Trong nghiên cứu này, cá sọc ngựa 30 ngày tuổi được phơi nhiễm với 0, 10 và 100 µg/L BPA suốt 60 ngày trong điều kiện tiêu chuẩn cho một thử nghiệm độc học mãn tính trên cá. Sau khi thí nghiệm kết thúc, sự khác biệt về mức biểu hiện mRNA của gene PPARγ và gene C/EBPα ở gan cá phơi nhiễm BPA được phân tích so sánh với gan cá không phơi nhiễm sử dụng phương pháp Real-Time PCR với β-actine làm gene tham chiếu. Kết quả: BPA tác động lên cả hai gene và đều phụ thuộc nồng độ.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(2):120- 127 Bài Nghiên cứu Suy giảm phiên mã gene PPARγ C/EBPα gan cá sọc ngựa giai đoạn Juvenile phơi nhiễm mãn tính với bisphenol A Nguyễn Thành Công1 , Ngô Thị Mai2 , Lê Phi Nga3,* TĨM TẮT Khoa Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG-HCM Giới thiệu: Bisphenol A (BPA) dùng tổng hợp nhựa Chất biết có khả gây biến đổi nội tiết tố người động vật Nhiều nghiên cứu trước cho thấy BPA hoạt động tương tự estrogene tác động lên giai đoạn phôi sinh Với cách tiếp cận khác, nghiên cứu nhóm tác giả cơng bố năm 2017 cho thấy BPA có khả tác động lên giai đoạn tăng trưởng nhanh động vật dựa liệu proteomics gan cá sọc ngựa giai đoạn Juvenile phơi nhiễm BPA mức µ g/L Nghiên cứu bước nghiên cứu để thụ thể chuyển hóa hóa sinh gan có khả bị tác động phơi nhiễm BPA Trong số thụ thể gan dự đốn PPARγ C/EBPα là đích tác động BPA điều kiện phơi nhiễm Phương pháp: Trong nghiên cứu này, cá sọc ngựa 30 ngày tuổi phơi nhiễm với 0, 10 100 µ g/L BPA suốt 60 ngày điều kiện tiêu chuẩn cho thử nghiệm độc học mãn tính cá Sau thí nghiệm kết thúc, khác biệt mức biểu mRNA gene PPARγ gene C/EBPα gan cá phơi nhiễm BPA phân tích so sánh với gan cá khơng phơi nhiễm sử dụng phương pháp Real-Time PCR với β -actine làm gene tham chiếu Kết quả: BPA tác động lên hai gene phụ thuộc nồng độ Mức biểu mRNA giảm 67 % gene PPARγ 70% gene C/EBPα ghi nhận nhóm phơi nhiễm với 100 µ g/L BPA Mức biểu khơng thay đổi đáng kể nhóm phơi nhiễm với 10 µ g/L BPA Kết luận: Như tác động phơi nhiễm BPA suốt giai đoạn tăng trưởng cá sọc ngựa lên chức gan có tham gia thụ thể PPARγ C/EBPα Tác động phụ thuộc vào nồng độ BPA Từ khoá: bisphenol A, C/EBPα , Danio rerio, zebrafish liver, PPARγ Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM Liên hệ Lê Phi Nga, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM Email: lephinga@hcmut.