Bài viết nghiên cứu quan sát sự biểu hiện của Protein ngoại lai trong tế bào nấm men nhờ Protein phát huỳnh quang ECFP thông qua các chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy; Plasmit pC-Z-Ste dùng để biểu hiện Protein dung hợp ECFP-Protein A-Ste...
26(2): 30-34 Tạp chí Sinh học 6-2004 QUAN SáT Sự BIểU HIệN CủA PROTEIN NGOạI LAI TRONG Tế BàO NấM MEN NHờ PROTEIN PHáT HUỳNH QUANG ECFP Nguyễn đức hoàng, trần linh thớc Trờng đại học Khoa học tự nhiên, §HQG Tp HCM Mitsuyoshi Ueda, Atsuo Tanaka §¹i häc Kyoto, Nhật Bản Để theo dõi định vị biểu protein tế bào để phát thay đổi môi trờng hay tơng tác protein, ngày ngời ta thờng sử dụng gien m hóa cho protein có khả phát huỳnh quang Hầu hết gien m hóa cho protein phát huỳnh quang đợc sử dụng rộng r i cã nguån gèc tõ GFP (green fluorescent protein) cña søa Aequorea victoria nh− ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), EYFP (enhanced yellow fluorescent protein), EGFP (enhanced green fluorescent protein) [4, 5] Nhiều chiến lợc khác đ đợc sử dụng cho sù biĨu hiƯn cđa gien sÏ t¹o protein mục tiêu đợc dung hợp với đầu C hay ®Çu N cđa GFP [4] Sù biĨu hiƯn cđa gien mục tiêu đợc theo dõi kính hiển vi huỳnh quang mà không cần phải cố định tế bào hay phá tế bào, nhờ làm giảm khả tạo dơng tính giả Ngoài ra, protein dung hợp GFP không gây độc cho tế bào chủ [5, 6] Chính u điểm đ làm cho GFP trở thành reporter đợc sử dụng rộng r i Tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử, Trờng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Tp HCM, sư dơng c¸c gien m hãa protein ph¸t huỳnh quang, đ thiết kế thành công hệ thống gien thị dùng để nghiên cứu biểu protein mục tiêu khó định tính phát bề mặt tế bào [3], tế bào chất [1] hay màng màng tế bào nấm men [2] Trong nghiên cứu này, tiến hành thiết kế plasmit để quan sát biểu protein A dạng dung hợp với protein phát huỳnh quang ECFP-protein A protein A-ECFP lên màng màng tế bào nấm men 30 Saccharomyces cerevisiae I PHƯƠNG PHáP nghiên cứu Các chủng vi sinh vật điều kiện nuôi cấy Escherichia coli DH5α [F-, Φ80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] đợc nuôi cấy 37oC m«i tr−êng Luria-Bertani (LB) [1% trypton (Difco, Mich., USA), 0,5% yeast extract (Difco) vµ 1% NaCl] cã bỉ sung 100àg/ml ampixillin cần, đợc sử dụng làm tế bào chủ để nhân plasmit Saccharomyces cerevisiae MT8-1 (MAT, ade, his3, leu2, trp1, ura3) đợc nuôi cấy 30oC môi trờng YPD [1% yeast extract, 2% polypepton (Difco) 2% glucoza] môi trờng SD [0,67% yeast nitrogen base (YNB) (Difco), 2% glucoza], đợc bổ sung axít amin cần thiết HEPES đợc thêm vào môi trờng SD đạt 50mM để làm đệm cho môi trờng thời gian nuôi cấy [9] Plasmit pC-Z-Ste dùng để biểu protein dung hợp ECFP-protein A-Ste đợc thiết kế nh sau Khuếch đại vùng m hóa gien ECFP PCR dựa khuôn plasmit pECFP mang gien ECFP (Clontech, Calif., USA) với cặp mồi gồm mồi 1F, 5-TCTGCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-AGC-3 để tạo vị trí cắt EcoRI, mồi 1R, 5-GGCCCCATGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT-3 để tạo vị trí cắt NcoI loại bỏ stop codon Đoạn cắt EcoRI/NcoI đợc dòng hóa vào pCAS1 [9] ®Ĩ t¹o plasmit pCASCFP Khch ®¹i vïng m hãa protein A [7] (mét protein trªn vá cđa Staphylococcus aureus) cđa gien Z PCR dựa khuôn plasmit pEZZ 18 (Amersham Bioscienes, GeneBank