Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết so sánh hoạt tính kháng nấm mốc của các loại Chitosan có nguồn gốc khác nhau trong môi trường nuôi cấy khác nhau và được xử lý chiếu xạ ở trạng thái khô và lỏng. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
25 (2): 7-12 6-2003 Tạp chí Sinh học so sánh hoạt tính kháng nấm mốc loại chitosan có nguồn gốc khác điều kiện xử lý chiếu xạ môi trờng nuôi cấy khác NGUYễN DUY LÂM Viện Công nghệ sau thu hoạch trần băng diệp Viện Khoa học Kỹ thuật hạt nhân Việc sử dụng chitosan để làm màng bao cho bảo quản tơi đợc đánh giá hớng phát triển công nghệ sau thu hoạch tơng lai [2] Loại polysacarit tự đ có khả ức chế phát triển vi sinh vật gây hỏng [3, 4, 8] Các mẫu chitosan có nguồn gốc khác có hoạt tính ức chế vi sinh vật khác Tuy nhiên, cha có nghiên cứu đề cập tới hiệu ứng Hiện nay, phơng pháp bọc màng chitosan cha thể phát triển thành quy mô thơng mại nhiều nớc Nguyên nhân hiệu kháng vi sinh vật chitosan không đủ mạnh mà giá sản xuất lại cao so với hóa chất trừ nấm tổng hợp Để nâng cao hoạt tính kháng vi sinh vật chitosan, số tác giả đ sử dụng phơng pháp chiếu xạ nhằm tạo phân đoạn có trọng lợng phân tử thấp Nghiên cứu sớm Matsuhashi Kume [9] tiến hành, đ chitosan chiếu xạ liều 100 kGy có khả ức chế cao phát triển Esherichia coli Các nghiên cứu gần thu đợc kết tơng tự mét sè chđng vi khn, nÊm mèc vµ nÊm men gây thối hỏng điển hình bảo quản sau thu hoạch [1, 5-7] Do chiếu xạ trạng thái khô mà liều chiếu tối u tìm đợc nghiên cứu nêu cao Cần thiết phải tìm cách giảm liều chiếu để nâng cao tính khả thi phơng pháp giá thành tính lành màng bọc Xử lý chiếu xạ chitosan trạng thái lỏng đáp ứng đợc yêu cầu đó, nhng cha đợc đề cập nghiên cứu trớc Phơng pháp nuôi cấy môi trờng thạch đĩa rắn thờng đợc sử dụng để đánh giá tác dụng kháng nấm mốc chitosan, kể chitosan chiếu xạ [7, 11] Trong vài nghiên cứu gần đây, đ sử dụng phơng pháp nuôi cấy nấm mốc môi trờng lỏng nhận thấy vi sinh vật bị ức chế nồng độ chitosan thấp so với kết tác giả khác sử dụng môi trờng nuôi cấy thạch đĩa [1, 5, 6] Tuy nhiên, nghiên cứu so sánh đầy đủ độ nhạy hai phơng pháp nuôi cấy để ®¸nh gi¸ t¸c dơng cđa chitosan víi cïng mét ®iỊu kiện thí nghiệm cha đợc tiến hành Vì lý nêu mà nội dung nghiên cứu nhằm so sánh hoạt tính kháng nấm mốc mẫu chitosan có nguồn gốc khác đợc xử lý chiếu xạ trạng thái khô trạng thái lỏng Hoạt tính đợc đánh giá so sánh vi sinh vật đợc nuôi cấy môi trờng rắn lỏng I phơng pháp nghiên cứu Các mẫu chitosan chủng vi sinh vật Ba loại chitosan có nguồn gốc khác nhng đợc tách chiết từ vỏ tôm Chúng có độ đề axêtyl hóa 90% nhng khác trọng lợng phân tử (TLPT) ( M v ): chitosan d¹ng bét ký hiƯu 9B cđa h ng KATOKICHI (NhËt B¶n) víi M v = 830.000 D, chitosan dạng vảy ký hiệu No.1 Phòng Công nghệ xạ Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt sản xuất với M v = 280.000 D, chitosan dạng vảy ký hiệu No.2 Phòng Polyme dợc phÈm - ViƯn Hãa häc cung cÊp víi M v = 552.000 D Các vi sinh vật đợc sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật cña chitosan gåm chñng nÊm mèc: Fusarium dimerum Penzig, Aspergillus fumigatus Fresenius Aspergillus japonicus Saito Chúng đ phân lập phân loại chủng từ xoài long nh đ nêu báo cáo trớc [1, 5] Xử lý chiếu xạ chitosan trạng thái khô lỏng Chitosan đợc xử lý tia gamma nguồn Co-60 Trung tâm chiếu xạ Hà Nội Viện nghiên cứu hóa học xạ Takasaki (Nhật Bản) Suất liều chiếu trung bình 1,5 kGy/h với mẫu xử lý Hà Nội 10 kGy/h với mẫu xử lý Takasaki Khoảng liều chiếu xạ áp dụng 50-500 kGy Khi chiếu xạ trạng thái lỏng, chitosan đợc pha với axít axêtic 5% thành dung dịch chitosan đặc 10% dạng nh bột nh o Các mẫu sau đợc đóng vào túi PE xử lý chiếu xạ liều từ 2-40 kGy Các mẫu lỏng đợc bảo quản lạnh sau chiếu xạ Phơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật đợc đánh giá thông qua nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chitosan Nuôi cấy môi trờng rắn đợc thực với môi trờng PDA (Potato Dextro Agar) sử dụng đĩa petri, ®Ĩ nu«i cÊy láng ® sư dơng m«i tr−êng PDB (Potato Dextrose Broth cđa h ng Difco) Quy tr×nh chi tiết đ đợc trình bày nghiên cứu trớc [1, 5], theo dung dịch gốc chitosan chiếu xạ 1% axít axêtic 0,5% đợc pha vào môi trờng để tạo nồng độ khác (pH=6) Các chủng thí nghiệm đợc cấy vào bình tam giác 500 ml có chứa 100 ml môi trờng PDB đ bổ sung chitosan nồng độ thích hợp Nuôi cấy lắc với tốc độ lắc 220 vòng/phút 28-30oC 96 II kết thảo luận So sánh hoạt tính kháng nấm mốc chitosan nuôi cấy môi trờng thạch đĩa môi trờng lỏng Nuôi cấy thạch đĩa sử dụng môi trờng PDA nu«i cÊy láng sư dơng m«i tr−êng PDB chøa chitosan loại nồng độ khác Chitosan No.2 loại có M v ban đầu 552.000 D, sau chiếu xạ liều 60 kGy giảm xuống 170.000 D Sù ph¸t triĨn cđa c¸c chđng nÊm mèc đợc xác định thông qua tăng sinh khối môi trờng lỏng hay đờng kính hệ sợi thạch đĩa Kết xác định MIC chủng nấm mốc đợc nêu bảng Sự phát triển hệ sợi nấm đợc minh hoạ hình Bảng cho thấy MIC môi trờng thạch đĩa lớn hàng chục lần so với MIC môi trờng lỏng Chẳng hạn, để ức chế F dimerum Penzig môi trờng lỏng cần nồng độ 200 mg/l, nuôi cấy môi trờng thạch đĩa yêu cầu nồng độ chitosan 3.400 mg/l Kết tơng tự hai chủng Aspergillus Nh vậy, so sánh hai m«i tr−êng víi nhau, chóng ta thÊy sư dơng môi trờng lỏng có độ nhạy cao môi trờng thạch đĩa Phơng pháp nuôi cấy lỏng đợc phổ biến để nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc đợc sử dụng Chúng cho môi trờng lỏng có độ nhạy cao tác động chitosan tới vi sinh vật dễ đợc thực Tác động chitosan đợc trì thờng xuyên nồng độ gần nh không thay đổi suốt thời gian nuôi cấy Đối với nuôi cấy thạch đĩa, hầu nh dịch chuyển chitosan toàn thể tích nuôi cấy Hệ sợi phát triển đến đâu có tác động phần chitosan nơi đó, lợng chitosan bị suy giảm tác động chitinaza hay chitosanaza vi sinh vật tiết để phân hủy chitosan Giá trị MIC thạch đĩa thu đợc nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu tác giả khác [8, 11] Vì phơng pháp nuôi cấy lỏng có độ nhạy cao hơn, nên khảo sát tiếp theo, sử dụng phơng pháp