Để góp phần tìm ra môi trường tối ưu cho mục đích nhân giống cây hoa salem tím (Limonium sinuatum L. Mill) in vitro, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp của mẫu cấy, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 và adenine lên giai đoạn nhân chồi. Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose và 6 g/l agar. Các thí nghiệm được duy trì ở điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 lux và nhiệt độ là 25 ± 2ºC. Nguyên liệu thích hợp nhất được lựa chọn là chồi của cây con in vitro 6 tuần tuổi. Qua khảo sát về vai trò của cytokinin lên sự tạo chồi, chúng tôi nhận thấy kinetin nồng độ 4 mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao nhất (5,6 chồi/mẫu cấy) sau 8 tuần nuôi cấy. Sự kết hợp giữa kinetin nồng độ 4 mg/l với các loại auxin khác nhau (IBA, NAA và 2,4-D) không làm tăng hiệu quả tạo chồi so với kinetin riêng lẻ nhưng chồi mới hình thành có kích thước lớn. Sự hiện diện của GA3/adenine giúp tăng hiệu quả tạo chồi. Kết quả khảo sát cho thấy 4 mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 hoặc 10 mg/l adenine có hiệu quả tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành trên một mẫu cấy lần lượt là 7,8 và 9,73 chồi sau 8 tuần nuôi cấy.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 TĂNG HỆ SỐ NHÂN NHANH CHỒI CÂY HOA SALEM TÍM (Limonium sinuatum L Mill) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG KẾT HỢP CÁC CHẤT ĐIỀU HỊA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ADENINE TRONG NI CẤY IN VITRO Nguyễn Thị Huyền Trang*, Lê Thị Thủy Tiên Trường Đại học bách khoa, ĐHQG Hồ Chí Minh, nguyenthihuyentrang171@gmail.com TĨM TẮT: Để góp phần tìm mơi trường tối ưu cho mục đích nhân giống hoa salem tím (Limonium sinuatum L Mill) in vitro, nghiên cứu thực nhằm khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp mẫu cấy, ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật, GA3 adenine lên giai đoạn nhân chồi Môi trường sử dụng môi trường MS bản, có bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose g/l agar Các thí nghiệm trì điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 lux nhiệt độ 25 ± 2ºC Nguyên liệu thích hợp lựa chọn chồi in vitro tuần tuổi Qua khảo sát vai trò cytokinin lên tạo chồi, nhận thấy kinetin nồng độ mg/l có tác động kích thích tạo chồi cao (5,6 chồi/mẫu cấy) sau tuần nuôi cấy Sự kết hợp kinetin nồng độ mg/l với loại auxin khác (IBA, NAA 2,4-D) không làm tăng hiệu tạo chồi so với kinetin riêng lẻ chồi hình thành có kích thước lớn Sự diện GA3/adenine giúp tăng hiệu tạo chồi Kết khảo sát cho thấy mg/l kinetin kết hợp với 10 mg/l GA3 10 mg/l adenine có hiệu tạo chồi cao với số lượng chồi trung bình hình thành mẫu cấy 7,8 9,73 chồi sau tuần nuôi cấy Từ khóa: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA MỞ ĐẦU Salem có tên khoa học Limonium sinuatum L Mill, thuộc họ Bạch hoa đan (Plumbaginaceae) Chi Limonium có khoảng 150 lồi hoang dã [3] Salem xuất xứ từ Địa Trung Hải có mặt Đà Lạt từ trước năm 1975 Vùng trồng hoa salem phổ biến Đà Lạt Đa Thiện, Thái Phiên nhiều nơi khác Trên giới, có nhiều tác giả tiến hành nghiên cứu đối tượng nuôi cấy tế bào để khảo sát khả tái sinh [3], loại bỏ vi khuẩn ký sinh gây hoại tử vi nhân giống [9] hay tạo lai loại Limonium perezii Limonium sinuatum [5] Trong vài năm gần đây, phận nông dân Đà Lạt sử dụng giống hoa