Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào escherichiacoli và bacillus subtilis

Luận văn Thạc sĩ khoa học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 Luận văn Thạc sĩ khoa học ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420122 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn chính: TS Nguyễn Huy Hoàng Người hướng dẫn phụ: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội – Năm 2014 Luận văn Thạc sĩ khoa học MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Keratin 1.2 Keratinase .5 1.3.Một số chủng biểu 1.3.1 Chủng chủ E coli 1.3.2 Chủng chủ Bacillus subtilis 10 1.4 Ứng dụng keratinase 11 1.4.2 Ứng dụng công nghiệp 13 1.4.3 Đối với môi trƣờng sinh thái 13 1.4.4.Ứng dụng y, dƣợc học 13 1.5 Tình hình nghiên cứu 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .16 Phần II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Nguyên liệu 18 2.2.Phương pháp 20 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn 21 2.2.2.Phản ứng PCR 22 2.2.3 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 23 2.2.4 Phƣơng pháp điện di DNA gel agarose .23 2.2.5 Điện di protein gel Polyacrylamide (SDS-PAGE) 24 Luận văn Thạc sĩ khoa học 2.2.6 Thiết kế vector biểu E Coli .25 2.2.7 Biến nạp vào tế bào E.coli 25 2.2.8 Biểu keratinase tái tổ hợp E.coli BL21 (DE3) 26 2.2.9 Tổ hợp gen ker phƣơng pháp Megaprimer .27 2.2.10 Thiết kế vector biểu keratinase B.subtilis 168M 29 2.2.11 Biến nạp vector mang gen keratinase tái tổ hợp B.subtilis 168M 29 2.2.12 Biểu keratinase tái hợp B.subtilis 168M 30 2.2.13 Thử hoạt tính keratinase 30 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tách ADN tổng số 32 3.2 Nhân gen keratinase PCR 32 3.3 Biểu gen keratinase E.coli 34 3.3.1 Tách dòng gen KerE vector pJET1.2 để biểu E.coli .34 3.3.2 Kết phân tích trình tự gen 35 3.3.3 Thiết kế vector biểu E.coli 36 3.3.4 Biểu gen Ker E.coli BL21 38 3.4 Biểu gen kerB tế bào B.subtilis 168M 40 3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB phƣơng pháp Megaprimer .40 3.4.2 Tách dòng tổ hợp gen keratinase vector pTZ57RT E.coli TOP10F’ 41 3.4.3 Thiết kế vector biểu Bacillus subtilis 42 3.4.4 Biểu keratinase tế bào Bacillus subtilis 168M 44 3.5 Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 B.subtilis 168M 46 Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 Luận văn Thạc sĩ khoa học 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Luận văn Thạc sĩ khoa học LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hồng – Phó viện trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, người thầy_người anh tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt q trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân – giáo tận tình hướng dẫn em suốt q trình hồn thành luận văn Trong q trình nghiên cứu vừa qua, em nhận giúp đỡ bảo tận tình cán Phịng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen Đặc biệt Th.S Nguyễn Thu Hiền giúp đỡ em q trình nghiên cứu tiến hành thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy Khoa Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt năm qua Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ người thân gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn người bạn chia sẻ khó khăn thử thách sống cơng việc để em có kết Một lần em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 08 năm 2014 Luận văn Thạc sĩ khoa học BẢNG CHỮ VIẾT TẮT B.subtilis Bacillus subtilis bp Base pair (c DNA Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium Bromide IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Ker Keratinase LB Luria-Bertani µl Microlit PCR Polymerase Chain Reaction (Phvà B.sem nhis 168M chia Primer-F MPolymer Primer-R MMPolymer rARN Ribosomal ribonucleic acid VK Vi khul Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng Trang Bảng Trình tư cặp mồi 21 Bảng Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng Thành phần gel cô 5% gel tách 10% polyacrymide 25 Bảng Thành phần phản ứng cắt với enzyme XhoI BamHI 26 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR1a 29 Bảng Thành phần điều kiện phản ứng PCR2 30 Bảng Hoạt tính keratinase từ chủng nghiên cứu 48 Luận văn Thạc sĩ khoa học DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu Tên hình Trang Hình Một số sản phẩm chứa keratin Hình Cấu trúc xoắn α gấp nếp β keratin Hình Cấu tạo phân tử keratinase Hình Vi khuẩn E.coli Hình Vi khuẩn B subtilis 10 Hình Vector biểu 19 Hình Sơ đồ nghiên cứu biểu gen Ker E.coli B.subtilis 22 Hình Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker promoter gen αamylase chủng B subtilis 168M phương pháp Megarprimer 28 Hình Ảnh điện di DNA tổng số 33 Hình 10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Keratinase 34 Hình 11 Điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn XhoI BamHI 36 Hình 12 Trình tự đọc mồi vector (T7 promoter T7 terminator) 37 Hình 13 Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn 39 Hình 14 Điện di protein gel polyacrylamide –SDS nồng độ 12,5% 40 Hình 15 Điện di đồ sản phẩm PCR 42 Hình 16 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng 43 Luận văn Thạc sĩ khoa học enzyme giới hạn Hình 17 Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] cắt kiểm tra SmaI KpnI 45 Hinh 18 Kết kiểm tra hoạt tính tế bào B subtilis 168M tái tổ hợp mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker] 46 Hình 19 Điện di dịch enzyme thơ gel SDS-PGE 47 Luận văn Thạc sĩ khoa học keratinase tái tổ hợp thể tế bào chất vi khuẩn E coli [26], nên tập trung thu hồi protein dạng hòa tan Protein ngoại lai thu hồi sau cảm ứng điện di gel SDS 12,5% thu được kết hình 14 Hình 14: : Đinh ợc kết hình 14 đtein dởinh ợc kế Giếng M: Thang protein chuẩn (14-116 kDa); 1: Protein tổng số từ E coli BL21(DE3) [pET32a - Ker2] không cảm ứng IPTG; 2: Protein tổng số từ E coli BL21(DE3) [pET32a – KerE] cảm ứng 1mM IPTG Kết điện di cho thấy, mẫu protein cảm ứng xuất băng đậm hẳn so với mẫu khơng cảm ứng Dịng tế bào E coli mang vector pET32a-KerE tổng hợp protein ngoại lai có kích thước khoảng 36 kDa (giếng 2) Điều khẳng định biểu thành công gen KerE tế bào E coli BL21(DE3) Theo nghiên cứu biểu gen keratinase, kích thước protein tạo có khác tùy theo nguồn gốc gen hệ vector biểu Khối lượng phân tử keratinase khoảng 18-200 kDa, ngoại trừ enzyme đặt biệt từ loại nấm gây bệnh [24] Đối với gen keratinase từ chủng B licheniformis, có nhiều nghiên cứu thành cơng việc biểu gen E coli tế bào nấm men Pichia [29, 48] Kích thước keratinase từ chủng B.licheniformis khoảng 33 kDa 39 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học Tuy nhiên, biểu gen với vector pET30a pET32a E coli lại có kích thước 45 55 kDa [29] Một nghiên cứu khác Radha S cộng biểu gen nấm men P pastoris lại có kích thước khoảng 39 kDa [48] Gen keratinase phân lập từ chủng B licheniformis HT10, biểu với vector pET22b E coli, có kích thước khoảng 28 kDa Kích thước protein thu nhỏ nhiều so với kích thước công bố Chủng Bacillus subtilis chủng vi khuẩn có khả thủy phân lơng vũ cao nguồn nguyên liệu gen keratinase phổ biến nghiên cứu Kích thước protein keratinase từ chủng có khác công bố trước 25,4 kDa [45], 32 kDa [49], 22kDa [25] Protein từ chủng B subtilis Đ.nđ1.2 nghiên cứu biểu với vector pET32a E coli lại có kích thước cao hơn, khoảng 36 kDa Kích thước protein keratin tái tổ hợp có chênh lệch tượng cắt ngắn biến đổi q trình hồn chỉnh protein trước khỏi tế bào 3.4 Biểu gen kerB tế bào B.subtilis 168M 3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB phƣơng pháp Megaprimer Để biểu thành cơng gen KerB khoảng cách từ promoter đến codon khởi đầu khung đọc mở phải đảm bảo việc dịch mã khơng đứt qng Do tái tổ hợp gen KerB với Promoter gen α-amylase từ chủng B subtilis phương pháp Mageprimer hình phần 2.2.9 