nuôi cấy để phục vụ cho đánh giá tác động tác nhân khác So sánh hoạt tính kháng nấm mốc mẫu chitosan có nguồn gốc trọng lợng phân tử (TLPT) ban đầu khác Để thực nghiên cứu so sánh hoạt tính kháng vi sinh vật, thí nghiệm chØ sư dơng mét chđng nÊm mèc F dimerum Penzig nuôi cấy môi trờng lỏng Kết xác định MIC mẫu chitosan nguyên dạng (không chiếu xạ) mẫu chitosan chiếu xạ đợc trình bày hình Giá trị MIC mẫu chitosan nguyên dạng No.1, No.2 9B lần lợt 280, 320 vµ 280 mg/l MIC cđa chitosan No.1 vµ 9B lµ b»ng (280 mg/l), chóng cã M v khác (280.000 830.000) Nh vậy, MIC mẫu chitosan nguyên dạng khác nhng khác biệt không lớn không phụ thuộc vào TLPT chúng Khi xử lý chiếu xạ khoảng liều 25-200 kGy MIC bị thay đổi, nhng thay đổi loại chitosan có chung quy luật, tạo cực tiểu MIC hay nói cách khác có cực đại hoạt tính kháng nấm xuất liều chiếu xạ định Điều đáng ý khác giá trị cực tiểu MIC loại chitosan khác nhau, cụ thể 250, 210 220 mg/l tơng ứng cho mẫu No.1, No.2 9B Các cực tiểu MIC xt hiƯn kho¶ng liỊu hÊp thơ 50-100 kGy, nh−ng liều cần thiết cho chúng xuất không giống nhau, phụ thuộc vào TLPT ban đầu Để có MIC cực tiĨu, d−êng nh− cã mét quy lt lµ nÕu mÉu chitosan có TLPT ban đầu nhỏ (chẳng hạn mẫu No.1) yêu cầu liều chiếu thấp (50 kGy), mẫu có TLPT ban đầu lớn (chẳng hạn mẫu No 9B) yêu cầu liều chiếu cao (tơng ứng 60 100 kGy) Bảng Nång ®é øc chÕ tèi thiĨu (MIC) cđa chitosan No.2 ( M v = 552.000) chiÕu x¹ ë tr¹ng thái khô đợc thử nghiệm nấm mốc nuôi cấy thạch đĩa môi trờng lỏng MIC mẫu chitosan No.2 (mg/l) Chủng nấm mốc Nuôi cấy thạch đĩa Nuôi cấy lỏng Không chiếu xạ Chiếu xạ 60 kGy Không chiếu xạ Chiếu xạ 60 kGy Fusarium dimerum Penzig 3.400 2.800 200 150 Aspergillus fumigatus Fresenius 3.000 2.500 150 120 Aspergillus japonicus Saito 3.000 2.500 120 80 kGy 60 kGy 100 kGy 1.500 2.500 3.000 mg/l H×nh Tác dụng chitosan đợc xử lý chiếu xạ trạng thái khô tới phát triển hệ sợi nấm F dimerum Penzig nuôi cấy thạch đĩa (trái) môi trờng lỏng (trên) 900 800 700 600 500 340 CTS No.1 320 300 CTS No.1 280 260 240 180 50 75 100 150 200 340 320 CTS No.2 300 280 260 240 220 200 180 25 50 60 75 100 150 200 340 320 CTS 9B Nång ®é øc chÕ tèi thiĨu = MIC (mg/l) Nång ®é øc chÕ tèi thiĨu = MIC (mg/l) 220 200 900 800 CTS No.2 700 600 500 400 10 CTS 9B 800 300 280 900 700 260 600 240 220 500 200 180 CTS 9B 50 100 150 200 LiỊu chiÕu x¹ (kGy) Hình Sự thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chitosan No.1 (hình trên), No.2 (hình giữa) chitosan 9B (hình dới) chiếu xạ trạng thái khô phát triển Fusarium dimerum Penzig Kết hình cho thấy tăng MIC xuất mẫu No.1 chiếu xạ liều lớn 150 kGy Hiệu ứng liên quan đến phân hủy mạch chitosan bị chiếu xạ liều cao, làm hình thành phân ®o¹n TLPT thÊp ë d¹ng mono- hay oligom cã ho¹t tÝnh kÝch thÝch vi sinh vËt ph¸t triĨn [9, 10, 12] Hiện tợng hiểu đợc chitosan từ lâu đ đợc biết đến nh chất tăng trởng thực vật Hiệu ứng nêu xuất mẫu No.1, mà không xuất mẫu No.2 vµ 9B 11 400 10 25 30 35 40 Liều chiếu xạ (kGy) Hình Sự thay ®ỉi nång ®é