào sợi phơi chuột rửa lại môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi lần lần 10 phút Loại bỏ màng zona Trong nghiên cứu này, thử nghiệm loại bỏ màng zona phơi bò hai yếu tố enzyme pronase (Sigma) acid tyrode pH 2,5 (Gibco) Phơi bò giai đoạn 8-16 tế bào dùng cho khảo sát nồng độ enzyme pronase acid tyrode việc loại bỏ màng zona Nuôi cấy phôi ngun Phơi bò giai đoạn morula giai đoạn blastocyst sớm xử lý loại bỏ màng zona Phôi loại bỏ màng zona chuyển lên đĩa 278 chứa tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt mitomycin C Phôi nguyên nuôi cấy môi trường tế bào gốc phôi Knock-out DMEM (Gibco) chứa 20% Knock-out Serum Replacement (Gibco), 1% pen/strep (Gibco), 200 µM mercaptoethanol (Sigma), 1% L-glutamine (Gibco), 1000 IU/ml LIF, 1% Non-essencial amino acid (Gibco), 1% nucleoside (0,73 g/L cytidine, 0,85 g/L guanosine, 0,73 g/L Uridine, 0,8 g/L adenosine, 0,24 g/L thymidine) Cấy chuyền tế bào gốc phơi bò Quần thể tế bào gốc phơi thu nhận ống mao quản, sau chuyển vào đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco) Khi tách rời hoàn toàn, tế bào chuyển vào đĩa nuôi chửa lớp tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt mitomycin C Tế bào nuôi môi trường nuôi tế bào gốc phôi 38,5oC, 5% CO2 Thử nghiệm biệt hoá in vitro Quần thể tế bào gốc phôi tách Trypsin-EDTA 0,25% thành tế bào đơn, sau tế bào nuôi cấy đĩa petri với môi trường nuôi cấy tế bào gốc phơi khơng chứa LIF Thể phơi có cấu trúc hình cầu xuất sau 1-2 tuần nuôi cấy KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá hiệu loại bò màng zona pronase acid tyrode Trong việc tạo phôi phương pháp thụ tinh ống nghiệm, phơi khơng có phân mảnh chọn lọc cho q trình ni phơi Những phơi bị phân mảnh bị loại bỏ Quá trình phân mảnh phơi đặc điểm hình thái q trình apoptosis trình ảnh hưởng lớn tới phát triển phôi việc thiết lập dòng tế bào gốc phơi Để ni cấy tế bào gốc phôi, việc loại bỏ màng zona quan trọng cho việc thu nhận phôi giai đoạn khác [15] Các cách phổ biết để loại bỏ màng zona phôi sử dụng acid tyrode, sử dụng enzyme sử dụng hệ thống hỗ trợ laser Tuy nhiên, đối tượng gia súc đặc biệt bò, phương pháp phổ biến để loại bỏ màng zona sử dụng enzyme pronase TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 Trong báo này, enzyme pronase sử dụng nồng độ khác để kiểm tra khả loại bỏ màng zona phơi bò Chúng tơi sử phơi phơi bò giai đoạn tế bào đến 16 tế bào để kiểm tra khả enzyme pronase Kết xử lý loại bỏ màng trình bày bảng Kết xử lý cho thấy, nồng độ 10 mg/ml, màng zona phơi bò bị loại bỏ nhanh sau phút Tuy nhiên, màng zona bị loại bỏ nửa đủ để phơi ngồi Q trình loại bỏ màng zona nồng độ 10 mg/ml diễn nhanh lại ảnh hưởng lớn tới tế bào phôi bên Cấu trúc phôi bị thay đổi mạnh, liên kết tế bào phôi bị cắt tế bào phôi dễ rời (hình 1A, 1A1) Ở nồng độ 0,5 mg/ml, màng zona phôi bị loại bỏ hồn tồn sau phút Q trình loại bỏ diễn lâu, phơi có tượng bị biến dạng (hình 1C, 1C1) Điều cho thấy, nồng độ này, enzyme pronase tác động lớn tới tế bào phơi bên thời gian xử lý lâu, pronase cắt đứt liên kết tế bào phôi, làm tách rời tế bào phôi phôi bị biến dạng Ở nồng độ mg/ml, màng zona phơi bò bị loại