Promoter gen αamylase từ chủng B subtilis chọn làm chủng chủ (BsA), tạo phù hợp cao RNA-polymerase chủng chủ với promoter hệ biểu Quá trình khuếch đại đoạn promoter BsA, KerB Bacillus sp tái tổ hợp hai đoạn gen thông qua PCR liên tiếp: PCR1a, PCR1b, PCR2 Trong sản phẩm PCR1a đoạn promoter nhân lên từ chủng B.subtilis 168M cặp mồi P1Bs Pk Sản phẩm PCR1b gen Ker nhân lên cặp mồi KerB Sử dụng sản phẩm PCR1a sản phẩm phản ứng khuếch đại gen KerB tiến hành phản ứng PCR2 Đây dạng phản ứng PCR kéo dài, sử dụng cặp mồi P1Bs KerB-R, khn DNA song song 40 Hồng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học đoạn promoter Bspr đoạn gen KerB Thành phần điều kiện phản ứng PCR2 thể bảng Sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% thu kết Hình 15 M Hình 15 : Điện di đồ sản phẩm PCR M: Marker DNA chuẩn kb, 1: Sản phẩm PCR2, 2: Sản phẩm PCR1a, 3: Sản phẩm PCR1b Hình ảnh điện di cho thấy kích thước đoạn DNA tổ hợp gen kerB promoter chủng B.subtilis 168M [Bsp.KerB] có kích thước tổng kích thước hai gen nhân PCR1a PCR1b với kích thước tính tốn, sản phẩm PCR rõ ràng, không bị đứt gãy, đặc hiệu Như sản phẩm PCR hoàn toàn đủ tiêu chuẩn để sử dụng cho bước nghiên cứu 3.4.2 Tách dòng tổ hợp gen keratinase vector pTZ57RT E.coli TOP10F’ Tổ hợp gen Bsp.KerB sau khuếch đại PCR2 gắn với vector pTZ57R/T nhân dòng E coli TOP10F’ Các plasmid thu nhận sau tách chiết cắt kiểm tra enzyme giới hạn KpnI SmaI để kiểm tra khả gắn tổ hợp gen với vector Kết cắt kiểm tra plasmid enzyme giới hạn thể hình 16 41 Hồng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học Hình 16: Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng enzyme giới hạn 1: Vector pTZ57RT[Bsp.Ker], 2: Vector pTZ57RT, M: Marker DNA chuẩn 1kb Kết băng điện di cho thấy sản phẩm cắt có băng khác nhau, theo lý thuyết Băng thứ có kích thước gần 3kb tương đương với kích thước vector pZT57R/T, băng thứ khoảng 1100 bp, tương đương với kích thước gen ngoại lai [Bsp.KerB] Điều chứng tỏ, chúng tơi tách dịng thành cơng gen ngoại lai [Bsp.KerB] vector tách dịng pZT57R/T 3.4.3 Thiết kế vector biểu Bacillus subtilis Trong nghiên cứu sử dụng vector pHT43 làm vector biểu hệ biểu B.subtilis Vector pHT43 thuộc dịng vector pHT thương mại hóa công ty Mobitec (Đức) [48], vector thoi, lúc biểu hệ biểu Bacillus E.coli Dịng vector pHT có chứa operon groESL nằm vùng lac operator cho phép cảm ứng kích thích sinh tổng hợp protein ngoại lai cách bổ sung IPTG Hàm lượng enzyme tái tổ hợp sinh tổng hợp sau cảm ứng IPTG tăng lên từ từ 1013% protein tổng số thử nghiệm biểu gen mã hóa htpG pbpE Đồng thời, protein tái tổ hợp gen amyQ α-amylase cellulase A, B từ chủng Clostridium thermocellum thử nghiệm cho kết tốt với vector pHT43 Bên cạnh đó, gen mã hóa enzyme α-amylase chứng minh có khả biểu tốt vector pHT43 sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp có 42 Hồng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học hoạt tính sinh học cao Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi định tái tổ hợp gen KerB với promoter gen mã hóa α-amylas từ chủng chủ Bacillus subtilis 168M để đảm bảo trình dịch mã sinh tổng hợp enzyme diễn xác đạt hiệu cao Đoạn gen ngoại lai [Bspr.KerB] cắt hai enzyme SmaI KpnI từ vector pTZ57R/T gắn vào vector pHT43 mở vòng hai điểm cắt tương ứng T4 ligase trước biến nạp vào tế bào E coli TOP10F’ để nhân dòng Các dòng tế bào E.coli Top10F ni mơi trường có bổ sung kháng sinh chọn lọc để thu nhận tách chiết plasmid Plasmid sau lựa chọn tách chiết cắt kiểm tra đoạn DNA ngoại lai hai enzyme giới hạn tương ứng SmaI KpnI Kết cắt kiểm tra plasmid tách chiết thể hình 17 M ~8000 bp ~1100 bp Hình 17 Plasmid pHT43 mang tổ hợp mang [Bspr.KerB] cerB] 43SmaI KpnI 1: Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] cắt SmaI KpnI 2: Plasmid pHT43 không mang tổ hợp [Bspr.Ker] M: Marker 1kb (NEB) Kết hình cho thấy plasmid tách chiết sau