Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu về các tính chất như khối lượng phân tử, nhiệt độ, pH tối ưu, ảnh hưởng của Ca+, sản phẩm chính của quá trình phân hủy, khả năng thủy phân các dạng nguyên liệu như Amyloza, Amylopectin, tinh bột sắn đã hồ hóa củng như tinh bột sắn dạng hạt sống.
25 (2): 39-43 T¹p chÝ Sinh häc 6-2003 TÝnh ChÊt Và Khả Năng Thủy Phân TINH Bột Sắn Của Một Số AMYLAza VI SINH Vật Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sơng Viện Sinh học nhiệt đới Nguyễn Xích Liên Trờng đại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh Amylaza enzym quan trọng ngành công nghƯ sinh häc hiƯn C¸c enzym sư dơng công nghiệp thực phẩm, bột giặt, dệt, giấy nh amylaza, proteaza, lipaza, xenlulaza chiÕm 70% tỉng khèi l−ỵng enzym sư dụng [3] Ngoài ra, việc ứng dụng amylaza më réng nhiỊu lÜnh vùc kh¸c nh− kü thuật phân tích, y tế, lâm sàng học, Phần lín α-amylaza vi khn cã ngn gèc tõ Bacillus, cßn chủng sử dụng sản xuất glucoamylaza (GA) loại nấm sợi Aspergillus [2, 8] Sau kết nghiên cứu tính chất nh khối lợng phân tử, nhiệt độ, pH tối u, ảnh hởng Ca2+, sản phẩm trình thủy phân, khả thủy phân dạng nguyên liệu nh amyloza, amylopectin, tinh bột sắn đ hồ hóa nh tinh bột sắn dạng hạt sống số amylaza quan trọng từ chủng công nghiệp Viện Sinh học nhiệt ®íi nh− vi khuÈn Bacillus subtilis, nÊm mèc Aspergillus oryzae A kawasaki I Phơng Pháp nghiên cứu Nguyên liệu Tinh bột sắn h ng Vedan đợc sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu -amylaza từ B subtilis Viện Sinh học nhiệt đới [11], tinh từ enzym thô cách tủa polyetylenglycol cồn etylic Amylaza từ môi trờng bề mặt gạo lức nấm mốc A oryzae A kawasaki (chủng thơng mại Nhật Bản) Quá trình thu amylaza đợc thực theo bớc sau: trích ly enzym dung dịch đệm, tủa enzym cồn êtylic 96o sau tinh tiếp sắc ký lọc gel sephadex Enzym đợc sấy đông khô Các chế phẩm glucoamylaza GMA 200L termamyl 120L (Novo, Đan Mạch) Phơng pháp Hoạt tính enzym: hoạt tính amylaza đợc xác định theo phơng pháp Smith Rose [10] Hoạt tính GA đợc tính dựa lợng glucoza tạo thủy phân tinh bột enzym Hàm lợng glucoza đợc xác định cách đo mật độ quang dung dịch có mặt thuốc thử dinitro axit salicilic bớc sóng 520 nm [7] Hàm lợng protêin tan đợc tính theo phơng ph¸p Bradford [4] TÝnh chÊt hãa lý cđa enzym: pH opt đợc xác định cách đo hoạt tính -amylaza đệm phốtphát 0,1 M GA đệm axêtat 0,15M giá trị pH từ 3,0 đến 9,0 Nhiệt độ tối u đợc xác định cách đo hoạt tính enzym nhiệt độ khác pH 6,5 -amylaza pH = 4,5 GA ảnh hởng Ca2+: hoạt tính amylaza đợc xác định pH nhiệt độ thích hợp có Ca2+ với nồng độ 100-300 mg/l Độ tinh phân tử lợng enzym đợc nghiên cứu điện di gel SDS polyacrylamit theo phơng pháp Laemmli [4] Xác định sản phẩm sau thủy phân: thành phần oligosaccharit đợc định tính phân tích khối phổ Dung dịch tinh bột sau thủy phân đợc pha lo ng tới nồng độ vài 39 àg/ml, sau đợc phân tích máy MS 1100 h ng AGILENT, Mỹ Các phân tích khối phổ đợc thực phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ hóa học Nghiên cứu khả thủy phân số dạng chất: tinh bột sắn đ hồ hóa, tinh bột sắn dạng hạt sống, amyloza amylopectin tách từ tinh bột sắn theo phơng pháp Balagopalan [1], đợc chuẩn bị với nồng độ 1%, thêm enzym với hàm lợng 15 đv/1g chất (-amylaza), 20 đv/1g chất (GA) sau thủy phân điều kiện thích hợp II Kết Quả Và thảo Luận Một số tính chất amylaza Một số tính chất amylaza gồm hoạt tính đặc hiệu, t0, pH tối u, ảnh hởng ion Ca2+ lên hoạt tính enzym đợc nghiên cứu Kết đợc ghi bảng Các amylaza từ vi khuẩn hoạt động vùng pH trung tính amylaza tõ nÊm mèc cã ho¹t tÝnh cao t¹i vùng pH axit Amylaza vi khuẩn có khả chịu nhiệt cao, termamyl 120L chịu đợc nhiệt độ tới 100oC Theo Marchal (1999)[6], tăng hàm lợng Ca2+ làm dịch chuyển nhiệt độ hoạt động tối u enzym vùng thấp Khả bền nhiệt -amylaza từ B subtilis yếu so với termamyl, hoạt tính enzym Ýt phơ thc Ca2+ C¸c amylaza tõ nÊm mèc hoạt động tốt khoảng 50o-55oC, riêng GA từ A niger cđa h ng Novo cã nhiƯt ®é tèi −u 60o-65oC amylaza từ A oryzae có khả hoạt động tốt có mặt Ca2+, GA ảnh hởng Ca2+ không rõ rệt Các amylaza từ vi khuÈn B sutilis vµ tõ nÊm mèc A oryzae, A kawasaki (Viện SHNĐ) có hoạt tính đặc hiệu cao so với enzym đối chứng termamyl 120L GA cđa h ng Novo S¾c ký khèi phỉ MS cã thể đợc sử dụng để xác định xác phân tử lợng enzym Trong điều kiện nghiên cứu nớc ta, sở so sánh với tài liệu công bố tính chất amylaza [8], số isoform phân tử lợng enzym đợc nghiên cứu điện di Các enzym sau tinh đợc cho chạy SDS polyacrylamit gel Thang chuẩn đợc sử dụng gồm bovin serum albumin (66 kDa), ovalbumin từ lòng trắng trứng (45 kDa), 40 trypsinogen (24 kDa) KÕt qu¶ cho thÊy αamylaza tõ B subtilis (enzym Viện SHNĐ) -amylaza từ B licheniformis (termamyl 120L) có isoform, khối lợng phân tử tơng đơng nằm khoảng 57-58 kDa A oryzae tạo nhiều amylaza điều kiện cảm ứng khác [8, 9] Khi đợc nuôi môi trờng gạo lức điều kiện tối u [12], enzym tạo -amylaza taka-amylaza có isoform với phân tử l−ỵng 52-53 kDa [9] GA cđa h ng Novo (tõ A niger) có isoform với khối lợng tơng ứng 74 96 kDa A awamori var kawachi, tên thơng mại A kawasaki enzym đợc sử dụng để sản xuất rợu sakê Enzym có isoform với phân tử lợng từ 57-90 kDa Hình Kết điện di số amylaza vi khuÈn 1: Bovin albumin (66 kDa) 2, 3: α-amylaza tõ B subtilis tđa b»ng cån vµ b»ng PEG 4: α-amylaza A cđa h ng “Amano” Conc., NhËt B¶b 5: Termamyl 120L Sản phẩm trình thủy phân Trong nghiên cứu sản xuất công nghiệp sản phẩm thủy phân từ tinh bột, thành phần nồng độ sản phẩm tạo tác động amylaza quan trọng Các đờng đơn, đờng oligo, dextrin đợc xác định sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lọc gel phân tích khối phổ MS [8] Phân tích MS dựa khối lợng đờng oligosaccharit, dextrin, định tính sản phẩm tạo Sử dụng kết hợp MS sắc ký lỏng cao áp, định lợng xác nồng độ chất Sản phẩm tạo trình thủy phân tinh bột sắn amylaza từ nấm mốc vi khuẩn đợc khảo sát thiết bị MS 1100 AGILENT Mỹ Bảng Một số tính chất amylaza Hoạt tính Phân tử Nhiệt độ Phụ pH tối Hoạt tính đặc hiệu tối u thuộc lợng (đv/ml) u Isoform (kDa) Ca2+ (®v/mgP) (oC) Nguån enzym Termamyl (B.licheniformis) 57-58 6,5-7,0 95 ++ 3177,9 276,34 α-amylaza tõ B subtilis 57-58 6,8-7,0 80 - 1427,5 1331,6 α-amylaza tõ A oryzae 52-53 4-5 50 + 512,0 800,0 GA Novo tõ A niger 74-96 4,2-4,5 60-65 - 2400,0 412,4 GA tõ A kawasaki 57-90 3,8-4,5 55 - 130,0 1041,6 Bảng Sản phẩm thủy phân tinh bột sắn loại amylaza khác Nguồn enzym Termamyl (B licheniformis) Sản phẩm thủy phân DP5, glucoza, DP9 DP6, mét l−ỵng Ýt maltoza, DP3, DP9 