Bài viết tổng quan một số thành tựu áp dụng kỹ thuật phân tử DNA trong định loại tuyến trùng epn ở Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
27(3): 5-11 Tạp chí Sinh học 9-2005 áP DụNG CáC Kỹ THUậT DNA Để PHÂN LOạI HAI GIốNG TUYếN TRùNG STEINERNEMA TRAVASSOS, 1927 Vµ HETERORHABDITIS POINAR, 1975 ë VIƯT NAM NGUYễN NGọC CHÂU, PHAN Kế LONG Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Các đặc trng phân tử DNA, đặc biệt vùng phiên m ITS-rDNA, đ trở thành công cụ đắc lực việc định loại tuyến trùng nói chung tuyến trung ký sinh gây bệnh cho côn trïng (entomopathogenic nematodes = epn) thuéc gièng Steinernema vµ Heterorhabditis nói riêng Đặc trng phân tử DNA cho phép phân biệt cấp độ phân loại taxon tuyến trùng mà mối quan hệ họ hàng phả hệ phát sinh chúng Các loµi tuyÕn trïng epn thuéc gièng Steinernema vµ Heterorhabditis loài ký sinh bắt buộc gây bệnh cho côn trùng Đây nhóm tuyến trùng có triển vọng lớn phòng trừ sinh học sâu hại Hiện nay, giới đ phát khoảng 30 loµi thuéc gièng Steinernema vµ loµi thuéc gièng Heterorhabditis Tuy nhiên, việc định loại hình thái loài giống tuyến trùng khó khăn chúng có hình dạng, kích thớc giai đoạn trởng thành giống loài, nhng lại khác hệ loài Mỗi loài tuyến trùng ký sinh nhiều vật chủ côn trùng khác vật chủ, chúng cã thĨ ph¸t triĨn tõ 2-3 thÕ hƯ, phơ thc vào vật chủ Vì vậy, nhóm tuyến trùng này, đặc trng phân tử DNA đợc coi tiêu quan trọng để mô tả loài [2] Nhờ kỹ thuật DNA, số loài valit giảm đáng kể, hàng chục loài hình thái trớc trở thµnh loµi synonym ë ViƯt Nam, tun trïng epn lµ nhóm động vật đợc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại Từ năm 1997 đến nay, đ tiến hành điều tra, thu mẫu từ vùng sinh thái tự nhiên, chủ yếu sinh cảnh rừng nguyên sinh 42 tỉnh Kết đ phân lập đợc gần 50 chủng (isolates) epn [5, 6] Tất chủng đợc trì nhân nuôi kỹ thuật in vivo bớm sáp lớn (Galleria mellonella Lin, 1758) Trên sở phân tích DNA, đ xác định thành công loài epn, loài thuộc giống Steinernema loài thc gièng Heterorhabditis Trong sè nµy, cã loµi míi cho khoa häc thuéc gièng Steinernema lµ S tami Pham et al, 2000; S sangi Phan et al., 2001a; S loci Phan et al., 2001b vµ S thanhi Phan et al., 2001b đ đợc công bố [6, 7, 8] đợc đăng ký quyền Ngân hàng gien (GenBank) Bài báo tổng quan số thành tựu áp dụng kỹ thuật phân tử DNA định loại tuyến trùng epn Việt Nam I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Phân lập tuyến trùng Các chủng tuyến trùng epn đợc phân lập từ đất theo phơng pháp bẫy Bedding & Akhurst [1] Sư dơng Êu trïng ti bớm sáp lớn (BSL) làm côn trùng bẫy Thu thập tuyến trùng từ BSL theo phơng pháp bẫy nớc White [13] Sau xác định chủng tuyến trùng epn, tiến hành nhiễm trở lại để thu trởng thành ấu trùng chủng (tinh sạch) phục vụ cho phân tích Nghiên cứu đợc tiến hành chủng epn, chủng thuộc gièng Steinernema lµ S-TK10, S-TG10, S-TX1 vµ chđng thc giống Heterorhabditis H-MP11 Các chủng epn đợc phân lập thời gian