bị thối hóa, có salem, dẫn đến sản lượng thấp, màu sắc độ bền Bên cạnh đó, nguồn giống chưa chủ động, cho nên, thị trường cần số lượng lớn sản xuất khơng đáp ứng [8] Phương pháp vi nhân giống phương pháp hiệu tạo số lượng giống lớn, ổn định mặt di truyền, mà nâng cao chất lượng giống Xuất phát từ yêu cầu thực tế nhằm sản xuất lượng lớn giống salem có chất lượng cao ổn định, đề tài thực với mục đích khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên nhân chồi salem in vitro, giai đoạn quan trọng công tác vi nhân giống PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chồi in vitro sử dụng để làm vật liệu thí nghiệm Hạt giống tạo hạt giống hoa salem thương mại cung cấp công ty TNHH Hạt Giống Hoa Việt Nam, mã số: FVN STA011 Golf Dark Blue, Hoa Kỳ Phương pháp Môi trường nhân chồi môi trường Murashige Skoog (1962) (MS) [6] bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose, g/l agar chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác Các mơi trường chỉnh pH 5,8 trước hấp tiệt trùng 121ºC, atm thời gian 15 phút Các thí nghiệm trì điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 lux nhiệt độ 25 ± 2ºC Khử trùng hạt Hạt khử trùng với dung dịch Javel thương mại 50% thời gian phút Môi 219 Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien trường gieo hạt môi trường MS bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 20 g/l sucrose g/l agar chất khảo sát là: GA3 nồng độ 3; 5; 10 mg/l Adenine nồng độ 5; 10; 15 20 mg/l Khảo sát tuổi sinh lý thích hợp mẫu cấy cho tạo chồi Chồi 4; tuần tuổi nuôi cấy môi trường nhân chồi môi trường MS bổ sung mg/l kinetin, 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l sucrose g/l agar Kết độ tuổi sinh lý thích hợp cho tạo chồi sử dụng cho tất thí nghiệm khảo sát nhân chồi báo cáo Phân tích xử lý số liệu Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng mẫu tạo chồi, số lượng chồi hình thành hình thái chồi sau 4; tuần nuôi cấy Ảnh hưởng cytokinin lên tạo chồi Mẫu cấy chồi có tuổi sinh lý thích hợp kết thí nghiệm trước ni cấy mơi trường bổ sung BA (0; 0,2; 0,5; 1; 2; 3; mg/l) kinetin (0,5; 1; 2; 3; 4; mg/l) nhằm tìm loại nồng độ cytokinin thích hợp cho việc nhân chồi salem Kết cytokinin thích hợp cho cảm ứng tạo chồi salem sử dụng cho thí nghiệm Ảnh hưởng kết hợp cytokinin auxin lên tạo chồi Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng thí nghiệm IBA; 2,4-D NAA nồng độ 0,05; 0,1 0,2 mg/l kết hợp với loại cytokinin có nồng độ cảm ứng tạo chồi hiệu thu từ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng cytokinin So sánh hiệu tạo chồi môi trường khảo sát với môi trường bổ sung cytokinin riêng lẻ Mơi trường có kết tạo chồi cao sử dụng cho thí nghiệm Ảnh hưởng GA3, adenine lên tạo chồi GA3 adenine bổ sung riêng lẻ vào môi trường MS có diện chất điều hòa sinh trưởng thực vật cảm ứng tạo chồi hiệu từ thí nghiệm trước Nồng độ Mỗi thí nghiệm thực với bình, bình chứa mẫu cấy Số liệu ghi nhận xử lý phần mềm SPSS theo phương pháp Duncan mức ý nghĩa 0,05 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát độ tuổi sinh lý thích hợp mẫu cấy cho tạo chồi Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro thường nhắc đến thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy, mẫu cấy Trong đó, yếu tố mẫu cấy chia làm hai nhóm: lựa chọn mẫu cấy xử lý mẫu cấy Các nhân tố chọn mẫu bao gồm kiểu