α-amylaza (B subtilis) α-amylaza tõ A oryzae GA Novo tõ A niger GA tõ A kawasaki Maltoza, DP6 Glucoza Glucoza DP3: maltotrioza, DP5: maltopentaoza, DP6: maltohexaoza, DP9: dextrin chøa gèc ®−êng glucoza I n t e n s - M S , m i n ( # 1 ) 8000 6000 4000 2000 39 8 6.2 1 0 9 30 80 1 8 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 18 0 2000 m /z Sắc ký đồ Kết phân tích khối phổ sản phẩm sau thủy phân tinh bột sắn -amylaza từ B subtilis 41 Kết quả, thủy phân amylaza từ A kawasaki vµ glucoamylaza cđa h ng Novo, glucoza lµ sản phẩm trình thủy phân Maltoza số dextrin sản phẩm tạo thủy phân amylaza A oryzae Sản phẩm thủy phân termamyl 120L maltopentaoza DP5, DP1, DP3 vµ mét sè dextrin nh− DP9 α-amylaza cđa B subtilis thủy phân tinh bột cho sản phẩm maltohexaoza DP6, lợng không đáng kể đờng maltoza DP2, maltotrioza DP3 DP9 (hình 1) Tính chất giúp tạo sản phẩm ngọt, sản phẩm có DE nhỏ nhng lợng dextrin mạch lớn thấp, dẫn đến độ nhớt thấp, dễ lọc, dung dịch Enzym đợc sử dụng sản xuất maltodextrin DE thấp Sử dụng amylaza có khả tạo số oligosaccharit định, giúp tăng chất lợng sản phẩm maltodextrin DE thấp hay tạo oligosaccharit dïng thùc phÈm, y häc hay c«ng nghiƯp dợc Khả thủy phân dạng chất khác Khả thủy phân tinh bột amylaza phụ thuộc nhiều vào chiều dài độ phân nhánh phân tử chất, thành phần amyloza, amylopectin, tÝnh chÊt còng nh− cÊu tróc cđa h¹t tinh bét [5] Kết trình thủy phân dạng chất khác sau điều kiện tèi −u thĨ hiƯn ë b¶ng B¶ng KÕt thủy phân dạng tinh bột sắn amylaza Cơ chất Tinh bột sắn đ hồ hóa Hạt tinh bột sắn sống Amyloza Amylopectin Lợng đờng khử tạo (% so với lợng chất ban đầu) GA từ Termamyl α-amylaza α-amylaza GA Novo A kawasaki 120L (B subtilis) (A oryzae) 2,66 1,90 44,60 30,50 21,90 0,31 0,57 3,88 0,23 3,21 0,49 0,31 44,40 25,00 10,90 5,31 4,85 44,00 21,70 11,70 Đ có nhiều công bố đề cập tới khả thủy phân liên kết nhánh ph©n tư tinh bét cđa GA, còng nh− viƯc sư dụng kết hợp GA enzym nh pullulanaza hay isoamylaza để tăng hiệu suất trình [8] Trong thÝ nghiƯm nµy, GA tõ A niger (h ng Novo) có khả thủy phân amyloza mạnh chút so với amylopectin, GA từ A kawasaki thủy phân chất với tốc độ ban đầu gần nh Lợng đờng khử thu đợc thủy phân tinh bột sắn cao so với chất khác Dờng nh việc tách riêng hai thành phần amyloza amylopectin ảnh hởng không tốt lên khả thủy phân GA So với tinh bột sắn đ hồ hóa, khả thủy phân tinh bột sắn dạng hạt sống enzym từ A kawasaki thấp lần glucoamylaza từ A niger gần nh khả thủy phân dạng chất Do chế tác động khác mà amylaza bị chi phối nhiều thành phần 42 tính chất phân tử chất Kết cho thấy, -amylase, khả thủy phân amylopectin cao khả thủy phân hạt tinh bột sống thấp nhÊt So víi amyloza, α-amylaza vi khn tÊn c«ng amylopectin với tốc độ nhanh gấp 10 lần (termamyl 120L) 15 lần (enzym Viện SHNĐ) Tốc độ thủy phân amyloza thấp, tơng đơng với tốc độ thủy phân tinh bột sống dạng hạt Khả thủy phân tinh bét phơ thc vµo tû lƯ amyloza, amylopectin thµnh phần Do hàm lợng amylopectin cao (85%) nên tinh bột sắn loại tinh bột dễ bị amylaza công, hàm lợng đờng khử tạo 1/2 lợng đờng khử thu đợc chất chứa amylopectin Có thể thấy chất mạch thẳng có lực -amylaza vi khuẩn Tuy nhiên -amylaza từ nấm mốc A oryzae, độ phân nhánh chất lại ảnh hởng Hàm lợng đờng khử tạo trờng