øc chÕ tèi thiĨu (MIC) cđa chitosan No.1 (hình trên), No.2 (hình giữa) chitosan 9B (hình dới) chiếu xạ trạng thái lỏng phát triển Fusarium dimerum Penzig đợc chiếu xạ ë liỊu trªn 150 kGy; cã thĨ mÉu No.1 từ lúc cha chiếu xạ đ có TLPT nhỏ so với hai mẫu lại So sánh hoạt tính kháng nấm mốc mẫu chitosan đợc chiếu xạ trạng thái khô trạng thái lỏng Các kết phần đ chiếu xạ trạng thái khô đ làm tăng hoạt tính kháng vi sinh vật chitosan Tuy nhiên, liều chiếu xạ cần thiết để tạo hiệu kháng vi sinh vật cao 50-100 kGy Đây liều cao, ảnh hởng đến hiệu kinh tÕ cho øng dơng cđa c«ng nghƯ vỊ sau Trong phần nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật mẫu chitosan chiếu xạ trạng thái lỏng so sánh hiệu với xử lý trạng thái khô đ thực phần Để thực khảo sát này, mẫu chitosan dạng bột nh o đợc tạo cách pha chitosan 10% axit axêtic 5% Sau đó, đem chiếu xạ liều 4-10 kGy mẫu chitosan No.1 No 2, 10-40 kGy mẫu 9B Kết xác định MIC thực Fusarium dimerum Penzig đợc nêu hình Sự thay đổi MIC theo liều chiếu xạ mẫu chitosan xử lý trạng thái lỏng xuất MIC cực tiểu Giá trị 540 mg/l đạt đợc chiếu xạ mẫu No.1 liều kGy, 500mg/l mẫu No.2 liều kGy 580 mg/l đạt đợc chiếu xạ mẫu 9B ë liỊu 25-30 kGy Râ rµng lµ MIC cùc tiĨu cđa ba mÉu chitosan chiÕu x¹ láng còng khác đợc xuất ỏ liều chiếu xạ khác Điều hoàn toàn tơng tự nh xử lý chiếu xạ trạng thái khô đ trình bày phần Nh vậy, xử lý chiếu xạ chitosan trạng thái bột nh o tạo thay đổi hoạt tính kháng vi sinh vật theo xu hớng nh xử lý trạng thái khô, tức tạo cực đại hoạt tính ®ã LiỊu chiÕu x¹ ®Ĩ t¹o cùc ®¹i ®ã xử lý trạng thái bột nh o thấp hẳn so với xử lý trạng thái khô (nhỏ 4-12 lần) Tuy nhiên, cách chuẩn bị trạng thái bột nh o với axit axêtic nồng độ cao lý cha xác định đợc đ làm giảm hoạt tính chitosan tới mức mà đạt đợc giá trị cực đại, hoạt tính nhỏ mẫu chitosan khô trớc chiếu xạ Trong thời gian tới, cần làm rõ nguyên nhân việc thay đổi hoạt tính kháng vi sinh vật chitosan chuyển sang trạng thái lỏng III kết luận Sử dụng phơng pháp nuôi cấy lỏng để đánh giá hoạt tính kháng nấm mốc chitosan có độ nhạy cao hàng chục lần so với phơng pháp nuôi cấy thạch đĩa Nồng độ ức chÕ tèi thiĨu (MIC) cđa c¸c mÉu chitosan cã ngn gốc khác Fusarium dimerum Penzig nằm khoảng 280-320 mg/l, không phụ thuộc vào nguồn gốc trọng lợng phân tử ban đầu Xử lý chiếu xạ chitosan trạng thái khô trạng thái lỏng tạo cực đại hoạt tính ức chế vi sinh vật Hơn nữa, chiếu xạ trạng thái lỏng liều chiếu xạ yêu cầu để tạo hoạt tính cực đại thấp hẳn so với chiếu xạ dạng khô Để tạo đợc hoạt tính kháng nấm mốc cực đại chitosan có TLPT ban đầu nhỏ cần liều chiếu xạ thấp hơn, mẫu chitosan có TLPT ban đầu lớn yêu cầu liều chiếu xạ cao Điều cho hai trờng hợp chiếu xạ chitosan trạng thái khô trạng thái lỏng tài liệu tham kh¶o Diep T B et al., 2001: Proceedings of the Takasaki Symposium on Radiation Processing of Natural Polymers, Takasaki, Japan, 23-24 Nov, 2000, JAERI-Conf 2001-005: 17-26 Edwind B., 1996: Edible Films and Coatings New York, John Wiley and Sons El