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 13-11-2018 • Ngày chấp nhận: 27-3-2019 • Ngày đăng: 29-6-2019 DOI : https://doi.org/10.32508/stdjns.v3i2.519 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license GIỚI THIỆU Các hợp chất gây rối loạn nội tiết tố gọi chung EDCs (Endocrine-distrupting chemicals) ngày trở thành nhóm chất độc đặc biệt, khơng ảnh hưởng lên sức khỏe người mà sinh thái Bisphenol A (BPA) thuộc nhóm EDCs Năm 2012, hợp chất bị cấm sử dụng làm phụ gia nhựa sản xuất đồ dùng cho trẻ em Mỹ, sau Châu Âu Canada Các nước giới biết đến tác hại BPA, diện phát thấy rộng rãi sản phẩm nhựa dân dụng môi trường nước, nơi chất thải nhựa dung giải chất phụ gia khắp nơi giới Khá nhiều nghiên cứu cho thấy BPA đóng vai trò tương tự estrogen gây ảnh hưởng xấu lên phát triển giới tính động vật từ giai đoạn bào thai đến sinh Đó sở khoa học cho luật cấm sản xuất đồ dùng nhựa chứa BPA cho trẻ em Với cách tiếp cận mới, nhóm nghiên cứu Ngo TM, 2017 đánh giá ảnh hưởng BPA nồng độ thấp (10 100 µ g/L) lên cá sọc ngựa suốt giai đoạn tăng trưởng (Juvenile), từ 30 ngày tuổi phơi nhiễm 60 ngày Kết phân tích proteomics gan cá cho thấy hợp chất có ảnh hưởng rõ rệt lên chức chuyển hóa gan: làm suy giảm tổng hợp lượng, giảm glycogen, tăng hình thành lipid, tăng kháng viêm Câu hỏi đặt protein thụ thể chịu tác động BPA để gây nên thay đổi đó? Nhóm protein thụ thể nhân PPARs đầu mối nhiều nghiên cứu cho thấy protein tham gia vào việc điều hòa đường chuyển hóa glucose lipid bệnh béo phì, tiểu đường, xơ vữa động mạch viêm nhiễm 2–4 PPARγ chủ yếu tìm thấy mơ mỡ trắng Ở mô gan, biểu với lượng nhỏ thụ thể có ảnh hưởng mạnh đến điều hòa đường chuyển hóa glucose 5,6 Thiazolidiodine dùng làm thuốc để tăng hoạt tính thụ thể PPAR điều trị bệnh tiểu đường type kháng insulin 7,8 Việc suy giảm biểu thụ thể gan ghi nhận chuột nhắt với chế độ ăn nghèo lượng tăng biểu cho ăn nhiều lipid C/EBPα protein thụ thể nhân, thuộc nhóm C/EBPs, ngược lại, biểu nhiều mô gan mô mỡ trắng 10 Một số nghiên cứu C/EBPα đóng vai trò mắt xích quan trọng điều hòa chuyển hóa glucose lipid gan 11,12 Hơn Trích dẫn báo này: Thành Công N, Thị Mai N, Phi Nga L Suy giảm phiên mã gene PPARγ C/EBPα gan cá sọc ngựa giai đoạn Juvenile phơi nhiễm mãn tính với bisphenol A Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 3(2):120-127 120 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(2):120- 127 C/EBPα PPARγ có mối quan hệ mật thiết với biệt hóa tế bào mỡ 13 Trong nghiên cứu giả thuyết biểu gene PPARγ C/EBPα gan cá bị tác động BPA, tác động làm thay đổi biểu protein gan cá nghiên cứu Ngo TM, 2017 Do chúng tơi thiết lập lại điều kiện thí nghiệm hồn tồn giống công bố Ngo TM, 2017 đánh giá điểm cuối biểu protein mà biểu mRNA hai gene chọn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm phơi nhiễm với BPA Mơ hình phơi nhiễm mãn tính tn thủ theo dẫn TG234 OECD Cá sọc ngựa 30 ngày tuổi phơi nhiễm với BPA nồng độ (đối chứng), 10 100 µ g/L 60 ngày tương tự công bố Ngo TM, 2017 Một lô đối chứng hai lô nhiễm BPA, lơ gồm bể bể có 10 cá Sau 60 ngày thí nghiệm bể có 10 cá sống, tức số cá chết < 10% đáp ứng điều kiện phép thử độc học Mỗi lơ thí nghiệm có trung bình 37 gan cá, thu tươi sống, đông lạnh nitrogen lỏng trữ (-) 80o C cho thí nghiệm tách chiết RNA Tách chiết RNA tổng số từ gan cá Mỗi lần chiết RNA tổng số, gan cá (100 ± 0,08 mg) rã đơng, gom chung đồng hóa cối nghiền Chiết RNA tổng số EZ-10 Spin Column Plant RNA Mini-Preps Kit (Bio Basic, Canada), thực theo hướng dẫn nhà sản xuất DNA lẫn mẫu chiết RNA cuối loại bỏ cách sử dụng RapidOut DNA Removal Kit (Thermo Scientific, U.S) Chất lượng RNA tổng số đánh giá điện di gel agarose % xác định nồng độ quang phổ NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, U.S) Phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA tổng số cDNA tổng hợp phản ứng phiên mã ngược (reverse transcript PCR) khuôn RNA tổng số (5 µ g) sử dụng Tetro cDNA Synthesis Kit với mồi Oligo(dT)18 (Bioline Reagenets, UK) Thể tích phản ứng 20 µ L Chu trình nhiệt 45o C, 30 phút, 85o C, phút; giữ 4o C PCR gene đích gene tham chiếu Trước thực phản ứng Real-Time PCR, cặp mồi cần xác nhận hiệu khuếch đại cách thực phản ứng PCR thông thường với 121 sản phẩm cDNA tổng hợp Các phản ứng dùng PCR Master mix Thermo Fisher Scientifics, U.S Các cặp mồi PCR tổng hợp PhuSa Biochem (Việt Nam) dựa trình tự cơng bố cho gene PPARγ , C/EBPα 14 β -actin dùng để làm gene tham chiếu 15 (Bảng 1) Chu trình nhiệt 95o C- phút; 40 chu kì gồm: 55o C (cho PPARγ C/EBPα ) 56o C (cho β -actin) kéo dài 30 giây; 72o C kéo dài 30 giây); 72o C kéo dài phút; giữ 4o C Sản phẩm điện di gel agarose %, nhuộm ethidium bromide Phản ứng Real-Time PCR Phản ứng Real-Time PCR thực với thể tích cuối 20 µ L chứa 350 ng cDNA, 1X Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 2X (Thermo Scientific, U.S) nồng độ mồi tối ưu 0,8 µ M; 0,8 µ M; 0,7 µ M tương ứng cho gene β -actin, PPARγ , C/EBPα Các mẫu phân tích đĩa PCR 96 giếng hệ thống iQ5 Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad, U.S) với quy trình khuếch đại sau: chu kỳ 95o C phút, 40 chu kỳ 95o C cho 15 giây, bắt khuôn nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi 30 giây, kéo dài 72o C 30 giây Phản ứng chạy lặp lại bốn lần (n=4) cho mẫu cDNA Sử dụng điện di gel agarose 1% để kiểm tra khả khuếch đại cDNA sau thực phản ứng Real-Time PCR Dữ liệu Real-Time PCR thu thập phân tích phần mềm iQ5 2.1 (Bio-Rad, U.S) Để đánh giá khác biệt biểu gene đích mẫu phơi nhiễm với BPA với mẫu không phơi nhiễm (mẫu cắt ngang thời điể m) nghiên cứu áp dụng phương pháp 2−∆∆CT Livak KJ, 2001 16 Trong phương pháp sử dụng β -actin làm gene tham chiếu (Ref) điều kiện tiên quy ước không thay đổi tác động độc chất Để tính trị số 2−∆∆CT , sử dụng chu kỳ ngưỡng gene đích CT(T/Tg) cho gene PPARγ C/EBPα hiệu chỉnh (normalized) theo