từ Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình nghiên cứu 1997-1999 Các phân tích đa hình chiều dài đoạn đặc thù (RFLP) trình tự (sequencing) đợc tiến hành Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Merelbeke (CLO), Vơng qc BØ Ngoµi ra, chđng S-TK10, S-TG10 vµ H-MP11 đ đợc phân tích trình tự gien Viện Công nghệ sinh học sau đ đợc kiểm tra CLO Tách chiết nhân đoạn DNA cho phân tích RFLP Quy trình tách chiết nhân đoạn DNA cho phân tích RFLP đợc tiến hành theo Joyce et al [2] vµ Reid et al [9] gåm bớc sau đây: Tách chiết DNA: isolat (chủng phân lập theo địa điểm), gắp cá thể trởng thành từ nguồn nhân nuôi tinh vào ống eppendorf nhỏ đ tiệt trùng, có chứa sẵn 8àl dung dịch đệm WLB (worm lysis buffer, gồm 500 mM KCl; 100 mM Tris-Cl pH = 8,3; 1,5 mM MgCl2; 10 mM DTT; 4,5% Tween 20% gelatin) Cho thêm 10 àl nớc cất lần (ddw) µl proteinaza K (600 µl/ml) NghiÒn mÉu tuyÕn trïng b»ng máy nghiền rung (vibro mixer) vòng 2-3 phút Làm lạnh đến-80oC 60 phút, sau ủ nhiệt độ 65oC 60 phút tiếp tục 95oC 10 phút máy PCR Ly tâm phút 13.000 vòng/phút Lấy àl dịch tuyến trùng để chuẩn bị hỗn hợp PCR, lại bảo quản ë -80oC Cã thĨ dïng mét dao mỉ lo¹i nhá để cắt tuyến trùng (đặt sẵn lam lõm có chứa 10 àl ddw) thành nhiều mảnh dới kinh hiển vi soi thay cho công đoạn xay nghiền; sau dùng pipet hút àl có chứa mảnh tuyến trùng vào ống eppendorf, thêm 8àl dung dịch đệm àl proteinaza K; ủ nh sau để lạnh -80oC 60 phút Phản ứng trùng hợp (PCR): chuẩn bị hỗn hợp cho PCR bao gồm 10 àl dịch tuyến trùng, àl 10x PCR buffer, àl MgCl2 (25 mM), 1àl hỗn hợp dNTP (10 mM), 0,2àl (500 nM) mồi, 1,5U Taq polymeraza 33,3 àl ddw để có đợc khối lợng đủ 50 àl cho mẫu Hai đoạn mồi đợc sử dụng phản ứng PCR Vrain2 18S (> 5-CTTTGTACACACCGCCCGTCGCT-3) Vrain2 26S (>5- TTTCACTCGCCGTTACTAAGGGAATC-3) [11] Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đợc lập trình máy PCR nh sau: 92oC phót, 35 chu kú ë 92oC 30 giây, tiếp 54oC 30 giây trùng hợp (polymerization) 72oC phút 72C 10 phút sau đ kết thúc 35 chu kú trªn Sau PCR kÕt thóc, lÊy àl dung dịch PCR-DNA thêm àl dung dịch đệm diện di (loading buffer), chạy điện di gel 1% agaroza 0,003% ethidium bromit (0,02 àg/ml) điện thÕ 100 V thêi gian giê KiÓm tra kết phản ứng PCRDNA chụp ảnh dới đèn cực tím Phân tích RFLP: mẫu PCR-DNA sử dụng àl sản phẩm PCR cho phân giải với số 17 enzym đặc thù (endoenzyme) sau: Alu I, Mva I, Dde I, EcoR I, Hae III, Cfo I, Hind III, Hinf I, Msp I, Kpn I, Pst, Pvu II, Rsa I, Sal I, Nde II, Bsiz I Xba I Sử dụng tủ định ôn nớc (water-incubator) cho phản ứng cắt đoạn DNA 37C 24 Các bớc chạy điện di, kiểm tra chụp ảnh RFLP, sau nh mô tả phần Các kết RFLP đợc so sánh với sở liệu RFLP EPN đợc lu trữ Viện Ký sinh trùng học quốc tế Vơng quốc Anh Các sản phẩm PCR-DNA đợc gắn vào vectơ pBluescript KS (-) Sau đó, plasmit tái tổ hợp đợc biến nạp vào chủng E.Coli DH5a Tách chiết DNA plasmit kỹ thuật DNA tái tổ hợp đợc tiến hành theo Sambrook et al [10] Trình tự gien đợc đọc máy ALF express đợc