cắt enzyme giới hạn xuất hai băng DNA, băng có kích thước khoảng 8000 bp kích thước vector pHT43, băng có kích thước khoảng 1100 bp kích thước đoạn gen ngoại lai [Bspr.KerB] Trong đó, mẫu đối chứng vector pHT43 khơng mang gen ngoại lai, sau cắt enzyme giới hạn xuất 43 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học băng có kích thước khoảng 8000 bp Điều khẳng định thiết kế thành công vector tái tổ hợp pHT43 Các plasmid pHT43 mang đoạn gen tái tổ hợp [Bspr.KerB] với kích thước khoảng 1,1 kb thu nhận để tiến hành biến nạp vào tế bào trần B subtilis 168M 3.4.4 Biểu keratinase tế bào Bacillus subtilis 168M 3.4.4.1 Kiểm tra khả thủy phân keratin chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp Vector biểu [pHT43.Bsp.KerB] thu nhận sau trình tách plasmid biến nạp vào tế bào trần chủng B.subtilis 168M Kết thúc q trình ni cấy, tế bào B subtilis 168M mang vector tái tổ hợp [pHT43.Bspr.KerB] thu nhận kiểm tra hoạt tính đĩa LB agar + 1% azokeratin (Hình 18) Kết kiểm tra cho thấy khuẩn lạc có hoạt tính, plasmid có chứa đoạn DNA ngoại lai, khuẩn lạc đối chứng (plasmid khơng mang đoạn DNA ngoại lai) khơng thể hoạt tính thủy phân chất Các kết cho phép khẳng định hoạt tính khuẩn lạc tái tổ hợp gen ker ngoại lai vector định Hình18 Kết kiểm tra hoạt tính tế bào B subtilis 168M mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker]: Chủng dại (1); Các tế bào B subtilis 168M mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker] (2,3,4,5,8,9,10); B subtilis 168M mang vector pHT43 (6,7) 3.4.4.2 Điện di enzyme keratinase tái tổ hợp gel SDS-PAGE 44 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học Các tế bào B subtilis 168M tái tổ hợp xác định có khả thủy phân keratin cao nuôi mơi trường phục hồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc chloramphenicol 0,5 mg/ml Sau q trình ni lắc, toàn dịch canh trường ly tâm loại tế bào thu dịch coi dịch enzyme thơ tính chất chủng vi khuẩn Bacillus tiết enzyme ngoại bào bên ngồi mơi trường trình sinh trưởng phát triển Dịch enzyme thô kiểm tra xuất enzyme keratinase tái tổ hợp cách điện di gel poly acrylamide (SDS-PAGE) 12,5% Kết điện di protein thể hình 25 kDA Hình 19 : Đi9hatinase tenzyme thô gel SDS-PGE Kết điện di gel SDS-PAGE cho thấy băng sáng rõ có kích thước vào khoảng 25 kDa, băng protein khơng xuất bên dịch enzyme thô đối chứng từ chủng B.subtilis 168M hoang dại Điều cho thấy băng protein có khả băng keratinase tái tổ hợp chủng B.subtilis 168M Kết đem so sánh với nghiên cứu trước Liu cộng [33] Trong công bố này, tác giả tiến hành biển keratinase chủng B.subtilis WB600 kết điện di gel SDS-PAGE cho thấy băng keratinase tái tổ hợp sau tinh có kích thước vào khoảng gần 30 kDa Kết cộng thêm với chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp chúng tơi chứng minh có khả 45 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học thủy phân keratin cao phần chứng minh băng protein điện di băng keratinase tái tổ hợp Chúng thành công việc biểu keratinase chủng B.subtilis 168M phương pháp tái tổ hợp gen KerB với promoter chủng vi khuẩn Phương pháp tái tổ hợp gen đảm bảo cho trình dịch mã ổn định xác cho keratinase hệ biểu Bacillus vector pHT43 Phương pháp sử dụng thành cơng cho hoạt tính cao nghiên cứu công bố [31] 3.5 Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 B.subtilis 168M Do tính chất chủng E.coli tiết enzyme nội bào, muốn thu nhận keratinase tái tổ hợp, chủng E.coli BL21 cần siêu âm phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme nội bào Ngược lại, chủng B.subtilis 168M lại có tính chất tiết enzyme ngoại bào môi trường nên việc thu nhân enzyme dễ dàng nhiều thông qua trình ly tâm thu dịch Kết đo hoạt tính vi khuẩn tái tổ hợp mẫu vi khuẩn đối chứng thể qua bảng Bảng Hoạt tính enzyme keratinase từ chủng nghiên cứu Loại chất Hoạt tính keratinase (U/ml) E coli BL21(DE3) B.subtilis 168M [pET32(+)-ker] Azokeratin Chủng hoang dại pHT43[Bspr.Ker] 21 688,5 275 Kết (bảng 7) cho thấy chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp có hoạt tính cao nhiều so với hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ chủng E.coli so với mẫu đối chứng Hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ chủng E.coli thấp nhất, thấp so với chủng hoang dại Gen mã hóa cho keratinase tổng hợp từ chủng B.subtilis 168M dạng preprosubtilisin điển hình, propeptid hoạt động chaperone nội phân tử trình cuộn xoắn để hình thành lên 46 Hồng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học cấu trúc có hoạt tính subtilisin, sau chúng cắt bỏ khỏi phân tử subtilisin, biểu E coli propeptid không biểu dẫn đến hoạt tính khơng có Ngồi ra, biểu E coli, protein sinh có xu hướng tạo thành dạng thể vùi khơng hịa tan, E coli khơng có khả thực biến đổi sau dịch mã, protein sau tổng hợp phải trải qua biến đổi sau dịch mã cuộn gấp để tạo thành cấu trúc bậc ba bốn, chaperone khơng có E coli có khơng đầy đủ chaperon giống q trình tổng hợp Bacillus Do khơng có đầy đủ chaperon dẫn đến sai sót q trình cắt bỏ phần prepropeptid, khơng hình thành đầy đủ cấu trúc gấp nếp enzyme, kết protein hình thành dạng keo tụ dạng hịa tan, chúng thường khơng có hoạt tính hoạt tính thấp Cịn chủng tái tổ hợp B subtilis 168M mang vector pHT43[Bspr.ker] promoter sử dụng promoter gen -amylase chủng chủ Khi promoter nhiễm sắc thể cảm ứng tinh bột, trường hợp nằm ngồi nhân plasmid nên không cần đến tinh bột để cảm ứng, mà q trình điều hịa biểu phụ thuộc hồn tồn vào q trình sinh trưởng chủng tái tổ hợp, glucose vừa đóng vai trị chất vừa yếu tố giới hạn nên ảnh hưởng nhiều đến trình biểu gen Kết từ bảng cho thấy hoạt độ keratinase từ chủng tái tổ hợp B subtilis 168M mang vector pHT43[Bspr.ker] (688,5 U/mL) cao so với keratinase từ chủng dại Bacillus sp DNd 1.2 (275 U/mL) 2,5 lần Kết tương tự với kết Nguyễn Văn Hiếu cộng (2010) [1] tái tổ hợp gen keratinase chủng B licheniformis DS23 vào vector pHT43 biểu tế bào B subtilis 168 làm tăng hoạt tính enzyme lên 3,5 lần từ 21,6 U/mL lên 75,8 U/mL [1] Liu cộng thu nhận keratinase kiềm chống oxi hóa với hoạt độ 323 U/mL từ chủng B licheniformis tái tổ hợp vào chủng B subtilis WB600[33] So sánh với nghiên cứu biểu keratinase hệ biểu B.subtilis công bố, chủng B.subtilis 168M tái tổ hợp chúng tơi có hoạt tính cao hẳn so với hoạt tính 330 U/ml nghiên cứu Liu cộng [33] 150 U/ml Lin 47 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học với cộng [31] Một nghiên cứu khác Liu cộng [33], để khám phá hệ thống biểu tốt để sản xuất keratinase, nhóm tác giả phân tích so sánh hệ thống biểu keratinase, cách sử dụng gen từ vi khuẩn Bacillus licheniformis keratinase BBE11-1 thể Escherichia coli, Bacillus subtilis P pastoris Với điều kiện tối ưu hoạt độ keratinase tối đa thu từ B subtilis tái tổ hợp 3.010 U/ml P.pastoris 1.050 U / ml Nghiên cứu Liu cộng cho thấy hoạt độ keratinase tối đa từ B subtilis hoạt độ cao báo cáo cho dòng vi khuẩn Những kết B subtilis máy chủ lý tưởng cho sản xuất keratinase, với ứng dụng tiềm chế biến thức ăn bổ sung dệt may Qua nghiên cứu cho thấy B subtilis chủng chủ thích hợp để sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô công nghiệp với ưu điểm vượt trội tốc độ sinh trưởng nhanh, khả tiết protein ngoại bào mạnh chủng vi sinh vật an toàn khơng gây nội độc tố Bên cạnh đó, với việc thu nhận enzyme đơn giản không tốn kém, khẳng định keratinase tái tổ hợp từ chủng B.subtilis 168M chúng tơi hồn tồn phù hợp đủ tiêu chuẩn cho tinh enzyme ứng dụng vào thực tiễn sản xuất nghiên cứu cao 48 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học Phần IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã khuếch đại thành cơng gen mã hóa keratinase từ chủng B.subtilis ĐNd1.2 cặp mồi đặc hiệu KerE KerB - Đã thiết kế thành công vector biểu gen mã hóa keratinase vật