bỏ sau phút, phơi gần giữ nguyên cấu trúc hình dạng giống trước xử lý (hình 1B, 1B1) Các tế bào phôi gần không tách rời Điều cho thấy, nồng độ pronase mg/ml thích hợp cho việc loại bỏ màng zona, thời gian xử lý nồng độ ngắn mà phôi gần khơng bị thay đổi cấu trúc, hình dạng, tế bào phôi không bị tách rời, điều kiện quan cho việc phân lập ni cấy tế bào gốc phơi bò Acid tyrode pH 2,5 (Gibco) sử dụng phổ biến việc loại bỏ màng zona trứng, phôi chuột hay heo việc thu nhận nuôi cấy tế bào gốc phôi từ hai đối tượng này, acid tyrode hóa chất sử dụng phổ biến [13] Trong nghiên cứu này, acid tyrode sử dụng để thử nghiệm loại bỏ màng zona phơi bò Tuy nhiên, sau xử lý với acid tyrode 30 phút, cấu trúc hình thái màng zona gần khơng biến đổi (hình 1D, 1D1) Điều cho thấy, acid tyrode không hiệu việc loại bỏ màng zona phơi bò Hơn nữa, thời gian sử lý với acid tyrode lâu nên ảnh hưởng tới chất lượng phát triển phơi bò Hình Quá trình xử lý loại bỏ màng zona phơi [A, A1] phơi bò trước sau xử lý với pronase 10 mg/ml; [B, B1] phơi bò trước sau xử lý với pronase mg/ml; [C, C1] phơi bò trước sau xử lý với pronase 0,5 mg/ml; [D, D1] phơi bò trước sau xử lý với acid tyrode pH 2,5 Bảng Kết loại màng zona pronase and acid tyrode Tác nhân loại màng Pronase 10 mg/ml Pronase mg/ml Pronase 0,5 mg/ml Acid tyrode pH 2,5 Số phôi dùng cho loại màng zona 13 12 13 11 Số phôi loại màng zona 13 12 13 279 Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son Nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc phơi bò Q trình phân lập ni cấy thực với phôi dâu phôi nang giai đoạn sớm Phôi xử lý với pronase mg/ml để loại bỏ màng zona Sau đó, phơi rửa nhiều lần môi trường nuôi cấy tế bào gốc phơi chuyển lên đĩa ni cấy có chứa tế bào nuôi dưỡng bất hoạt mitomycin C để nuôi cấy sơ cấp Trong nuôi cấy sơ cấp, nhân tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF-leukemia inhibitory factor) sử dụng nồng độ 1.000 IU/ml môi trường nuôi cấy Nồng độ LIF sử dụng để bước đầu đánh giá khả phát triển quần thể tế bào gốc phơi bò q trình ni cấy sơ cấp tăng sinh tế bào gốc phơi bò sau lần cấy chuyền khác Kết nuôi cấy phôi nguyên cho thấy, blastomere phôi dâu bám tăng sinh lớp tế bào nuôi dưỡng (bảng 2) Ba phôi nang giai đoạn sớm nuôi cấy lớp tế bào nuôi dưỡng Tuy nhiên, tế bào phôi bám vào lớp nuôi dưỡng bị thối hóa sau tuần ni cấy Chỉ có quần thể tế bào từ phơi thứ ba bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng phát triển thành quần thể tế bào gốc phơi bò sau tuần nuôi cấy Quần thể tế bào gốc phôi bò có đường bao quanh rõ hình thái quần thể gồ ghề, không trơn nhẵn quần thể tế bào gốc phôi chuột Sau tuần nuôi cấy, quần thể tế bào gốc phơi bò thu nhận tế bào tách rời thành tế bào đơn cho cấy chuyền Các tế bào chuyển lên lớp tế bào nuôi dưỡng để ni cấy Q trình thực để đánh giá khả tăng sinh quần thể tế bào gốc phơi bò Đánh giá khả tăng sinh tế bào gốc phơi bò cấy chuyền Các tế bào gốc phơi bò ni cấy lớp tế bào nuôi dưỡng phát triển môi trường chứa LIF 1.000 IU/ml Sau 48 nuôi cấy, sáu quần thể tế bào gốc phơi bò hình thành phát triển lớp tế bào nuôi dưỡng Quần thể tế bào gốc phơi bò phát triển mạnh, số lượng