xử lý chơng trình PC/GEN II KếT QUả Và THảO LUậN Phân tích RFLP-rDNA Về mặt hình thái, chủng tuyến trùng STK10, S-TG10 S-TX1 gần kích thớc cá thể đực cá thể nh cấu trúc spicule gubernaculum đực Chúng khác chiều dài thể, chiều dài đuôi vị trí lỗ tiết ấu trùng cảm nhiễm Tuy nhiên, khác biệt quan trọng chủng mặt sinh thái sinh học: khác xa sinh cảnh nơi phát Chủng STK10 đợc phân lập từ sinh cảnh b i cát ven biển, chủng S-TG10 đợc phát từ sinh cảnh vờn nhà chủng S-TX1 đợc phân lập từ sinh cảnh rừng nguyên sinh Cả Maker M aker2 S.feltiae Alu I Alu I MvaI Dde I EcoR I Hae III CfoI Hind III Hinf I Msp I Kpn I Pst I Pvu II Rsa I Sal I Nde II Bsiz I Xba I Steinernema loci Phan et al, 2001 Steinernema glaseri (Steiner, 1929) Wouts et al., 1982 Maker M aker2 S.feltiae Alu I Alu I MvaI Dde I EcoR I Hae III CfoI Hind III Hinf I Msp I Kpn I Pst I Pvu II Rsa I Sal I Nde II Bsiz I Xba I M aker2 Maker Maker M aker2 S.feltiae Alu I Alu I MvaI Dde I EcoR I Hae III CfoI Hind III Hinf I Msp I Kpn I Pst I Pvu II Rsa I Sal I Nde II Bsiz I Xba I M aker2 Maker Steinernema arenarium (Artyukhovsky, 1967) Wouts et al., 1982 s¶n cđa chóng ấu trùng BSL số sâu hại khác khác biệt Steinernema thanhi Phan et al, 2001 Maker M aker2 S.feltiae Alu I Alu I MvaI Dde I EcoR I Hae III CfoI Hind III Hinf I Msp I Kpn I Pst I Pvu II Rsa I Sal I Nde II Bsiz I Xba I M aker2 địa điểm phát cách xa kinh, vĩ tuyến Thêm vào đó, khả nhiễm sinh Steinernema kraussei (Steiner, 1923) Travassos, 1927 H×nh MÉu vạch RFLP loài Steinernema sangi, S loci vµ S thanhi tõ ViƯt Nam so víi loµi S arenarium, S glaseri S kraussei Kết phân tích đa hình chiều dài đoạn DNA ®Ỉc thï cđa vïng ITS-rDNA cđa chđng tun trïng S-TK10, S-TG10 S-TX1 Việt Nam so sánh với mẫu PCR-RFLP đợc lu trữ Viện Ký sinh trùng học quốc tế Anh (IIP-CABI) loài gần gũi khác Steinernema arenarium (Artyukhovsky, 1967) Wouts, Mracek, Gerdin & Bedding, 1982, S glaseri (Steiner, 1929) Wouts, Mracek, Gerdin & Bedding, 1982 vµ S kraussei (Steiner, 1923) Travassos, 1927 cho thấy: mẫu vạch chủng Steinernema khác biệt với mẫu vạch loài đ biết (hình 1) Sự khác biệt thể rõ số vạch điện di thu đợc kích thớc (bp) đoạn DNA đặc thù Đặc biệt, mặt hình thái, coi loài Steinernema Việt Nam gần với loài S kraussei, xếp loài vào nhóm loài lớn Tuy nhiên, so sánh kết điện di mẫu ITS-rDNA gi÷a chđng epn cđa ViƯt Nam víi mÉu vạch loài S kraussei, có sai khác râ bëi cã Ýt nhÊt vÕt RFLP kh¸c hoàn toàn (xem bảng) Chúng khác số lợng đoạn giới hạn đợc cắt mà khác dộ dài đoạn DNA mẫu vạch RFLP sai khác đợc cắt đoạn enzym lµ Alu I, Dde I, Cfo I, Hinf I, Msp I, Rsa I, Nde II Trong sè c¸c enzym lại, có enzym khả tiêu hóa DNA Mva I, Hind III, Kpn I Pst enzym khác cho kết phân cắt tơng đồng, cho thấy loài/chủng epn Việt Nam thuộc nhóm loài S kraussei Kết phân tích PCR-RFLP đợc coi quan trọng đáng tin cậy để phân biệt mô tả loài tuyến trùng từ Việt Nam lµ Steinernema sangi (chđng S-TX1), S loci (chđng S-TK10) S thanhi (chủng