gen, quan chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe mẫu nguồn mẫu Trong báo cáo này, tiến hành khảo sát nguồn mẫu hạt, độ tuổi sinh lý mẫu cấy ảnh hưởng đến hiệu nhân chồi nuôi cấy Ba độ tuổi sinh lý khác khảo sát ghi nhận kết sau 4; tuần ni cấy mơi trường có bổ sung mg/l kinetin trình bày bảng Kết cho thấy, có khác biệt rõ rệt khả tạo chồi mẫu cấy có độ tuổi khác Mẫu cấy tuần tuổi có khả tạo chồi cao với số lượng chồi mẫu cấy ban đầu 5,87 chồi sau tuần nuôi cấy (hình 1b) Tỷ lệ tạo chồi mẫu cấy tuần tuổi cao so với mẫu cấy tuần tuổi Bảng Ảnh hưởng độ tuổi mẫu cấy đến hiệu nhân chồi Sau tuần Sau tuần Tuổi mẫu cấy Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng (tuần) chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu tuần 13,33a* 1,13a 66,67a 2,53a tuần 80,00b 2,67b 93,33b 4,20b tuần 6,67a 1,07a 13,33c 1,33c Sau tuần Tỉ lệ tạo Số lượng chồi (%) chồi/mẫu 80,00a 5,27a 100,00b 5,87a 40,00c 2,13b Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan 220 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 Quan sát hình thái mẫu cấy sau tuần ni cấy mơi trường có bổ sung mg/l kinetin, nhận thấy mẫu cấy ban đầu khơng có gia tăng kích thước, hình thành có kích thước nhau, chiều dài cm Chồi xuất nách gốc chồi ban đầu (hình 1a) Điều chứng minh diện kinetin mơi trường ni cấy có tác động ức chế tượng ưu tính để kích thích hình thành tăng trưởng chồi mới, tạo cụm chồi Ở mẫu cấy tuần tuổi sau tuần nuôi cấy, chồi ban đầu tiếp tục gia tăng chiều cao tạo (hình 1c) Như vậy, nhóm mẫu cấy tượng ưu tính chồi ban đầu khơng bị ức chế hồn tồn, chồi hình thành chủ yếu nách Đây có lẽ nguyên nhân làm cho số lượng chồi hình thành thấp so với mẫu cấy tuần tuổi Như vậy, mẫu cấy chồi từ tuần tuổi có tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi cao, số lượng chồi hình thành cao mẫu cấy tuần tuần tuổi (hình 1a, b, c) nên lựa chọn để tiến hành thí nghiệm nhằm tìm mơi trường hiệu cho việc nhân giống hoa salem Ảnh hưởng cytokinin lên tạo chồi Bảng Ảnh hưởng kinetin đến tạo chồi mẫu cấy chồi từ tuần tuổi Cytokinin Sau tuần Sau tuần Sau tuần BA Kinetin Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng Tỉ lệ tạo Số lượng (mg/l) (mg/l) chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu chồi (%) chồi/mẫu 0,00a* 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,2 20,00b 1,20a 20,00b 1,27a 20,00c 1,27a 0,5 6,67a 1,07a 20,00b 1,20a 20,00c 1,20a 0,00a 1,00a 6,67a 1,07a 6,67ab 1,07a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 6,67a 1,07a 6,67a 1,07a 6,67ab 1,07a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,2 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,5 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 0,00a 1,00a 13,33bc 1,13a 46,67de 2,13b 66,67c 3,00b 93,33d 3,93b 53,33e 2,13b 73,33c 3,07b 93,33d 4,80bc 86,67f 2,27b 86,67d 3,73b 100,00d 5,60c 33,33c 2,07b 93,33d 3,60b 100,00d 5,73c Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan Sau tuần khảo sát môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA cảm ứng tạo chồi không hiệu Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi số lượng chồi mẫu cấy cao mơi trường có bổ sung 0,2 mg/l BA với tỷ lệ tạo chồi số lượng chồi trung bình thấp (20,00% 1,27 chồi/mẫu cấy), khơng có khác biệt mặt thống kê so với mẫu đối chứng (hình 1i) Kết thể bảng cho thấy, kinetin có hiệu cao