tế bào tăng nhanh Tuy nhiên, số tế bào vùng ngồi quần thể tế bào gốc phơi bò biệt hố mọc lan bề mặt đĩa ni cấy mọc chồng lên lớp tế bào nuôi dưỡng Hình thái quần thể tế bào gốc phơi bò lần cấy chuyền thứ khơng trơn nhẵn hình thái quần thể tế bào gốc chuột, nhiên, quần thể có đường bao quanh rõ Đó đặc điểm phân biệt quần thể tế bào gốc phôi với cụm tế bào nhiều tế bào kết cụm lại với [7] Kích thước quần thể tế bào gốc phơi bò dao động từ 30 µm 60 µm (hình 2) Kích thước quần thể tế bào gốc phôi lần cấy chuyền thứ khơng đồng Điều chứng tỏ số lượng tế bào gốc phôi quần thể khác nhau, đó, khả tăng sinh tế bào gốc phơi bò quần thể tế bào ni cấy sơ cấp khác Các quần thể tiếp túc tăng sinh phát triển sau 96 nuôi cấy Kích thước quần thể tế bào gốc phơi bò tiếp tục tăng Kích thước quần thể dao động từ 50 µm 100 µm Kết cho thấy, tế bào gốc phôi quần thể tế bào gốc phôi lần cấy chuyền thứ khả tăng sinh mạnh Hình Sự phát triển quẩn thể tế bào gốc phơi bò lớp tế bào ni dưỡng lần cấy chuyển thứ sau 48 nuôi cấy Thang chia độ 100 µm 280 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 Sau tuần nuôi cấy, quần thể 1, 2, 3, lần cấy chuyền thứ bị thối hố Hình thái quần thể chuyển từ dạng ụ (hill) sang dạng phẳng (flat), điều chứng tỏ tế bào quần thể biệt hóa Chỉ lại quần thể số quần thể số trì hình thái giống quần thể tế bào gốc phơi Quần thể số sử dụng cho cấy chuyền quần thể số sử dụng cho thử nghiệm khả biệt hố tế bào gốc phơi bò Bảng Khả tăng sinh tế bào gốc phơi bò Giai đoạn phơi Phơi dâu Phơi nang Số phôi sử dụng nuôi cấy tế bào gốc Số phơi bám Tế bào gốc phơi bò quần thể thứ thu nhận cấy chuyền qua đĩa chứa lớp tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt mitomycin C Tế bào gốc phôi lần cấy chuyền thứ hai nuôi cấy tăng sinh lớp tế bào nuôi dưỡng bất hoạt mitomycin C môi trường chứa 1.000 IU/ml LIF Sau 96 nuôi cấy, năm quần thể tế bào gốc phơi bò lần cấy chuyền thứ hai hình thành phát triển Kích thước quần thể dao động từ 70 µm 140 µm (hình 3) Nếu so với quần thể tế bào gốc phơi bò lần cấy chuyền thứ nhất, quần thể tế bào gốc phơi bò lần cấy chuyền thứ hai có kích thước lớn Số quần thể cấy chuyền lần Số quần thể cấy chuyền lần Tuy nhiên, mặt hình thái, quần thể tế bào gốc lần cấy chuyền thứ hai không đồng quần thể lần cấy chuyền thứ Tuy có đường bao quanh rõ, hình thái quần thể tế bào gốc lần cấy chuyền thứ hai gồ ghề nhiều nhiều quần thể có hình thái biến dạng khơng tròn Quần thể tế bào gốc số số lần cấy chuyền thứ có bề mặt gồ ghề nhất, điều cho thấy tế bào gốc bề mặt tế bào xung quanh quần thể bắt đầu biệt hóa khơng giữ đặc tính tăng sinh mạnh tế bào gốc phơi Hình Sự phát triển quần thể tế bào gốc phơi bò lớp tế bào ni dưỡng lần cấy chuyền thứ hai sau 96 nuôi cấy Thang chia độ 100 µm Cả năm quần thể tế bào gốc phơi bò lần cấy chuyền thứ bị thối hóa sau tuần ni cấy Mơi trường sử dụng cho nuôi cấy quần thể tế bào gốc nói mơi trường ni cấy tế bào gốc phơi chuột chứa 1.000 IU/ml LIF Ở bò, LIF dòng hóa sử dụng ni cấy, nhiên, chưa thương mại hóa Do đó, hầu hết nhà nghiên cứu sử dụng LIF người (hLIF) để bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho phơi bò quần