M74186) víi cỈp måi gåm måi 2F, 5GCTGCGCAACACGATGAACCATGGGACA ACA-3 để tạo vị trí cắt NcoI, mồi 2R, 5ATCTCATAGAACGCGCTCGAGCCAGAA CCACCACCAGAAGAACCTACTTTCGGCGC CT-3 để thêm trình tự m hóa GS linker (GSSGGGS) tạo vị trí cắt XhoI Đoạn cắt NcoI/XhoI đợc dòng hóa vào pCAS1 để tạo plasmit pCASCZA Khuếch đại đoạn gien ECFP-Z dựa khuôn pCASCZA với cặp mồi gồm mồi 1F mồi 3R, 5CGGTACCTTACATAAGCGTACAACAAAC ACTATTTGAAGAACCACCACC-3 để gắn thêm đoạn oligonucleotit m hóa cho axít amin đầu C Ste18p protein ( SNSVCCTLM) tạo vị trí cắt hạn chế KpnI Đoạn cắt EcoRI/KpnI đợc dòng hóa vào plasmit pCAS1 để tạo plasmit pC-Z-Ste Sản phẩm nối sau đợc biến nạp vào E coli DH5 Chọn lọc thể biến nạp PCR khuẩn lạc với cặp mồi 1F mồi 3R Plasmit pZ-C-Ste dùng để biểu protein dung hợp protein A- ECFP-Ste đợc thiết kế nh sau Khuếch đại vùng m hóa gien ECFPSte PCR dựa khuôn plasmit pECFPSte [2] với cặp mồi gồm mồi 4F, 5CGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG CTG-3 để tạo vị trí cắt NcoI, mồi 4R, 5GCTCGGTACTTACATAA-GCGTACAACAAACACTATTTGAAGAACCACCACCAG-3 để gắn thêm đoạn oligonucleotit m hóa cho axit amin đầu C Ste18p protein (-SNSVCCTLM) tạo vị trí cắt KpnI Đoạn cắt NcoI/KpnI đợc dòng hóa vào pCAS1 để tạo plasmit pECFP-Ste Khuếch đại vùng m hóa cho protein A gien Z PCR dựa khuôn plasmit pEZZ 18 (Amersham Biosciences) víi cỈp måi gåm måi 5F, 5’GATGAATTCATG-GACAACAAATTC-3’ để tạo vị trí cắt EcoRI, mồi 5R, 5GCCCATGGAACCACCACCAGAAGAACCT ACTTTCGGCGCCTGAGC-3 để thêm trình tự m hóa GS linker (GSSGGGS) tạo vị trí cắt NcoI Đoạn cắt EcoRI/NcoI đợc dòng hóa vào pCECFP-Ste để tạo pZ-C-Ste Sản phẩm nối sau đợc biến nạp vào E coli Chọn lọc thể biến nạp PCR khuẩn lạc với cặp mồi 5F mồi 4R Giải trình tự Các đoạn ADN, ECFP-Z-Ste Z-ECFPSte, sau đợc dòng hóa vào vectơ đ đợc kiểm chứng cách đọc trình tự ADN sequencer hiệu 373, Applied Biosystem Kết trình tự đợc phân tích so sánh chơng trình GENETYX (Software Development Co., Ltd) Các phơng pháp khác Các phản ứng cắt nối ADN, điện di gel agaroza biến nạp vào chủng chủ E coli đợc thực theo Shambrook Russel [8] Biến nạp plasmit vào nấm men theo quy trình Clontech Kü thuËt kÝnh hiÓn vi huúnh quang KÝnh hiÓn vi huỳnh quang đợc sử dụng để quan sát trực tiếp hoạt tính ECFP biểu tế bào nấm men S cerevisiae Chủng nấm men MT8-1 đợc sử dụng làm tế bào chủ để biểu plasmit pC-Z-Ste pZ-C-Ste Dòng nấm men MT8-1 mang plasmit pC-Z-Ste (MT81/pC-Z-Ste) pZ-C-Ste (MT8-1/pZ-C-Ste) đợc nuôi cấy lắc 16-24 h 30oC 10 ml m«i tr−êng SD cã bỉ sung 0,002% histidin, 0,01% lơxin, 0,002% uraxil 0,002% adenin để ức chế tạo thành sắc tố không bào đỏ đột biến ade2 [9] Để quan sát kính hiển vi huỳnh quang, nấm men đ nuôi cấy đợc ly tâm để thu nhận tế bào Dịch huyền phù tế bào nấm men đợc đặt lên phiến kính kính không phát huỳnh quang Huỳnh quang ECFP đợc phát qua lọc kích thích (440 nm) phát sáng (480 nm) (Omega optical) kính hiĨn vi hnh quang Olympus, NhËt B¶n ii KÕt QU¶ thảo luận Thiết kế plasmit pC-Z-Ste dùng cho sù biĨu hiƯn cđa ECFP-protein A-Ste Plasmit pC-Z-Ste (h×nh 1) đ đợc thiết kế nh phần phơng pháp nghiên cứu Đây plamit thoi cho phép tạo dòng, nhân 31 E coli với kiểu hình chọn lọc kháng ampixillin biểu nÊm men Saccharomyces cerevisiae víi kiĨu h×nh chän läc tự dỡng tryptophan Chuỗi khởi động GAPDH đợc sử dơng cho phÐp biĨu hiƯn