chủ E.coli BL21 (DE3) B.subtilis 168M - Biểu thành công gen mã hóa keratinase tế bào E.coli BL21 (DE3) B.subtilis 168M thu enzyme có hoạt tính tương ứng 21 U/ml 688,5 U/ml 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu chọn điều kiện thích hợp để biểu chủng Bacillus - Nghiên cứu thu hồi sản phẩm keratinase tinh 49 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Văn Hiếu Phí Quyết Chiến, Nghiêm Ngọc Minh, Lê Gia Hy (2010), "Tách dòng biểu gen mã hóa protease serin chủng Bacillus subtilis HT 24 Escherichia coli", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3A), pp 841-846 Văn Thị Hạnh Trần Tích Cảnh (1993), "Tạo protein hồ tan từ kazetine lơng vũ phế liệu.", Khoa học công nghệ., 2, pp 1-6.", Khoa học cơng nghệ, 2, pp 1-6 Nguyễn Đình Kim (2001), "Giáo trình vi sinh vật đất", pp Nguyễn Đình Quyến Trần Thị Lan Phương (2001), "Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải keratin dùng để chuyển hóa sinh học lơng gia cầm", Sinh học, 23(2), pp 27-30 Tiếng anh 10 11 12 13 14 15 16 17 18 A Brandelli (2005.), " Production of an extracellular keratinase from Chryseobacterium sp growing on raw feathers", J Biotechnol;, pp 35-37 A Gessesse., R Hatti-Kaul., B.A Gashe., Mattiasson B (2003), "Novel alkaline proteases from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather Enzyme and Microbial Technology", 32, pp 519524 Anbu P., Hilda A., Sur H W., Hur B K., Jayanthi S ( 2008), "Extracellular keratinase from Trichophyton sp HA-2 isolated from feather dumping soil.", Int Biodeterior Biodegrad., 62, pp 287-292 B Zhang, Z Sun, D Jiang, Niu T (2009), "Isolation and purification of alkaline keratinase from Bacillus sp 50-3", African Journal of Biotechnology, 8, pp B Bockle., Muller R (1997), "Reduction of Disulfide Bonds by Streptomyces pactum during Growth on Chicken Feathers Appl Environ Microbiol", 63, pp 790-792 Balaji S., Kumar M S., Karthikeyan R., Kumar R., Kirubanandan S., Sridhar R., Sehgal P K (2008), "Purification and characterization of an extracellular keratinase from a hornmeal-degrading Bacillus subtilis MTCC (9102).", World J Microbiol Biotechnol., 24, pp 2741-2745 Bernal C., Diaz I., Coello N (2006), "Response surface methodology for the optimization of keratinase production in culture medium containing feathers produced by Kocuria rosea", Can J Microbiol., 52(5), pp 445-50 Brandelli A (2008 ), "Bacterial keratinases: useful enzymes for bioprocessing agroindustrial wastes and beyond.", Food Bioprocess Technol 1, pp 105-116 Cai C G., Chen J S., Qi J J., Yin Y., Zheng X D (2008), "Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain", J Zhejiang Univ Sci B., 9(9), pp 713-20 Chao Y P., Xie F H., Yang J., Lu J H., Qian S J (2007), "Screening for a new Streptomyces strain capable of efficient keratin degradation", J Environ Sci (China) 19(9), pp 1125-8 Chitte R R., Dey S (2001), "Cloning and expression of an actinokinase gene from a thermophilic Streptomyces in Escherechia coli", Indian J Exp Biol., 39(5), pp 410-5 Daroit D J., Corrêa A P F., Brandelli A (2009), "Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp P45 isolated from the Amazon basin fish Piaractus mesopotamicus.", Int Biodeterior Biodegrad., 63, pp 358-363 Dubendorff J.W Studier F.W (1991), " Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.", J Mol Biol 219, pp 45-59 F Xie., Y Chao., X Yang., J Yang., Z Xue Y Luo., Qian S (2009), " Purification and characterization of four keratinases produced by Streptomyces sp strain 16 in native human foot skin medium Bioresour Technol", 101, pp 344-350 50 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Friedrich A B., Antranikian G (1996), "Keratin Degradation by Fervidobacterium pennavorans, a Novel Thermophilic Anaerobic Species of the Order Thermotogales", Appl Environ Microbiol., 62(8), pp 2875-2882 Ghosh A., Chakrabarti K., Chattopadhyay