thể tế bào gốc phơi bò chúng có trình tự tương đồng cao với trình tự LIF người Mặc dù vậy, việc sử dụng LIF người ảnh hưởng lớn tới q trình ni cấy tế bào gốc phơi bò đặc 281 Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son biệt việc trì khả tự làm tính đa tiềm quần thể tế bào gốc phơi bò Những nghiên cứu trước cho thấy rằng, việc thiết lập tế bào gốc phơi bò thực môi trường nuôi cấy không chứa LIF [8] Hơn nữa, q trình ni cấy phơi bò, hLIF khơng làm gia tăng [16] hay giảm khơng có tác động lên ICM phơi nang bò [10] Việc tăng sinh quần thể tế bào từ phôi bào không phụ thuộc vào việc bổ sung LIF [20] Dựa vào kết trên, LIF dường khơng đóng vai trò quan trọng việc trì tính đa tiềm tế bào gốc phơi bò Tuy nhiều nghiên cứu khác lại cho LIF cần thiết cho q trình tăng sinh trì tính đa tiềm tế bào gốc phơi bò [11], khơng vậy, LIF cần cho q trình ni cấy tế bào gốc phơi bò phân lập từ phơi thụ tinh ống nghiệm, phơi nhân vơ tính hay phôi trinh sản [7] LIF không cần thiết cho việc trì khả tự làm mới, cần thiết cho biểu marker đa tiềm tế bào gốc phơi bò (Oct4, Nanog, SSEA1) trì đặc điểm hình thái đặc trưng quần thể tế bào gốc phôi [15] Các nghiên cứu ảnh hưởng LIF lên trình ni cấy tế bào gốc phơi bò cho thấy, cần phải có khảo sát kĩ tác động LIF lên tăng sinh tế bào gốc phơi bò Đặc biệt nồng độ LIF cần cho ni cấy tế bào gốc phơi bò LIF ảnh hưởng trực tiếp đến tăng sinh khả tự làm tế bào gốc phôi bò, mà hình thái quần thể tế bào gốc phơi bò đặc điểm để đánh giá Thử nghiệm khả biệt hóa in vitro Tế bào gốc phơi có khả biệt hố thành nhiều loại tế bào khác ba lớp mầm phôi, bao gồm nội phơi bì, trung phơi bì ngoại phơi bì Khả biệt hóa diễn điều kiện in vitro in vivo [19, 5, 14] Hình Sự hình thành thể phơi Các tế bào gốc phôi tách rời nuôi cấy đĩa petri chứa môi trường không chứa LIF Hai thể phôi xuất sau tuần nuôi cấy Các thể phơi có cấu trúc hình cầu (mũi tên trắng) Quần thể tế bào gốc thứ lần cấy chuyền thứ thu nhận tách thành tế bào đơn đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25% Sau đó, tế bào chuyển qua đĩa petri chứa môi trường ni tế bào gốc phơi bò khơng chứa nhân tố ức bạch cầu (LIF) Sau hai tuần nuôi cấy, thể phơi hình thành Các thể phơi có cấu trúc hình cầu, hình thành tăng sinh biệt hoá từ tế bào gốc phơi bò Tuy nhiên, thể phơi có 282 kích thước khác điều chứng tỏ tăng sinh khả biệt hoá tế bào gốc phơi bò từ quần thể thu nhận khơng đồng Điều chứng tỏ, tế bào quần thể thu nhận có tính đa tiềm thơng qua việc biệt hóa thành thể phơi điều kiện nuôi cấy in vitro KẾT LUẬN Bước đầu phân lập nuôi cấy TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284 thành cơng quần thể tế bào gốc phơi bò Các quần thể biểu số đặc điểm quần thể tế bào gốc phôi khả tăng sinh qua lần cấy chuyền Lời cảm ơn: Chúng chân thành cảm ơn Sở Khoa học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí cho chúng tơi thực đề tài 10 TÀI LIỆU THAM KHÀO Byrne J A., S M Mitalipov and D P Wofl, 2006 Current progress with primate Embryonic stem cell Curr Stem Cell Res Ther., 1: 127-138 11 Cibelli J B., S.L Stice, P.J Golueke, J J Kane and J Jerry, 1998 Transgenic bovine chimeric offspring produced