hợp chất tinh bột sắn đ hồ hóa, amyloza amylopectin nh đạt mức 4,0mg/ml, cao nhiều so với lợng tạo -amylaza vi khuẩn -amylaza từ nấm mốc enzym đờng hóa với sản phẩm trình thủy phân maltoza nên lợng đờng khử tạo không hoàn toàn phản ánh khả thủy phân so sánh với enzym từ vi khuẩn Kết cho thấy loại amylaza có chế công phân tử chất khác Termamyl thủy phân yếu tinh bột sắn dạng hạt sống, khả thủy phân dạng chất cao enzym từ B subtilis III KÕt LuËn S¶n phÈm chÝnh thủy phân tinh bột termamyl 120L -amylaza B subtilis tơng ứng maltopentaoza DP5 maltohexaoza DP6 -amylaza vi khuẩn thủy phân amylopectin tốt nhất, với hạt tinh bột sống Tốc độ thủy phân amyloza thấp Đối với -amylaza từ nấm mốc A oryzae, độ phân nhánh chất ảnh hởng rõ rệt Khả thủy phân tinh bét phơ thc vµo tû lƯ amyloza, amylopectin thµnh phần Glucoamylaza thủy phân liên kết nhánh, khả thủy phân amyloza mạnh chút so với amylopectin Enzym từ A kawasaki thủy phân tơng đối tốt tinh bột sắn dạng hạt sống glucoamylaza h ng Novo không tác động lên dạng chất Tài Liệu THAM Khảo Balagopalan C and Padmaja G., 1988: Cassava in Food, Feed and Industry, CRC Press Inc Boca Raton, Florida Cowan D 1996: Trend in Biotechnology, 14: 177-178 Crabb W D and Colin M., 1997: Trend in Biotechnology, 15: 349-352 Eisenthal R and Danson M J., 1992: Enzyme Assay - A practical approach, Oxford University Press, United States Kossmann J and Lloyd J., 2000: Critical reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 35 (3): 141-196 Marchal L M et al., 1999: Biotechnology and bioengineering, 62 (3): 348-357 Miller G L., 1959: Anal Chem., 31: 426429 Pandey A et al., 2000: Biotechnol Appl Biochem., 31: 135-152 Sanoja R R et al., 2000: Applied and Enviromental Microbiology, 66 (8): 33503356 10 Smith and Rose, 1966: Biol Chem 179 (2): 53-58 11 Lª Thị Bích Phợng, Võ Thị Hạnh, 1998: Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học Viện SHNĐ 1993-1998: 13-17, NXB Nông nghiệp 12 Hoàng Kim Anh, 1999: Nghiên cứu tách chiết, tinh enzym -amylaza glucoamylaza từ sinh khối vi sinh vật, Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp sở Viện SHNĐ Properties and hydrolysis action on cassava starch of some microbial amylases Hoang kim anh, ngo ke suong, nguyen xich lien Summary Amylase is one of the most important industrial enzymes in Biotechnology This study deals with the investigation of some main properties of amylases from Bacillus and Aspergillus (Institute of Tropical biology), such as the MW, the temperature, the pH opt, the Ca2+ effect, the hydrolysis action towards different substrates, as well as the profile of starch hydrolyzed products Ngµy nhËn bµi: 5-9-2001 43 ... không tốt lên khả thủy phân GA So với tinh bột sắn đ hồ hóa, khả thủy phân tinh bột sắn dạng hạt sống enzym từ A kawasaki thấp lần glucoamylaza từ A niger gần nh khả thủy phân dạng chất Do chế... Bảng Kết thủy phân dạng tinh bột sắn amylaza Cơ chất Tinh bột sắn đ hồ hóa Hạt tinh bột sắn sống Amyloza Amylopectin Lợng đờng khử tạo (% so với lợng chất ban đầu) GA từ Termamyl -amylaza -amylaza. .. phẩm tạo trình thủy phân tinh bột sắn amylaza từ nấm mốc vi khuẩn đợc khảo sát thiết bị MS 1100 AGILENT Mỹ Bảng Một số tính chất amylaza Hoạt tính Phân tử Nhiệt độ Phụ pH tối Hoạt tính đặc hiệu