chu kì ngưỡng gene tham chiếu β -actin CT(C/Ref) thực mẫu phơi nhiễm BPA (T) mẫu đối chứng (C) theo phương trình sau: Mẫ phơi nhiễm : ∆CT(T) = CT(T/Tg) – CT(T/Ref) (1) Mẫu đối chứng : ∆CT(C) = CT(C/Tg) – CT(C/Ref) (2) Hiệu chỉnh ∆CT mẫu thử hiệu số ∆CT(T) ∆CT(C) : ∆∆CT = ∆CT(T) - ∆CT(C) (3) Từ tính tỷ lệ thay đổi biểu PPARγ C/EBPα mẫu phơi nhiễm so với mẫu đối chứng Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(2):120- 127 Bảng 1: Trình tự cặp mồi PCR Độ dài mồi (bp) Sản phẩm PCR (bp) Tm( o C) CGAGCTGTCTTCCCATCCA 19 86 56 Ngược TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG 23 Xuôi GGTTTCATTACGGCGTTCAC 20 120 55 Ngược TGCGGCTCTTCTTGTGTATG 20 Xuôi CACAACAGCTCCAAGCAAGA 20 121 55 Ngược AATCCATGTAGCCGTTCAGG 20 Gene Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) β -actin Xuôi PPARγ C/EBPα (không phơi nhiễm BPA) quy hay 100% tính 2−∆∆CT Nếu tỉ số biểu tăng; = không thay đổi mức độ biểu Phép thống kê Student ’s t-test dùng để kiểm định mức độ khác biệt có nghĩa mẫu với độ tin cậy 95% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chất lượng RNA tổng số RNA tổng số gan cá phơi nhiễm với 10 µ g/L, 100 µ g/L BPA nhóm đối chứng (khơng phơi nhiễm) phân tích điện di gel agarose 1% (Hình 1) với µ g RNA nạp vào giếng Kết điện di cho thấy RNA tổng số mẫu cho vạch RNA, vạch rõ rệt tương ứng với rRNA tiểu phần 28S, 18S, 5,8S Vạch có trọng lượng phân tử thấp nhất, mờ nhạt so với vạch kia, sản phẩm rRNA bị phân hủy trình tách chiết Các mRNA thơng thường khơng tập trung thành vạch có độ dài khác biệt chiếm tỉ trọng nhỏ, khoảng 3% tổng RNA Như chất lượng RNA tổng số thu sử dụng cho việc tổng hợp cDNA Chất lượng cDNA tính đặc hiệu cặp mồi PCR Kết phản ứng PCR với cặp mồi khuôn cDNA thu thể Hình cho thấy gene (giếng 3, giếng 7; giếng 10) có sản phẩm có kích thước phù hợp nằm khoảng vạch thấp 350 bp thang DNA Vạch sản phẩm β -actin (giếng 9, 10) thấp nhất, gene đích tương đương Trong đối chứng âm khơng có vạch sáng cho thấy khơng có tượng tạo dimer cặp mồi Kết cho thấy cặp mồi chất lượng cDNA đáp ứng yêu cầu cho phản ứng Real-Time PCR Sản phẩm PCR thuộc gene đích (Hình 2) khẳng định giải trình tự gene (khơng trình bày liệu) Tính đặc hiệu cặp mồi, hay sản phẩm PCR cho gene tiếp tục phân tích chạy phản ứng Real-Time PCR Tối ưu nhiệt độ nồng độ mồi phản ứng Real-Time PCR Nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho gene β -actin, PPARγ C/EBPα xác định qua phân tích sản phẩm Real - Time PCR sử dụng phần mềm iQ5 Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad, U.S) Kết cho thấy (khơng trình bày liệu) tất phản ứng cho đường cong nhiệt độ chảy sản phẩm có đỉnh tương ứng với nhiệt độ bắt cặp mồi 56o C cho gene β -actin, 55o C cho PPARγ C/EBP Sản phẩm