from somatic cell-derived stemlike cells Nat Biotechnol., 16: 642-646 Delhaise F., V Bralion, N Schuurbiers and F Dessy, 1996 Establishment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos Eur J Morphol., 34: 237243 Eistetter H R., 1988 A mouse pluripotent embryonal stem cell line stage-specifically regulates expression of homeo-box containing DNA sequences during differentiation in vitro Eur J Cell Biol., 45: 315-321 Evans M., Kaufman M H., 1981 Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos Nature, 292: 154-156 Gjorret J O and P Maddox-Hyttel, 2005 Attemps towards derivation and establishment of bovine embryonic stem cell-like cultures Reprod Fertil Dev., 17: 113-124 Wang Li, Duan Enkui, Sung Li-ying, Jeong Byeong-Seon, Yang Xiangzhong, X Cindy Tian, 2005 Generation and Characterization of Pluripotent Stem Cells from Cloned Bovine Embryos Biology of Reproduction, 73: 149-155 Mitalipova M., Beyhan Z., First N L., 2001 Pluripotency of Bovine Embryonic 12 13 14 15 Cell Line Derived from Precompacting Embryos Cloning, 3: 59-67 Munoz M., A Rodriguez, C De Frutos, J N Caamano, C Diez, N Facal, E Gomez, 2008 Convetional pluripotence markers are unspecific for bovine embryonic derived cell-lines Theriogenology, 69: 1159-1164 Rodrigues J L., Oliveira A T., Lopes R F., 2006 Gene expression and developmental competence of bovine embryos produced in vitro with different serum concentrations Reprod Domest Anim., 41(2): 129-136 Saito S., Sawai K., Ugai H, Moriyasu S., Minamihashi A., Yamamoto Y., Hirayama H., Kageyama S., Pan J., Murata T., Kobayashi Y., Obata Y., Yokoyama K K., 2003 Generation of cloned calves and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stem-like cells Biochemical and Biophysical Research Communications, 309: 104-113 Savatier P., S Huang, L Szekely, K G Wiman, J Samarut, 1994 Constracting patterns of retinoblastoma protein expression in mouse embryonic stem cells and embryonic fibroblasts Oncogene, 9: 809-818 Sayaka W., Takafusa H., Rinako S., Yuko S., Hong-Thuy Bui, Eiji M and Teruhiko W., 2007 Efficient Establishment of Mouse Embryonic Stem Cell Lines from Single Blastomeres and Polar Bodies Stem Cells, 25: 986-993 Shamblott M J., Axelman J., Wang S., Bugg E M., Littlefield J W., Donovan P J., Blumenthal P D., Huggins G R., Gearhart J D., 1998 Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells Proc Natl Acad Sci USA, 95:1372613731 Shanbo Cao, Fang Wang, Zhisheng Chen, Zhong Liu, Cheng Mei, Haojia Wu, Junjiu Huang, Chao Li, Lingjun Zhou, Lin Liu, 2009 Isolation and Culture of Primary Bovine Embryonic Stem Cell Colonies by a Novel Method Journal of Experimental Zoology, 311A: 368-376 283 Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son 16 Sirisathien S., Brackett B G., 2003 Influence of postmortem delay in aspiration of oocytes on production of bovine blastocysts in vitro Vet Rec., 153(11): 334335 17 Stice S L., N Strelchenko, C L Keefer, L Matthews, 1996 Pluripotent bovine embryonic stem cell lines direct embryonic developmet following nuclear transfer Biol Reprod., 54: 100-110 18 Strelchenko N., 1996 Bovine pluripotent stem