tạo chồi hoa salem Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi số lượng chồi tăng dần nồng độ kinetin tăng, đặc biệt khoảng nồng độ từ đến mg/l Nghiệm thức bổ sung mg/l kinetin cho kết tạo chồi thấp tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt 13,33% Các nồng độ lại có hiệu tạo chồi cao đặc biệt kinetin nồng độ mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi 100% sau tuần nuôi cấy Tuy nhiên nồng độ kinetin mg/l nồng độ cao, gây biến dị không mong muốn, quan sát mẫu cấy phát có biểu bất thường hình thái Ở nghiệm thức sử dụng mg/l kinetin, số lượng chồi tạo thành 221 Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien mẫu cấy ban đầu 5,60 chồi/mẫu cấy, khác biệt khơng có ý nghĩa với kinetin nồng độ mg/l (5,73 chồi/mẫu cấy) tỉ lệ tạo chồi đạt 100% Trong nghiên cứu nhân giống Limonium cavanillesii Erben Amo-Marco et al (1998) [1], kinetin loại cytokinin có kết nhân chồi tốt với khoảng nồng độ từ đến mg/l Trong báo cáo này, tác giả khảo sát ảnh hưởng BA lên nhân chồi mẫu cấy cho kết cao khoảng nồng độ BA 0,1 đến 0,5 mg/l kết thấp môi trường bổ sung kinetin nồng độ từ đến mg/l Ở nồng độ BA cao mà tác giả khảo sát (1; 2; mg/l) cho tỷ lệ tạo chồi số chồi trung bình giảm Tomoko Igawa et al (2002) [3] sử dụng BA nghiên cứu tái sinh từ nuôi cấy tế bào Limonium sinuatum Mill nồng độ 0,1 1,0 mg/l chồi hình thành mơi trường bổ sung 0,1 mg/l BA với tỷ lệ tạo chồi đạt 3,3% số chồi hình thành trung bình 0,3 chồi Trong kết Jeong et al (2001) [4] khảo sát ảnh hưởng số cytokinin riêng lẻ kết hợp với auxin lên tạo chồi Limonium sinuatum cho thấy BA riêng lẻ cảm ứng tốt nồng độ thấp 1,11 µM (tương ứng 0,25 mg/l) giảm dần tăng nồng độ BA lên Ở nồng độ 8,88 µM BA (tương ứng mg/l) khơng có chồi hình thành Báo cáo cho thấy BA không hiệu cảm ứng nhân chồi đối tượng Như báo cáo cho thấy với đối tượng Limonium sinuatum BA riêng lẻ cảm ứng tạo chồi nồng độ thấp khơng hiệu tỷ lệ tạo chồi số lượng chồi hình thành thấp chất cảm ứng khác khảo sát Điều phù hợp với số liệu mà thu nhận BA khơng thích hợp để cảm ứng với đối tượng này, kinetin cảm ứng tạo chồi hiệu nồng độ mg/l Do chọn kinetin nồng độ mg/l để tiếp tục thí nghiệm Ảnh hưởng kết hợp cytokinin auxin lên tạo chồi Bảng Ảnh hưởng phối hợp auxin mg/l kinetin lên tạo chồi mẫu cấy chồi từ tuần tuổi Auxin (mg/l) Kinetin (mg/l) IBA 2,4-D NAA - - - Sau tuần Số Tỉ lệ tạo lượng chồi chồi/ (%) mẫu 86,67a* 2,27ab Sau tuần Số Tỉ lệ tạo lượng chồi (%) chồi/ mẫu 86,67bc 3,73c Sau tuần Số Tỉ lệ tạo lượng chồi (%) chồi/ mẫu 100,00a 5,60d 0,05 - - 66,67b 2,67a 100,00a 4,07c 100,00a 5,27d 0,1 - - 66,67b 1,93ab 86,67bc 3,33c 100,00a 5,07d 0,2 - - 60,00bc 2,20ab 86,67bc 3,73c 93,33ab 4,93d - 0,05 - 53,33cd 1,80ab 80,00cd 3,47c 93,33ab 5,20d - 0,1 - 40,00ef 1,53b 73,33d 2,80c 86,67b 4,67d - 0,2 - 33,33f 1,47b 80,00cd 2,80c 86,67b 4,53d - - 0,05 46,67de 1,67b 86,67bc 3,87c 86,67b 4,20d - - 0,1 53,33cd 1,87ab 93,33ab 3,40c 100,00a 4,73d - - 0,2 60,00bc 2,20ab 80,00cd 3,40c 100,00a 4,47d Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan 222 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 Auxin kết hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân sinh chồi từ nhu mô Gaspar et al (2003) [2] cho thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết cao sử dụng cytokinin nồng độ cao auxin nồng độ từ thấp đến trung bình