ECFP-protein A-Ste th«ng qua sù cảm ứng glucoza có sẵn môi trờng nuôi cấy Đoạn Hình Plasmit pC-Z-Ste cho phép m hóa protein dung hợp ECFP-protein A-Ste Hình Bản đồ cắt h¹n chÕ cđa plasmit pC-Z-Ste Ghi chó: protein A ë đầu N ECFP ECFP, trình tự m hóa protein phát huỳnh quang ECFP; Z, trình tự m hóa protein A; L, tr×nh tù m hãa cho linker GS; Ste18p (Ste), trình tự m hóa cho axít amin đầu C protein Ste18p nối GS đợc sử dụng nhằm làm giảm ảnh hởng qua lại protein dung hợp ECFP-protein A peptit tín hiệu (9 axít amin đầu C Ste18p protein) [2] Plasmit pC-Z-Ste đợc cắt EcoRI KpnI tạo thành đoạn có kích thớc nh dự đoán đợc điện di gel agaroza nh hình 2, giếng Đoạn gien nhỏ có kích thớc tơng ứng với sản phẩm PCR đoạn gien dòng hóa vào plasmit (hình 1, hình 2, giếng 3) đoạn DNA lớn có kích thớc đoạn lớn plasmit pCAS1 sau đợc cắt EcoRI KpnI ThiÕt kÕ plasmit pZ-C-Ste dïng cho sù biÓu protein A-ECFP-Ste Plasmit pZ-C-Ste (hình 3) đ đợc thiết kÕ còng cã cÊu tróc t−¬ng tù nh− plasmit pC-Z-Ste Điểm khác biệt chủ yếu nằm đoạn gien tái tổ hợp khảo sát Protein dung hợp đợc cảm 32 Ghi chú: thang -HindIII; đoạn ADN lớn plasmit pCAS1 sau đợc cắt EcoRI KpnI plasmit pC-Z-Ste đợc cắt EcoRI KpnI; sản phẩm PCR với khuôn pC-Z-Ste cặp måi måi 1F/måi 3R; thang ADN 100 bp øng biểu protein A-ECFP-Ste Giữa protein A ECFP có đoạn GS linker nhằm làm giảm ảnh hởng protein A lên ECFP, phát huỳnh quang ECFP đợc định chủ yếu phần đầu C Plasmit pZ-C-Ste đợc cắt EcoRI KpnI đợc điện di gel agaroza Kết tơng tự nh trờng hợp pC-Z-Ste (hình 2) Plasmit cho phÐp biĨu hiƯn protein dung hỵp protein A-ECFP-Ste, ®ã protein A ë ®Çu C cđa ECFP BiĨu ECFP-protein A protein AECFP-Ste màng tế bào nấm men Các plasmit sau thiết kế đợc biến nạp vào nấm men S cerevisiae MT8-1, nuôi cấy môi trờng SD có bổ sung axít amin cần thiết quan sát, chụp hình dới kính hiển vi huỳnh quang Hình cho thấy dòng nấm men MT8-1/pC-Z-Ste MT8-1/pZ-C-Ste có khả biểu ECFP tập trung mặt màng tế bào Trong đó, chđng nÊm men H×nh Plasmit pZ-C-Ste cho phÐp biĨu protein dung hợp protein A-ECFP-Ste Hình ảnh chụp dòng nấm men MT81/pC-Z-Ste, MT8-1/pZ-C-Ste MT8-1/pCAS1 đối chứng d−¬ng qua kÝnh hiĨn vi hnh quang Ghi chó: protein A đầu C ECFP ECFP, trình tự m hóa protein phát huỳnh quang ECFP; Z, trình tự m hãa protein A; L, tr×nh tù m hãa cho linker GS; Ste18p, tr×nh tù m hãa cho axÝt amin đầu C ste18p protein MT8-1/pCAS1 đối chứng không biểu ECFP Kết cho thấy có diện protein dung hợp ECFP-protein-Ste tế bào nÊm men MT8-1/pC-Z-Ste vµ protein AECFP-Ste tÕ bµo MT8-1/pZ-C-Ste Trong báo cáo trớc, đ thiết kế mét plasmit cho phÐp biĨu hiƯn EYFP bªn tÕ bào chất [1] plasmit khác cho phép biểu ECFP mặt màng tế bào sử dụng axít amin đầu C protein Ste18 làm peptit tín hiệu [2] Các plasmit đợc sử dụng làm plasmit để kiểm tra biểu protein ngoại lai tế bào c¸ch quan s¸t d−íi kÝnh hiĨn vi hnh quang Nh»m kiểm chứng ý tởng đó, báo cáo này, đ thiết kế hai plasmit có mang đoạn gien Z m hãa cho protein A dung hỵp víi ECFP Kết ghi nhận đợc hình cho thấy r»ng cã thĨ sư dơng protein ph¸t hnh quang ECFP để theo dõi biểu protein mặt cđa mµng tÕ bµo nÊm men b»ng kÝnh hiĨn vi huỳnh quang Ghi chú: cột bên trái: lọc sáng cho ECFP, cho phÐp quan s¸t ECFP qua kÝnh hiĨn vi huỳnh quang Cột bên phải: pha tơng phản, cho phép quan sát hình dạng tế bào