Bài viết công bố kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện pH và nhiệt độ môi trường lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm linh chi trong điều kiện nuôi cấy huyền phù.
Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA HỆ SI NẤM LINH CHI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Nguyễn Bá Tư(1) , Nguyễn Thanh Thuận(2), Tăng Công Trường(3) (1), (2) Trường Đại học Thủ Dầu Một, (3) Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Bình Dương TÓM TẮT Trong báo này, công bố kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện pH nhiệt độ môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi (Ganoderma lucidum) điều kiện nuôi cấy huyền phù Nhiệt độ tối ưu xác đònh khoảng 25-30 0C với pH 5.0 sau ngày 4.0 sau 14 ngày nuôi cấy Hàm lượng sinh khối thu tối đa sau ngày 450 mg/100ml sau 14 ngày 630 mg/100ml Sự thay đổi pH môi trường đáp ứng với sinh trưởng hệ sợi nấm Khi sợi nấm sinh trưởng pH môi trường giảm xuống ngược lại Giới thiệu Từ khóa: nấm linh chi, sinh trưởng, sinh khối * nghiên cứu Krcmar cs (1999), Zhang cs (2001), Qin cs (2008) cho thấy Linh chi (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) sử dụng để điều trò nhiều loại bệnh khác người (như bệnh viêm gan mãn tính, cao huyết áp, hoạt chất triterpens, polysacchrides protein có nguồn gốc từ thể nấm linh chi có mối tương quan dương tính với cholesteron hoá mạch máu, tiểu đường, tắc nghẽn động mạch vành, hen xuyễn, viêm loét dày ) nước phương Đông từ 2000 năm trước (Stamets, 1993) (Hobbs, 1995) [18] Hiện nay, việc nuôi đáp ứng miễn dòch thể Chẳng hạn, Tang trồng nấm linh chi để thu nhận sinh khối chiết suất sản phẩm thứ cấp hướng nghiên cứu mũi nhọn lónh vực y - sinh học [1], [2], [3] chế apoptosis gây nên nghỉ hoá chu kì Về thành phần hoá học hoạt protein quan trọng tham gia kiểm soát chất, đến nay, nghiên cứu xác đònh điểm giới hạn chu kì tế bào) Ngoài ra, nấm linh chi có khoảng 119 loại đáng kể đến Lz-8- loại protein chống triperpens nhiều loại polysaccharide có dò ứng phổ rộng điều hoà miễn dòch giá trò 1,3-β Dglucan (đang xem giới khoa học ý việc yếu tố có tác dụng chống ung thư) Các nghiên cứu sử dụng điều trò bệnh hiểm cs (2006) chứng minh axit ganoderic T (AG-T, loại lanostane triterpenoid) với hàm lượng 50 μ g ml-1 gây ức chế dòng tế bào ung thư phổi 95 D thông qua tế bào sau 4-8 giờ, nghiên cứu tác giả công bố AG-T có khả điều chỉnh mức biểu p53 Bax (hai 25 Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 nghèo Qin cs (2008) chứng minh với Bộ môn Sinh học Khoa Khoa học Tự Nhiên -1 hàm lượng 5μ g ml protein LZ-8 Trường Đại học Thủ Dầu Một Qui trình làm tế bào lách chuột tăng sinh tới 149% nuôi cấy tiến hành môi trường -1 với hàm lượng 10 μ g ml protein PDA có thay đổi chống phản ứng ngưng kết máu Sợi nấm nuôi môi trường thạch nghiêng chứa 200g/L dòch chiết khoai người [8], [9], [10], [15], [16] Về LZ-8, phương pháp tách chiết tây, 20g/L glucose, 1.5g/L MgSO4.7H2O, 2.5g/L KH2PO4, 10mg/L vitamin B1, 20g/L agar Chuyển sợi nấm sang đóa petri truyền thống gặp hạn chế đònh chủ yếu sử dụng thể làm nguyên liệu, môi trường PDA nuôi ngày 280C Chuyển sợi nấm sang bình tam giác (loại 250ml) chứa 50ml bao gồm 35g/L sucrose, 5g/L peptone, 2.5g/L dòch chiết nấm men, 0.5g/LmgSO4, 1g/L KH2PO4, 0.05g/L vitamin B1 Hiệu chỉnh độ pH mức 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 thông qua việc bổ sung HCl 1M NaOH 1M Các bình tam giác lắc máy lắc ổn nhiệt mức 250C, 300C, 350C, sau theo dõi sinh khối hệ sợi ngày 14 Ghi nhận tăng trưởng theo phương pháp sấy khô Yang cs (1998)[17] 2.2 Xử lí số liệu Các thí nghiệm bố trí lặp lại lần, sau thu kết xử lí phần mềm phân tích ANOVA Kết thảo luận Qua trình nghiên cứu thu số kết sau: 3.1 Ảnh hưởng pH ban đầu Hệ sợi loài nấm sợi nói chung sinh trưởng dải pH rộng Các nghiên cứu nấm lớn cho thấy dải pH phù hợp tương đối khoảng 5-7 Tuy nhiên, pH thay đổi lớn trình sinh trưởng hệ sợi, đặc biệt trường hợp nuôi cấy huyền phù Trong nghiên cứu này, xác đònh pH tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm chẳng hạn Kino cs (1990) sử dụng 340 gram thể thu 10 mg LZ-8, hiệu suất thu nhận chưa đáp ứng nhu cầu thực tiễn giá thành cao [11] Các nghiên cứu Zhou (2002) Koshsuke K (2004) phát thấy LZ-8 có giai đoạn hệ sợi thể quả, điều tiến hành nuôi cấy tách chiết LZ-8 giai đoạn huyền phù tế bào khắc phục hạn chế phương pháp truyền thống, rút ngắn thời gian qui trình sản xuất [11] Như vậy, LZ-8 protein có vai trò quan trọng việc điều hòa hệ thống miễn dòch kó thuật liên quan đến qui trình li trích giai đoạn chưa hoàn thiện; đặc biệt ứng dụng kó thuật nuôi cấy huyền phù thu nhận LZ-8 thông tin đề cập Nghiên cứu nhằm xác đònh điều kiện pH nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi thông qua việc khảo sát ảnh hưởng chúng môi trường huyền phù Kết thu góp phần tìm môi trường nuôi cấy phù hợp cho phát triển hệ sợi hướng tới thu nhận hoạt chất LZ-8 Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu môi trường Chủng nấm linh chi (Ganoderma lucidum) lưu trữ Phòng Thí nghiệm 26 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 Linh chi môi trường PDA thông qua việc khảo sát dải pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 để thu sinh khối sau ngày 14 ngày Một dải hẹp nhiệt độ thử nghiệm khả sinh trưởng dòch huyền phù pH 5.0: Với nhiệt độ 250C: sinh khối linh chi thu lớn 330mg/100ml 550mg/100ml (hình 1) Với nhiệt độ 300C: sinh khối linh chi thu lớn 450mg/100ml 630mg/100ml (hình 2) Với nhiệt độ 350C: sinh khối linh chi thu lớn 230mg/100ml 400mg/100ml (hình 3) Hình 1: Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi môi trường lỏng nhiệt độ 250C Hình 2: Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi môi trường lỏng nhiệt độ 300C Hình 3: Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi môi trường lỏng nhiệt độ 350C Như vậy, nhiệt độ khác nhau, khối thu ít, pH môi trường tăng lên pH ban đầu ảnh hưởng trực tiếp đến sinh khối hệ sợi đạt cực đại pH 5.0 tăng trưởng sinh khối hệ sợi nấm dòch Tuy nhiên, theo nghiên cứu Yang huyền phù tế bào pH ban đầu thấp sinh cs (1998), pH tối ưu để thu sinh khối hệ 27 Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 sợi nấm linh chi 4.0 môi trường cho thấy pH nhiệt Glucose-NH4Cl [17] Còn theo nghiên cứu độ môi trường khác ảnh hưởng trực Hsieh cs (2005) môi trường tiếp đến khả tăng trưởng hệ sợi Sự ảnh hưởng dải nhiệt độ lên tổng hợp cho thấy sinh khối linh chi tối ưu sinh khối linh chi pH 5.0 thu pH 4.5 5.0 Một nghiên cứu khác Jelena Vukojevic Kết hình cho thấy (2006) [18] cho thấy pH tối ưu thu nhận pH ban đầu giảm từ 5.0 xuống 4.3; sinh khối Linh chiđỏ 4.5-5.0, nhiệt độ 22 C 3.8 4.7 sinh khối môi trường tăng môi trường tổng hợp (Ko cs, 2001) lên Sự sinh trưởng hệ sợi tăng dần Điều cho thấy pH tối ưu cho việc thu nhiệt độ môi trường tăng lên từ 250C sinh khối hệ sợi nấm Linh chi phụ thuộc lên 300C với sinh khối thu vào môi trường nuôi cấy 550 mg/100ml 630 mg/100ml sau 14 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ ngày nuôi cấy, nhiệt độ vượt biến thiên pH 30 C Linh chi tăng trưởng chậm đạt sinh khối thấp 350C 400 Nhiệt độ khác có ảnh hưởng khác lên khả sinh trưởng hệ mg/100ml sợi nấm Kết hình Hình 4: Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi môi trường lỏng pH 5.0 sinh trưởng hệ sợi nấm Tại pH nhiệt độ môi trường khác ảnh hưởng trực tiếp đến khả tăng trưởng hệ sợi Nhiệt độ thuận lợi cho hệ sợi phát triển khoảng 300C, ngưỡng tốc độ sinh trưởng hệ sợi giảm nhanh chóng pH môi trường có biến động mạnh trình sinh trưởng hệ sợi nấm Sự ảnh hưởng dải nhiệt độ lên sinh khối linh chi pH 6.0 Tại pH 6.0 kết thu tương tự khảo sát pH 5.0 Ngoài pH môi trường tăng trưởng sinh khối có mối tương quan nghòch, kết hình cho thấy sinh khối hệ sợi tăng dần nhiệt độ môi trường tăng từ 250C (đạt 320mg/100ml) đến 300C (cao 470 mg/100ml) sau giảm nhanh 350C (đạt Như vậy, sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi phụ thuộc vaøo nhiều yếu tố: chủng nấm, thành phần môi trường, điều kiện lí, hoá khác Để thu kết phổ 370 mg/100 ml) (hình 5) Từ kết cho thấy nhiệt độ khác có ảnh hưởng khác l ên khả 28 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 Hình 5: Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi môi trường lỏng pH 6.0 quát hơn, cần tiến hành nghiên cứu ảnh nhiệt độ lên khả sinh trưởng hệ hưởng yếu tố khác (như độ thoáng bề sợi nấm linh chi dich huyền phù cho mặt, tốc độ lắc….) lên sinh trưởng hệ sợi kết quả: nấm linh chi môi trường lỏng khác - Linh chi có khả sinh trưởng Trên sở tiến hành khảo sát mối dải pH từ 4-7, nhiệt độ từ 25-35 0C tương quan hoạt chất li trích Trong kết này, pH nhiệt độ phù hợp (polysacchride, protein, triterpenoid ) với cho phép thu sinh khối hệ sợi nấm cao yếu tố môi trường nhằm tiến tới xây dựng quy 5.0 300C với khối lượng trình nuôi cấy cho chất riêng biệt 450mg/100ml 630mg/100ml pH 5.0 Kết luận sau ngày 14 ngày nuôi cấy Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện - pH môi trường có biến động pH nhiệt độ lên sinh trưởng hệ mạnh trình sinh trưởng hệ sợi, sợi nấm Linh chi điều kiện nuôi cấy sinh khối tăng pH giảm huyền phù sở cho việc xác đònh ngược lại, nhiên pH thấp khả điều kiện lí hoá tối ưu thu nhận sinh khối sinh trưởng lại chậm lại Tại pH hệ sợi nấm môi trường lỏng đồng thời khảo sát cho thấy sinh khối hệ sợi nấm sở cho việc thực nghiên tăng lên nhiệt độ tăng từ 250C lên 300C cứu thu nhận protein LZ-8 nhiệt độ vượt ngưỡng Khảo sát ảnh hưởng pH sinh khối giảm nhanh chóng * EFECT OF TEMPERATURE AND pH ON THE MYCELIAL GROWTH OF GANODERMA LUCIDUM IN SUBMERGED FLASK CULTURES Nguyen Ba Tu(1), Nguyen Thanh Thuan(2), Tang Cong Truong(3) (1), (2) Thu Dau Mot University, (3) Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Bình Dương ABSTRACT In this paper the effects of environmental condition on the mycelial growth of Ganoderma lucidum were investigated in shake flask cultures The optimal temperature and pH were found to be around 25-30 0C with pH suitable were 5.0 after days and 4.0 after 14 days cultured The maximum mycelial concentration reached to around 450 mg/100ml and 630 mg/100ml after days and 14 days cultured, respectivly The pH of medium 29 Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 changed correspondingly with the changes in the growth of mycelium As mycelial growth incereased, the pH of medium decreased and reverse Key words: lingzhi (ganoderma), growth, biomass TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ngô Anh (2007), Giáo trình Nấm học, NXB