Real-Time PCR cho gene chứng tỏ tính đặc hiệu cặp mồi sử dụng nhiệt độ bắt cặp mồi phản ứng chuẩn hóa Nồng độ mồi tốt phản ứng Real-Time PCR cho giá trị chu kì ngưỡng CT thấp Đối với gene β -actin, khảo sát nồng độ mồi từ 0,1 µ M đến 0,9 µ M cho thấy nồng độ tốt 0,8 µ M (CT = 15,54) Đối với gene PPARγ C/EBPα khảo sát nồng độ mồi tương tự từ 0,5 µ M đến 0,9 µ M, cho thấy nồng độ tốt cho gene 0,8 µ M (CT = 25,29) 0,7 µ M (CT = 26,06) Thay đổi mức độ biểu mRNA gene PPARγ Các thông số đặc trưng cho biểu gene PPARγ tác động BPA thể Bảng Chỉ số CT đo gene β -actin lý thuyết khơng có khác biệt mẫu quy ước gene không chịu tác động độc chất sử dụng để tham chiếu Thực tế Bảng cho thấy CT gene khác biệt mẫu Điều gây độ tinh ban đầu RNA hay độ đồng cDNA mẫu không đồng đều, phản ứng Real – Time PCR khống chế lượng cDNA khn 122 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(2):120- 127 Hình 1: Gel điện di agarose 1% RNA tổng số gan cá phơi nhiễm với BPA đối chứng Hình 2: Gel điện di agarose 1% sản phẩm PCR gene PPARγ , CEBPα β -actin Ghi chú: (1) (2) sản phẩm 120 bp gene PPARγ ; (3) Đối chứng âm phản ứng PCR genePPARγ ; (4) Thang DNA ruler 1kb; (5) Đối chứng âm phản ứng PCR gene C/EBPα ; (6) (7) sản phẩm 121 bp gene C/EBPα ; (8) Đối chứng âm phản ứng PCR gene β -actin; (9) (10) sản phẩm 86 bp gene β -actin nhau, 350 ng cDNA cho phản ứng, dẫn đến CT khác Tuy nhiên khác biệt loại trừ tính trị số ∆CT mẫu cặp gene đích gene tham chiếu Trị số 2−∆∆CT biểu thị mức độ biểu gene mẫu phơi nhiễm so với đối chứng Kết cho thấy biểu gene PPARγ mẫu gan cá phơi nhiễm với BPA 100 µ g/L thấp đáng kể (0,67 lần) so với đối chứng, trong mẫu phơi nhiễm với BPA 10µ g/L suy giảm (0,11 lần) so với nhóm đối chứng Như BPA gây nên suy giảm biểu gene phụ thuộc nồng độ Mức độ suy giảm thay đổi không đáng kể lô nhiễm BPA 10 µ g/L giảm 123 rõ rệt nồng độ 100 µ g/L cho thấy vùng 10 – 100 µ g/L quan trọng phơi nhiễm mãn tính BPA lên cá sọc ngựa giai đoạn Juvenile BPA 10 µ g/L coi giá trị NOEC (not observed effect concentration) BPA 10 µ g/L giá trị LOEC (lowest observed effect concentration) Thay đổi mức độ biểu mRNA C/EBPα Các thông số đặc trưng cho biểu gene C/EBPα thể Bảng Kết cho thấy, tương tự gene PPARγ trên, có lơ mẫu phơi nhiễm 100 µ g/L BPA bị giảm biểu 70%, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(2):120- 127 Bảng 2: Thay đổi biểu mRNA gene PPARγ ∆CT ∆∆CT −∆∆CT (95% CI) F 18,30±1,06 7,7 ±1,32 0,00±1,32 1,00 (0,40-2,50) - 32,10±0,85 21,18±0,44 10,92±0,96 3,22±0,96 0,11 (0,06-0,21) ** 23,62±0,83 15,34±0,37 8,28±0,91 0,58±0,91 0,67 (0,36-1,26) * Mẫu PPARγ CT ±SD β -actin CT ±SD Đối chứng 26,00±0,79 BPA 10 µ g/L BPA 100 µ g/L Ghi chú: Độ lặp lại n = 4; CI: Confidence Interval; *p < 0,01; **p