Ghaouth A et al., Phytopathology, 82: 398-402 1992: Kendra D F., Hadwiger L A., 1994: Experimental Mycology, 8: 276-281 Nguyễn Duy Lâm cs., 2000: Di trun häc vµ øng dơng, 3: 21-25 Lam N D et al., 2002: Proceedings of the Takasaki Symposium on Radiation Processing of Natural Polymers in Asia, Takasaki, Japan, 1-2 Oct, 2001, JAERIConf 2002-003: 117-130 Lan K N et al., 2000: Japanese Food Irradiation, 35: 40-43 Li H., Yu T., 2000: J Sci of Food Agric., 81: 269-274 Matsuhashi S., Kume T., 1997: J Sci Food Agric., 73: 237-241 10 Tokura S et al., 1997: Macromolecular Symposia, 120: 1-9 11 Tsay C F., Lin W Y., Li C F., 1993: J of Biomass Energy Soc of China, 12: 74-88 11 12 Ulansky P., Rosiak J., 1992: Rad Phys Chem., 39: 53-57 COMPARATIVE STUDY ON THE ANTIFUNGAL ACTIVITY OF CHITOSAN OF VARIOUS ORIGINs TESTED IN DIFFERENT CONDITIONS OF RADIATION TREATMENT AND CULTURE MEDIUMS NGUYEN DUY LAM, TRAN BANG DIEP SUMMARY The antifungal activity of three chitosan samples varied in the molecular weights (280,000, 552,000 and 830,000 D) and in the origins of production (Vietnam and Japan) were studied against Fusarium dimerium Penzig The liquid and agar-plate mediums were formulated for evaluating the minimal inhibitory concentration (MIC) and the sensitivity of culture method For antifungal activity enhancement, chitosan samples were irradiated with gamma rays in solid and paste-like conditions Results showed that the MIC of chitosan samples tested in liquid medium was above ten times smaller than that of chitosan samples tested on agar-plates So the method using liquid medium had higher sensitivity than the agar-plate method MICs of native chitosan samples using liquid medium ranged from 280 to 320 mg/L were independent on their molecular weight (MW) The radiation treatment in solid and paste-like conditions had improved the chitosan antifungal activity In addition, there was a maximal activity appeared for each of chitosan samples that has been irradiated in any condition For enhancement of maximal antifungal activity, the solid-state radiation treatment required dose of 50-100 kGy, while a lower range of doses could be used in case of treatment in paste-like state Further more, the optimal radiation dose for maximal antifungal activity enhancement was recorded as the initial MW dependent: the higher MW of the initial chitosan required higher dose Ngµy nhËn bµi: 22-7-2002 12 ... thay đổi loại chitosan có chung quy luật, tạo cực tiểu MIC hay nói cách khác có cực đại hoạt tính kháng nấm xuất liều chiếu xạ định Điều đáng ý khác giá trị cực tiểu MIC loại chitosan khác nhau, ... thử nghiệm nấm mốc nuôi cấy thạch đĩa m«i tr−êng láng MIC cđa mÉu chitosan No.2 (mg/l) Chđng nấm mốc Nuôi cấy thạch đĩa Nuôi cấy lỏng Không chiếu xạ Chiếu xạ 60 kGy Không chiếu xạ Chiếu x¹ 60... xạ đ có TLPT nhỏ so với hai mẫu lại So sánh hoạt tính kháng nấm mốc mẫu chitosan đợc chiếu xạ trạng thái khô trạng thái lỏng Các kết phần đ chiếu xạ trạng thái khô đ làm tăng hoạt tính kháng