Do đó, auxin thí nghiệm sử dụng nồng độ thấp nhằm khảo sát tác động phối hợp auxin kinetin tạo chồi hoa salem Sau tuần khảo sát môi trường bổ sung auxin với loại nồng độ khác nhau, hiệu tạo chồi cao nghiệm thức có 0,05 mg/l IBA (5,27 chồi/mẫu cấy), 0,05 mg/l 2,4-D (5,20 chồi/mẫu cấy) 0,1 mg/l NAA (4,73 chồi/mẫu cấy) (bảng 3) Tuy nhiên, số lượng chồi tạo thành trung bình mẫu cấy ban đầu môi trường thấp môi trường bổ sung kinetin riêng lẻ khác biệt khơng có ý nghĩa Như vậy, kết hợp với mg/l kinetin diện auxin không giúp nâng cao hiệu tạo chồi hoa salem IBA loại auxin có độ bền khơng cao, sau 30 ngày ngồi sáng nồng độ IBA giảm 60% [7] Trong đó, quan sát nhận thấy mẫu cấy chồi salem có biểu đáp ứng tạo chồi tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật sau tuần nuôi cấy Như vậy, mẫu cấy cần thời gian cảm ứng dài khoảng thời gian IBA bị giảm hoạt tính nên tác động IBA đến mẫu cấy không rõ rệt Trên mơi trường có diện 2,4-D, có hình thành mơ sẹo nhỏ cuống lá, nơi tiếp xúc với mơi trường ni cấy (hình 1e) Mơ sẹo xuất có màu trắng, sau bị nâu hóa 2,4-D loại auxin mạnh, có vai trò quan trọng kích thích phân chia tế bào tạo mô sẹo Tuy vậy, số lượng mơ sẹo hình thành thí nghiệm 2,4-D sử dụng với nồng độ thấp Về hình thái mẫu cấy, chồi tạo thành tất môi trường bổ sung auxin có kích thước lớn chồi tạo thành môi trường bổ sung mg/l kinetin Trong đó, chiều cao chồi hình thành mơi trường bổ sung NAA lớn chồi môi trường có bổ sung IBA hay 2,4-D (Hình 1d, e, f) Ở nhiều loài thực vật, việc kết hợp auxin nồng độ thấp với cytokinin giúp nâng cao hiệu tạo chồi Nhưng nghiên cứu này, với loại auxin tiến hành khảo sát 2,4-D, NAA IBA kết khơng có khác biệt thấp so với sử dụng kinetin riêng lẻ Tuy nhiên, việc sử dụng auxin kết hợp với kinetin giúp chồi hình thành có kích thước lớn, dễ tách thành chồi riêng biệt để chuyển sang môi trường tạo rễ Ảnh hưởng GA3 lên tạo chồi Bảng Ảnh hưởng phối hợp GA3 mg/l kinetin lên tạo chồi mẫu cấy chồi từ tuần tuổi Kinetin (mg/l) GA3 (mg/l) 4 4 10 Sau tuần Tỉ lệ tạo Số lượng chồi (%) chồi/ mẫu 86,67a* 2,27a 26,67b 1,40b 33,33bc 1,53b 53,33d 1,73ab 40,00cd 1,60ab Sau tuần Tỉ lệ tạo Số lượng chồi (%) chồi/ mẫu 86,67a 3,73c 100,00b 4,13c 100,00b 4,27c 93,33ab 4,00c 100,00b 4,73c Sau tuần Tỉ lệ tạo Số lượng chồi (%) chồi/ mẫu 100,00a 5,60d 100,00a 5,87d 100,00a 6,27de 100,00a 6,53de 100,00a 7,80e Các chữ a,b,c… thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy P = 0,05 05 theo phương pháp Duncan Có nhiều kết khác tác động GA3 đối tượng mẫu cấy khác Mẫu cấy thực vật nói chung tăng trưởng phát triển khơng cần đến diện gibberellin môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, tăng trưởng chồi từ đỉnh sinh trưởng chồi bên gia tăng bổ sung thêm gibberellin Ở số loài thực vật, acid 223 Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien gibberellic riêng lẻ cảm ứng tạo chồi bất định mô sẹo Ranunculus scleratus hay thay cho vai trò auxin trình cảm ứng tạo chồi [7] Trong thí nghiệm này, GA3 bổ sung vào môi trường nuôi cấy với mg/l kinetin nhằm khảo sát tác động hỗ trợ gibberellin với kinetin cảm ứng tạo chồi hoa salem Kết ghi nhận cho thấy môi trường cảm ứng tạo chồi với diện mg/l kinetin GA3 nồng độ 3; 5; 10 mg/l cho hiệu tạo chồi cao môi trường bổ sung kinetin riêng lẻ (Bảng 4) Kết cao thí nghiệm mơi trường bổ sung 10 mg/l GA3 (7,80 chồi/mẫu