Đại học Huế [2] Nguyễn Thò Chính (1999), Nghiên cứu công nghệ sản xuất sinh khối số hoạt tính sinh học linh chi (Ganoderma lucidum), Tạp chí Sinh học, số 21, tr 132-136 [3] Phan Huy Dục (1992), Nấm linh chi - nguồn dược liệu quý cần bảo vệ nuôi trồng, Tạp chí Dược học, số [4] Nguyễn Anh Dũng (1995), Góp phần vào nghiên cứu thành tố hóa học Ganoderma lucidum, Tạp chí Dược học, 2, tr 14-16 [5] Ngô Kiến Đức cs (2009), Nghiên cứu tác dụng phòng ngừa loạn sản tế bào gan chống suy tủy linh chi, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh [6] Tạ Bích Thuận cs (2007), Tìm hiểu enzym bảo vệ ôxi hoá nấm linh chi (Ganoderma lucidum), Tạp chí khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [7] Chang M., et al (2005), Optimization of the medium composition for the submerged culture of Ganoderma lucidum by Taguchi array design and steepest ascent method, National Taiwan Ocean University, Science Direct [8] Gao Y at al (2002), The immunomodulating effects of Ganoderma lucidum (Curt Fr.) P Karst (Ling Zhi, reishi mushroom) (Aphyllophoromycetideae), Int J Med Mushrooms [9] Liang, et al (2009), Ganoderma lucidum immunomodulatory protein (Lz-8) expressed in Pichia pastoris and the identification of immunocompetence, Department of Cytobiology, Institute of Frontier Medical Science, Jilin University, Changchun, China [10] Habijani J., at al (2001), Immunostimulatory Effects of Fungal Polysaccharides from Ganoderma lucidum Submerged Biomass Cultivation, University of Ljubljana, Slovenia [11] Koshsuke K, et al (2004), Isolation and Characterization of a New Immunomodulatory Protein, Ling Zhi-8 (LZ- 8), from Ganoderma lucidum, The journal of biological chemistry, Odawara, Japan [12] Lee, et al (2006), Factors influencing the production of endopolysacchride from Ganoderma applanatum, The journal of Divition of Biotechnology, Korea Forest Research Institute [13] Lee et al (2006), Factors influencing the production of endopolysaccharide and exopolysaccharide from Ganodermaapplanatum, Korea Forest Research Institute, The journal of Science Direct [14] Naszeen Z et al (2005), Study of different growth parameters in Ganoderma lucidum, Biotechnology and food research Center, PCSIR labs, USA [15] Qin et al (2008), Functional expression of LZ-8, a fungal immunomodulatory protein from Ganoderma lucidum in Pichia pastoris, J Gen Appl Microbiol [16] Tang et al (2006), Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lung cancer cells, The journal of ScienceDirect: life Science [17] Yang et al., 1998 Effect of cultivating condititons on the mycelial growth of Ganoderma lucidum in submerged flask cultures The journal of Bioprocess Engineering [18] Vukojevic et al (2006), Effect of medium pH and cultivation period on mycelial biomass, polysaccharide, and ligninolytic enzyme production by Ganoderma lucidum from montenegro, The journal of BioScience 30 ... Hình 1: Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi môi trường lỏng nhiệt độ 250C Hình 2: Ảnh hưởng pH môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi môi trường lỏng nhiệt độ 300C... 4: Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi môi trường lỏng pH 5.0 sinh trưởng hệ sợi nấm Tại pH nhiệt độ môi trường khác ảnh hưởng trực tiếp đến khả tăng trưởng hệ sợi. .. điều kiện pH nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm linh chi thông qua việc khảo sát ảnh hưởng chúng môi trường huyền ph Kết thu góp ph n tìm môi trường nuôi cấy ph hợp cho ph t triển hệ