S-TG10) Bảng Kích thớc đoạn ITS-rDNA chủng Steinernema Việt Nam đợc cắt 17 enzym đặc thù so với loài S kraussei Enzym Mva I S sangi (S-TX1) 700, 280, 80, 500, 400, 160 1050 Dde I 700, 155, 50 Alu I EcoR I 500, 480, 260, 260, 280, 280 1050 510, 270, 140, 140 1050 S loci (S-TK10) 320, 210, 200, 180, 100, 40 1050 680, 180, 60 (3 bands) S thanhi (S-TG10) 400, 200, 200, 150, 120 1050 S kraussei 450, 280, 200, 120 1050 750, 180, 60, 60 950, 100 1050 1050 1050 1050 910, 140 1050 880, 170 820, 230 1050 920, 130 700, 230, 120 920, 120 1050 1050 750, 300 700, 500, 250, 230, 150 1050 950, 100 1050 1050 1050 Hinf I 650, 250, 170 Msp I Kpn I Pst Pvu II 650, 260, 150 1050 1050 1050 Rsa I 420, 260, 240, 140 Sal I 1050 1050 1050 1050 525, 525, 900, 150 900, 150 1050 1050 800, 250 500, 220, 180, 180 1050 Nde II 370, 230, 180, 180, 100 550, 310, 200 550, 350, 180 Bsiz I Xba I 1050 1050 1050 800, 280 1050 750, 300 Hae III Cfo I Hind III 700, 210, 140 810, 240 390, 320, 210, 130 1050 1050 phiên m (Internal Transcribed Spacer-ITS) nh hình Đây vùng chứa gien có tính bảo tồn di truyền cao nên có lợi cho phân tích trình tự để đánh giá so sánh đặc trng sai khác mặt di truyền loài để xác định chủng loại phát sinh chúng [6] Phân tích trình tự đoạn gien 18S rDNA Đ sử dụng chủng epn, chủng thuộc giống Steinernema S-TK10, S-TG10 chủng thuộc giống Heterorhabditis H-MP11 cho phân tích trình tự phần đoạn gien 18S rDNA Đoạn 18S rDNA n»m trc vïng 18S 5,8S ITS1 ITS2 26S H×nh Sơ đồ vùng phiên m rDNA Các đoạn rDNA ®−ỵc Chromas 1.45 ClustalX 1.64 gien (sequence) cđa vïng 18S chỉnh (alignment) xếp chơng trình với đoạn gien 18S rDNA loài khác thuéc gièng Steinernema vµ Heterorhabditis thu thËp tõ GenBank phân tích chơng trình PAUP (4.0 beta version) [11] Meloidogyne chitwoodi S intermedium S bicornutum S neocurtilae S monticolum 100 S feltiae S oregonense 77 S carpocasae 94 51 S scapterisci S glaseri 83 95 S thanhi S loci H hawaiiensis H indica 92 H MP1 100 H zealandica 59 H marelatus 92 65 72 99 H downesi H megidis H argentinensis H bacteriophora H×nh Mèi quan hƯ di trun cđa S loci, S thanhi vµ H MP11 Việt Nam với 11 loài thuộc giống Steinernema loài thuộc giống Heterorhabditis kết so sánh trình tự đoạn gien 18S-rDNA So sánh kết phân tích trình tự đoạn 18S rDNA cđa hai loµi S thanhi vµ S loci cïng víi 11 loài thuộc giống Steinernema đ biết cho thấy loài gần (95%) có quan hệ kiểu chị em với loài S glaseri (Steiner, 1929) Wouts, Mracek, Gerdin & Bedding, 1982 (hình 3) Kết phân tích trình tự phù hợp với nghiên cứu hình thái phân tích PCR-RFLP Về mặt hình thái, loài Heterorhabditis sp nov (chủng H-MP11) Việt Nam giống với loài đ đợc phát trớc khu vực châu á-Thái Bình Dơng Heterorhabditis indica Poinar, Karunakar & David 1992 Heterorhabditis hawaiiensis Gardner, Stock & Kaya, 1994 Tuy nhiªn, kÕt phân tích đoạn gien 18S-rDNA cho thấy, mức tơng đồng nhóm nhng loài Heterorhabditis (chủng HMP11) Việt Nam loài riêng biệt (hình 3) Tuy vậy, để có đủ sở