cấy) Các chồi tạo thành (Hình 1g) có kích thước lớn so với chồi mơi trường có kinetin (số liệu cụ thể không đưa ra) Từ kết thu nghiên cứu này, nhận thấy kết hợp mg/l kinetin GA3 giúp tăng hệ số nhân chồi hoa salem Số lượng chồi hình thành tăng theo gia tăng nồng độ GA3 Không thu số lượng chồi lớn mẫu cấy mà kích thước chồi hình thành gia tăng, chồi khỏe, dễ tách thành chồi đơn Ảnh hưởng adenine lên tạo chồi Trong số trường hợp, người ta thường phối hợp cytokinin với adenine để cảm ứng tạo chồi Trong thí nghiệm ni cấy Begonia, thuốc lá, du, Plumbago indica cần adenine đủ cảm ứng tạo chồi (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [7] Bảng Ảnh hưởng phối hợp adenine mg/l kinetin lên tạo chồi mẫu cấy chồi từ tuần tuổi Sau tuần Sau tuần Sau tuần Kinetin Adenine Tỉ lệ Tỉ lệ Tỉ lệ Số lượng Số lượng Số lượng (mg/l) (mg/l) tạo chồi tạo chồi tạo chồi chồi/ mẫu chồi/ mẫu chồi/ mẫu (%) (%) (%) 86,67a* 2,27a 86,67a 3,73bc 100,00a 5,60d 20,00b 1,60a 100,00b 4,93bc 100,00a 7,73de 10 66,67d 2,20a 100,00b 5,20b 100,00a 9,73e 15 46,67e 1,93a 100,00b 4,67bc 100,00a 7,60de 20 33,33b 1,60a 100,00b 3,53c 100,00a 5,53d Các chữ a, b, c thể khác biệt có ý nghĩa mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan Kết thí nghiệm cho thấy kết hợp mg/l kinetin với adenine giúp làm tăng hiệu tạo chồi so với sử dụng kinetin riêng lẻ (Bảng 5) Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt 100% tuần nuôi cấy thứ với tất nồng độ adenine khảo sát Số lượng chồi tạo cao so với đối chứng kết hợp mg/l kinetin với adenine nồng độ 5; 10 15 mg/l Trong đó, nồng độ adenine thích hợp 10 mg/l với số lượng chồi trung bình hình thành từ mẫu cấy ban đầu 9,73 chồi Nồng độ adenine cao 10 mg/l làm giảm khả tạo chồi mẫu cấy Chồi hình thành có hình thái bình thường kích thước lớn so với đối chứng tất nồng độ (hình 1h) Việc sử dụng kết hợp adenine với kinetin 224 cho kết tạo chồi tăng cao giải thích qua vai trò tiền chất đường sinh tổng hợp cytokinin adenine Như vậy, việc bổ sung adenine vào môi trường kết hợp với kinetin làm tăng hiệu tạo chồi KẾT LUẬN Như vậy, nghiên cứu này, xác định mẫu cấy thích hợp cho mục đích nhân chồi chồi từ in vitro tuần tuổi Ở nồng độ kinetin khảo sát, kinetin nồng độ mg/l thích hợp cho tạo chồi Sự diện loại auxin IBA, 2,4-D NAA nồng độ 0,05; 0,1 0,2 mg/l không làm tăng hiệu tạo chồi giúp gia tăng kích thước chồi tạo thành so với TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 219-226 môi trường bổ sung mg/l kinetin Adenine gibberellin có tác động kích thích tạo chồi bổ sung vào môi trường nuôi cấy kết hợp với mg/l kinetin Không giúp nâng cao số lượng chồi mới, chất thúc đẩy tăng trưởng chồi Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới hỗ trợ trang thiết bị để hoàn thành đề tài Hình Sự tạo chồi từ mẫu cấy sau tuần nuôi cấy (thang đo 1cm) a Mẫu cấy tuần tuổi môi trường MS + mg/l kinetin; b Mẫu cấy tuần tuổi môi trường MS + mg/l kinetin; c Mẫu cấy tuần tuổi môi trường MS + mg/l kinetin; d mg/l kinetin + 0,05 mg/l IBA; e mg/l kinetin + 0,05 mg/l 2,4-D; f mg/l kinetin + 0,1 mg/l NAA; g mg/l kinetin + 10 mg/l gibberellin; h mg/l kinetin + 10 mg/l adenine; i 0,2 mg/l BA TÀI LIỆU THAM KHẢO Amo-Marco J B and Ibanez M R., 1998 Micropropagation of Limonium cavanillesii Erben, a threatened statice,from inflorescence stems Plant Growth Regul., 24: 49-54 Gaspar T., Kevers