qua kính hiển vi III Kết luận Điểm bật nghiên cứu quan sát biểu protein A mặt màng tế bào chất thông qua protein phát huỳnh quang ECFP Kết đạt đợc nhờ việc thiết kế hai plasmit cho phép gắn protein A vào đầu C N gien ECFP, biểu gien nấm men quan s¸t d−íi kÝnh hiĨn vi hnh quang Sư dơng hệ thống này, cách dòng hóa gien mục tiêu cần khảo sát khác thay cho gien Z (m hóa protein A) vào đầu C (đối với plasmit pC-ZSte) hay đầu N (đối với plasmit pZ-C-Ste) gien ECFP, hoàn toàn quan sát biểu gien mục tiêu mặt màng tế bào nấm men với kết tơng tự nh TàI LIệU THAM KHảO Nguyễn Đức Hoàng cs., 2002: Tạp chí Phát triển khoa học công nghệ, 5: 51-58 2 Nguyễn Đức Hoàng cs., 2002: Tạp chí Di truyền học ứng dụng, 3: 52-58 Đặng Thị Phơng thảo cs., 2003: Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y häc: 1016-1019 Lo W., Rodgers W., Hughes T., 1998: Biotechniques, 25: 94-96 Martin C., Steven K., 1998: Green Fluorescence Protein: properties, applications and protocols Wiley-Liss, Inc, US Michael C P., 1999: Method Enzymol., 302: 3-171 Nilsson B et al., 1987: Protein Eng., 1(2): 107-113 Shambrook J., Russel W D., 2001: Molecular cloning: A laboratory manual 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Shibasaki S et al., 2001: Appl Microbiol Biotechnol., 55: 471-475 OBSERVation of THE FOREIGN PROTEIN EXPRESSION IN the YEAST CELL BY USING the ENHANCED CYAN FLUORESCENT PROTEIN Nguyen duc hoang, Tran Linh Thuoc, Mitsuyoshi Ueda, Atsuo Tanaka summary We have successfully constructed two plasmids pC-Z-Ste and pZ-C-Ste, which express a fusion protein containing the ECFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) and the protein A encoded by the Z gene on the cytoplasmic side of the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae MT8-1 The oligonucleotide encoding the C-terminal amino acids of the Ste18p protein was cloned downstream of the genes encoding the fusion proteins in order to anchor the fusion proteins on the cytoplasmic side of the plasma membrane A GS linker was used between the fusion protein and the C-terminal of the Ste18p protein for minimizing the interaction among themselves The Z gene was cloned upstream or downstream of the ECFP gene in order to examine whether the protein A at C terminal or N terminal of CFP affects the expression of the fusion protein These two plasmids were sequenced to check the inframe between the gene ECFP, Z and the C terminal Ste Under the control of the GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) promoter, the expression of the fusion proteins ECFP-Protein A or Protein A-ECFP in the yeast cell could be confirmed by the fluorescent microscope Ngµy nhËn bµi: 5-5-2003 34 ... không bào đỏ đột biến ade2 [9] Để quan sát kính hiển vi huỳnh quang, nấm men đ nuôi cấy đợc ly tâm để thu nhận tế bào Dịch huyền phù tế bào nấm men đợc đặt lên phiến kính kính không phát huỳnh quang. .. Plasmit cho phép biểu protein dung hợp protein A -ECFP- Ste, protein A đầu C ECFP Biểu ECFP -protein A protein AECFP-Ste màng tế bào nấm men Các plasmit sau thiết kế đợc biến nạp vào nấm men S cerevisiae... cho phép quan sát hình dạng tế bào qua kính hiển vi III Kết luận Điểm bật nghiên cứu quan sát biểu protein A mặt màng tế bào chất thông qua protein phát huỳnh quang ECFP Kết đạt đợc nhờ việc