cells Theriogenology, 45: 131-140 19 Thomson J A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S S., Waknitz M A., Swiergiel J J., Marshall V S., Jones J M., 1998 Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts Science, 282: 11451147 20 Vejlsted M., Du Y., Vajta G., MaddoxHyttel P., 2006 Post-hatching development of the porcine and bovine embryo defining criteria for expected development in vivo and in vitro Theriogenology, 65(1): 153-165 ISOLATION AND CULTURE OF BOVINE EMBRYONIC STEM-LIKE CELLS USING WHOLE ZONA-FREE EMBRYO CULTRUE Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son Institute of Tropical Biology, VAST SUMMARY Zona membranes of bovine embryos were dissolved using mg/ml pronase to collect zona-free embryos Whole embryo culture was applied for bovine embryonic stem cell establishment Bovine embryonic stem cells were isolated and cultured from bovine morula stage embryos and blastocyst stage embryos Nine morula stage embryos were cultured on mouse embryonic fibroblast inactivated by 10 µg/ml mitomycin C However, there was no attachment or proliferation of morula blastomere on the feeder cell layer Whole blastocyst stage embryo culture were also used to establish embryonic stem cells One blastocyst stage embryo attached to feeder cell layer and proliferated to embryonic stem-like cell colony in three weeks The primary bovine embryonic-like colony were collected and passaged to passage one Six embryonic-like colonies were formed on feeder layer in passage one The colonies’ diameter of passage one is from 50µm to 100 µm Four colonies were degenerated Colony and proliferated continuously in one week Colony was picked up and passaged to passage Five embryonic-like colonies were formed on the feeder layer in passage two The colonies’ diameter of passage two was from 70 µm to 140 µm However, all embryonic-like colonies of passage two degenerated in one week These colonies of passage one and two had embryonic-like morphology, and were surrounded by clear boundaries This characteristic is very important to distinguish embryonic-like colonies from feeder cell cluster Colony of passage one was treated to Trysin-EDTA and culture in petri dish with embryonic stem cell medium without leukemia inhibitory factor Some embryoid bodies were formed in two weeks This result supported the pluripotent property of these embryonic stem-like cells Keywords: bovine embryo, embryonic-like colony, embryonic stem cells, pluripotency, whole emrbyo culture Ngày nhận bài: 21-6-2012 284 ... thành quần thể tế bào gốc phơi bò sau tuần ni cấy Quần thể tế bào gốc phơi bò có đường bao quanh rõ hình thái quần thể gồ ghề, khơng trơn nhẵn quần thể tế bào gốc phôi chuột Sau tuần nuôi cấy, quần. .. quần thể tế bào gốc phôi bò thu nhận tế bào tách rời thành tế bào đơn cho cấy chuyền Các tế bào chuyển lên lớp tế bào nuôi dưỡng để ni cấy Q trình thực để đánh giá khả tăng sinh quần thể tế bào gốc. .. tế bào gốc phơi bò Đặc biệt nồng độ LIF cần cho nuôi cấy tế bào gốc phơi bò LIF ảnh hưởng trực tiếp đến tăng sinh khả tự làm tế bào gốc phơi bò, mà hình thái quần thể tế bào gốc phơi bò đặc điểm