kết luận loài mới, cần phân tích trình tự toàn vùng ITS (ITS1+ITS2) ND4 loài so sánh đoạn gien dài nhu vậy, thấy rõ sai khác đặc thù cho kết chuẩn xác Kết so sánh trình tự đoạn gien18S rDNA cho phép xây dựng chủng loại phát sinh thể hiƯn mèi quan hª di trun cđa S loci, S thanhi H MP11 Việt Nam với 11 loài thuộc giống Steinernema loài thuộc giống Heterorhabditis Sơ đồ phát sinh cho thấy khác biệt quan hệ di truyền loài epn thuộc gièng Steinernema vµ Heterorhabditis so víi loµi Meloidogyne chitwoodi Golden, O’ Bannon, Santo & Finley, 1980 III KÕt luËn Lần Việt Nam, kỹ thuật phân tử DNA (PCR-RFLP Sequencing) đ đợc áp dụng thành công để phân loại nhóm tuyến trùng epn Đây mét nh÷ng nhãm tun trïng quan träng nh−ng còng khó phân loại mặt hình thái, hầu hết loài nhóm vừa mang tính đồng hình cao giai đoạn trởng thành hệ nhng chúng dị hình hệ khác loài 10 Trên sở nghiên cứu hình thái đặc trng phân tử DNA, đ xác định loài tuyến trùng epn cđa ViƯt Nam lµ Steinernema sangi, S loci vµ S thanhi Sự sai khác DNA sở vững cho phân loại tuyến trùng, đặc biệt nhóm vừa biểu đồng hình vừa dị hình c¸c pha ph¸t triĨn kh¸c nh− nhãm epn KÕt phân tích DNA, cho phép định loại xác loài tuyến trùng mà bớc đầu đ chØ quan hƯ tiÕn hãa vỊ mỈt di trun cđa loµi tun trïng ë ViƯt Nam (S loci, S thanhi Heterorhabditis sp.) với loài epn khác giới TàI LIệU THAM KHảO Bedding R A & Akhust R J., 1975: Nematologica, 21: 109-110 Hominick W M et al., 1997: J Helminthology, 71: 271-298 Joyce S A et al., 1994: Proceeding of Symposium & Worshop: 178-187 St Patrick’s College, Maynooth, Co Kildare, Ireland (A.M Ehlers & J.P Masson Eds.) Luxemboug Nguyễn Đăng Tôn cs., 2000: Những vấn đề nghiên cứu sinh học Báo cáo khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc: 163-167 Nxb Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1997: Tạp chí Sinh học, 19(4): 24-29 Nguyễn Ngọc Châu cs., 1999: Tạp chí Sinh học, 21(2B): 90-95 Pham V Luc et al., 2000: Russian Journal of Nematology, 8(1): 33-43 Phan K Long, Nguyen N Chau & Moens M., 2001: Russian Journal of Nematology, l.9(1): 1-7 Phan K Long, Nguyen N Chau & Moens M., 2001: Nematology, 3(6): 503-514 10 Reid A P., Hominick W M., Briscoe B R., 1997: Systematic Parasitology, 37: 187193 11 Sambrook J., Fristch E F & Maniatis T., 1989: In: Forsol N., Nolan C., Ferguson M & Ockler M.(Eds.) Molecular coloning, a laboratory manual: 66-67 New York, USA, Cold Spring Harbor laboratory Press 12 Swofford D L., 1998: PAUP* Phylogenetic analysis using parsimony Version Sinauer, Sunderland, MA, 128 pp 13 Vrain T C et al., 1992: Fundamental and Applied Nematology, 15: 536-574 14 White G F., 1927: Science, 66: 302-303 APPLICATION OF DNA TECHNIQUES FOR THE IDENTIFICATION OF TWO ENTOMOPATHOGENIC NEMATODE GENERA STEINERNEMA AND HETERORHABDITIS FROM VIETNAM NGUYEN NGOC CHAU, PHAN KE LONG SUMMARY Entomopathogenic nematodes (epn), e.g Steinernema Travassos, 1927 and Heterorhabditis Poinar, 1975 belong to one of the