D (2008), "Degradation of raw feather by a novel high molecular weight extracellular protease from newly isolated Bacillus cereus DCUW", J Ind Microbiol Biotechnol., 35(8), pp 825-34 Epub 2008 Apr 22 Gupta Rani, Ramnani Priya (2006), "Microbial keratinases and their prospective applications: an overview", Applied Microbiology and Biotechnology, 70(1), pp 21-33 Gushterova A., Vasileva-Tonkova E., Dimova E., Nedkov P., Haertlé T (2005), "Keratinase production by newly isolated Antarctic actinomycete strains.", World J Microbiol Biotechnol., 21, pp 831-834 H Shi-Hung Lin, Li-Jung Yin, Jiang Shann-Tzong (2009), "Cloning, Expression, and Purification of Pseudomonas aeruginosa Keratinase in Escherichia coli AD494(DE3)pLysS Expression System", J Agric Food Chem, 57, pp 3506–3511 H Gradisar., J Friedrich., I Krizaj., Jerala R ( 2005.), " Similarities and specificities of fungal keratinolytic proteases: comparison of keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to some known proteases Appl Environ Microbiol; " 71, pp 3420-3426 Hiếu Nguyễn Văn, Tiến Phí Quyết, Minh Nghiêm Ngọc, Hy Lê Gia (2010), "Tách dịng biểu gen mã hóa protease serin chủng Bacillus subtilis HT 24 Escherichia coli", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp 841-846 Hong Hu, Jun He, Bing Yu, Ping Zheng, Zhiqing Huang, Xiangbing Mao, Jie Yu, Guoquan Han, Chen Daiwen (2013), "Expression of a keratinase (kerA) gene from Bacillus licheniformis in Escherichia coli and characterization of the recombinant enzymes.", Biotechnol Lett, 35(2), pp 239-44 Ionata E., Canganella F., Bianconi G., Benno Y., Sakamoto M., Capasso A., Rossi M., La Cara F (2008), "A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv pennavorans bv nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds", Microbiol Res., 163(1), pp 105-12 Epub 2006 Nov J.J Noval., Nickerson W.J (1995), "Decomposition of native keratin by Streptomyces fradiae J Bacteriol", 77, pp 251-263 Kumar A G., Swarnalatha S., Gayathri S., Nagesh N., Sekaran G (2008), "Characterization of an alkaline active-thiol forming extracellular serine keratinase by the newly isolated Bacillus pumilus", J Appl Microbiol., 104(2), pp 411-9 Epub 2007 Oct Lin X Lee C.G., Casale SE and Shih J.C (1992), " Purification and characterization of a keratinase from a feather degrading Bacillus Licheniformis strain ", J Appl Environ Ailcrobiol., 58, pp 32713275 Lin X Wong S L., Miller E S., Shih J C (1997), "Expression of the Bacillus licheniformis PWD1 keratinase gene in B subtilis", J Ind Microbiol Biotechnol, 19(2), pp 134-8., 19(2), pp 134-138 Liu B1, Zhang J, Gu L, Du G, Chen J, X Liao (2014), "Comparative Analysis of Bacterial Expression Systems for Keratinase Production.", Appl Biochem Biotechnol., pp Liu B, Zhang J, Li B, Liao X, Du G, J Chen (2013), " (2013) Expression and characterization of extreme alkaline, oxidation-resistant keratinase from Bacillus licheniformis in recombinant Bacillus subtilis WB600 expression system and its application in wool fiber processing.", Word J Microbiol Biotechnol 29, pp 825-832 Longeveld JPM, Wang, JJ, Shih, GC, Garssen, Shih (2003), " Enzymatic degradation of prion protein from infected cattle and sheep brain stem EMBO J (submitted)", EMBO J (submitted)pp Matsui T., Yamada Y., Mitsuya H., Shigeri Y., Yoshida Y., Saito Y., Matsui H., Watanabe K (2009), "Sustainable and practical degradation of intact chicken feathers by cultivating a newly isolated thermophilic Meiothermus ruber H328", Appl Microbiol Biotechnol., 82(5), pp 941-50 Epub 2009 Feb 51 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Mitsuiki S., Sakai M., Moriyama Y., Goto M., Furukawa K (2002), "Purification and some properties of a keratinolytic enzyme from an alkaliphilic Nocardiopsis sp TOA-1", Biosci Biotechnol Biochem., 66(1), pp 164-7 Nam G W., Lee D W., Lee H