C., Faivre-Rampant O., Crèvecoeur M., Penel C., Gerppin H and Dommes J., 2003 Changing concept in plant hormone action In Vitro Cell Dev Pl., 39(2):85-106 Igawa T., Hoshina Y and Mii M., 2002 Effcient plant regeneration from cell cultures of ornamental Statice, Limonium sinuatum Mill In Vitro Cell Dev Pl., 38: 157-162 Jeong J H., Murthy H N and Paek K Y., 2001 High frequency adventitious shoot induction and plant regeneration from leaves of statice Plant Cell Tiss Org., 65: 123-128 Morgan E R., Burge G K., Seelye J F., Hopping M E and Grant J E., 1998 Production of interspecific hybrids between Limonium perezii (Stapf) Hubb and Limonium sinuatum (L.) Mill Euphytica., 102: 109-115 225 Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien Murashige T and Skoog F., 1962 A revised medium for rapid growth and Bio-assays with tobacco tissue cultures Phys Plant, 15: 473-497 Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006 Công nghệ tế bào Nxb Đại học quốc gia Hồ Chí Minh Phạm S., 2007 Những giải pháp mở rộng thị trường tiêu thụ sản phẩm hoa cắt cành Đà Lạt - Lâm Đồng: 333-339 Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Tsu-Hwie A L., Nai-Wen H and Rey-Yuh W., 2005 Control of leaf-tip necrosis of micropropagated ornamental Satice by elimination of endophytic bacteria In Vitro Cell Dev Pl., 41: 546-549 HIGH FREQUENCY SHOOT REGENERATION OF DARK BLUE STATICE (Limonium sinuatum L Mill) BY COMBINING PHYTOHORMONES WITH ADENINE IN IN VITRO CULTURE Nguyen Thi Huyen Trang, Le Thi Thuy Tien Ho Chi Minh city University of Technology SUMMARY In the purpose of optimizing the micropropagation of dark blue Statice (Limonium sinuatum L Mill), the appropriate age of explants, the effects of phytohormones, GA3 and adenine on Statice shooting were studied MS medium (Murashige and Skoog, 1962) with 100 mg/l myo-inositol, 30 g/l saccharose, g/l agar was used in all experiments The cultures were in 16h photoperiod, light intensity of 2800 lux and at a temperature of 25 ± 2ºC The best suitable explants were shoots from six-week seedlings in vitro In the influence of cytokinin, mg/l kinetin was the best result for statice shooting (5.6 shoots per explant) after weeks of culture The number of shoots per explant on MS medium supplemented with mg/l kinetin and auxin (IBA, NAA or 2,4-D) was lower than MS medium with mg/l kinetin but the size of shoots was raised The presence of GA3/adenine increased shoot sprouting The combination of mg/l kinetin with 10 mg/l GA3 or 10 mg/l adenine raised the number of shoots per explant (7.8 and 9.73 shoots per explant, respectively) after weeks of culture Keywords: Limonium sinuatum, 2,4-D, adenine, BA, GA3, IBA, kinetin, NAA Ngày nhận bài: 21-6-2012 226 ... Việc sử dụng kết hợp adenine với kinetin 224 cho kết tạo chồi tăng cao giải thích qua vai trò tiền chất đường sinh tổng hợp cytokinin adenine Như vậy, việc bổ sung adenine vào môi trường kết hợp. .. tạo chồi salem sử dụng cho thí nghiệm Ảnh hưởng kết hợp cytokinin auxin lên tạo chồi Các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng thí nghiệm IBA; 2,4-D NAA nồng độ 0,05; 0,1 0,2 mg/l kết. .. thấy kết hợp mg/l kinetin GA3 giúp tăng hệ số nhân chồi hoa salem Số lượng chồi hình thành tăng theo gia tăng nồng độ GA3 Không thu số lượng chồi lớn mẫu cấy mà kích thước chồi hình thành gia tăng,