most important groups among biological agents Their morphological identification to species level is very difficult Since they are often homomorphic in the adult stage of the first generation, but they are strongly polymorphic and variable among different generations that are usually occurred even in the same species Therefore, the molecular techniques have become useful tools for the identification and taxonomy of these nematodes The DNA techniques such as polymerise chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) and sequencing have been employed for the molecular characterization of entomopathogenic nematode isolates collected from Vietnam Based on the morphological diagnoses, morphometrics and genetic analyses of 18S-rDNA of collected isolates from Vietnam were revealed species of two genera Steinernema and Heterorhabditis so far Of these, four species viz Steinernema tami Pham et al., 2000, S sangi Phan et al., 2001, S loci Phan et al., 2001, and S thanhi Phan et al., 2001 were described as new species for science The results of the rDNA digestion with seventeen endoenzymes, e.g Alu I, Mva I, Dde I, EcoR I, Hae III, Cfo I, Hind III, Hinf I, Msp I, Kpn I, Pst, Pvu II, Rsa I, Sal I, Nde II, Bsiz I and Xba I RFLP shown a significant difference in RFLP pattern between three isolates S-TK10, S-TG10, S-TX1 and that of S Kraussei (Steiner, 1923) Travassos, 1927 Apparently, the complete differences which were occurred in six RFLP patterns digested by seven enzymes Alu I, Dde I, Cfo I, Hinf I, Msp I, Rsa I, Nde II were not only by the band number but are also by the size (bp) of the DNA fragment lengths, inspite of five other enzymes were not digested any more These might be documented the genetic similarly within the S kraussei group Along with some morphological characters and morphometrics, these genetic characterizations were strongly support to reveal three new species of three correspondent isolates Based on the sequencing of 18S according ITS (Internal Transcribed Spacer) of DNA ribosome, the paper gives also the phylogenic tree that shown the related relationship and degree of genetic distance of species among each genus of Steinernema and Heterorhabditis and that were also significantly distinguished to Meloidogyne chitwoodi Golden, O’ Bannon, Santo & Finley, 1980 Ngµy nhËn bµi: 1-10-2004 11 ... 10 Trên sở nghiên cứu hình thái đặc trng phân tử DNA, đ xác định loài tuyến trùng epn cđa ViƯt Nam lµ Steinernema sangi, S loci vµ S thanhi Sự sai khác DNA sở vững cho phân loại tuyến trùng, đặc... kết phân cắt tơng đồng, cho thấy loài/chủng epn Việt Nam thuộc nhóm loài S kraussei Kết phân tích PCR-RFLP đợc coi quan trọng đáng tin cậy để phân biệt mô tả loài tuyến trùng từ Việt Nam lµ Steinernema. .. gièng Steinernema vµ Heterorhabditis so víi loµi Meloidogyne chitwoodi Golden, O’ Bannon, Santo & Finley, 1980 III KÕt luËn Lần Việt Nam, kỹ thuật phân tử DNA (PCR-RFLP Sequencing) đ đợc áp dụng