S., Lee N J., Kim B C., Choe E A., Hwang J K., Suhartono M T., Pyun Y R (2002), "Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe", Arch Microbiol., 178(6), pp 538-47 Epub 2002 Oct 16 Novagen (1998), " pET System Vectors and Hosts Instruction manual Catalog no TB038", pp P Bressollier., F Letourneau., M Urdaci., Verneuil B (1999), "Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus Appl Environ Microbiol.", 65, pp 2570-2576 Papadopoulos M.C ( 1986 ), "The effect of enzymatic treatment on amino acid content and nitrogen characteristics of feather meal.", Anim Feed Sci Technol, 16, pp 151-156 R Tsuboi., I Ko., K Takamori., Ogawa H (1989), " Isolation of a keratinolytic proteinase from Trichophyton mentagrophytes with enzymatic activity at acidic pH Infect Immun; " 57, pp 34793483 Radha S., P Gunasekaran (2009), "Purification and characterization of keratinase from recombinant Pichia and Bacillus strains.", Protein Expr Purif, 64(1), pp 24-31 Riessen S., Antranikian G (2001), "Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity", Extremophiles., 5(6), pp 399408 Sambrook, J., Fritsch, E F., Maniatis, T (1989), "Molecular Cloning a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor, 1, pp Suh H J., Lee H K (2001), "Characterization of a keratinolytic serine protease from Bacillus subtilis KS-1", J Protein Chem., 20(2), pp 165-9 Syed D G., Lee J C., Li W J., Kim C J., Agasar D (2009), "Production, characterization and application of keratinase from Streptomyces gulbargensis", Bioresour Technol., 100(5), pp 186871 Epub 2008 Nov Szabo L., Benedek A., Szabo M L., Barabas G (2000), "Feather degradation with a thermotolerant Streptomyces graminofaciens strain.", World J Microbiol Biotechnol , 16, pp 252-255 Tec Mo Bi (2005), "Bacillus subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions." Tork SE, Shahein YE, El-Hakim AE, Abdel-Aty AM, MM Aly (2013), "Production and characterization of thermostable metallo-keratinase from newly isolated Bacillus subtilis NRC 3.", Int J Biol Macromol, 55(169-75), pp W Akhtar., Edwards H.G (1997 ), "Fourier-transform Raman spectroscopy of mammalian and avian keratotic biopolymers Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc;" 53A, pp 81-90 Williams C.M., Richtcr C.S., J.C.I Mackenzie J.R and Shih (1990 ), "Isolation, identification and characterization of a feather-degrading bacterium", J Appl Environ Microbiol, 56, pp 1509-1515 Bockle B., Galunsky B., Muller R (1995), "Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530", Appl Environ Microbiol, 61(10), pp 3705-10 Brandelli A., Daroit D J., Riffel A (2010), "Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications", Appl Microbiol Biotechnol, 85(6), pp 1735-50 Lin H H., Yin L J., Jiang S T (2009), "Cloning, expression, and purification of Pseudomonas aeruginosa keratinase in Escherichia coli AD494(DE3)pLysS expression system", J Agric Food Chem, 57(9), pp 3506-11 Yamamura S., Morita Y., Hasan Q., Rao S R., Murakami Y., Yokoyama K., Tamiya E (2002), "Characterization of a new keratin-degrading bacterium isolated from deer fur", J Biosci Bioeng, 93(6), pp 595-600 52 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 Luận văn Thạc sĩ khoa học 53 Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20 ... NHIÊN - HOÀNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420122 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH... karatinase cao để đưa vào sản xuất với qui mô lớn, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu biểu gen mã hóa keratinase tế bào Escherichia coli Bacillus? ??  Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn... cầu sử dụng keratinase ngày cao nên nghiên cứu tập trung chủ yếu vào phân lập gen biểu keratinase tái tổ hợp Một số nghiên cứu phân lập biểu gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương (Bacillus sp.)