Tách chiết và phân tích hàm lượng Anthocyanin từ các mẫu thực vật khác nhau

Bài viết trình bày một số dung môi tách chiết Anthocyanin và kết quả xác định hàm lượng Anthocyanin trong một số nguyên liệu tươi bằng phương pháp pH vi sai, làm cơ sở cho việc lựa chọn dung môi và nguyên liệu giàu Anthocyanin để khai thác sử dụng.

33(4): 79-85 12-2011 Tạp chí Sinh học TáCH CHIếT Và PHÂN TíCH HàM LƯợNG ANTHOCYANIN Từ CáC MẫU THựC VậT KHáC NHAU Phạm Thị Thanh Nhàn Trờng đại học S phạm, Đại học Thái Nguyên Nguyễn Hữu Cờng, Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh học Các loại sắc tố ë thùc vËt cã vai trß rÊt quan träng trình quang hợp Chúng bao gồm: sắc tố lục (chlorophyll), sắc tố vàng (carotenoid), sắc tố thực vật bậc thấp (phycobilin) sắc tố dịch bào (anthocyanin) Trên sở hàm lợng dạng sắc tố lá, ngời ta đánh giá khả quang hợp cđa thùc vËt vµ xÕp thùc vËt thc nhãm −a s¸ng hay −a bãng, thùc vËt C3 hay C4 Anthocyanin đợc tìm thấy dịch không bào tế bào biểu bì, mô mạch dẫn [1, 4, 8, 10] Chúng xuất rễ, trụ dới mầm, bao mầm, thân, củ, tạo màu cho bề mặt, viền sọc, hay vết đốm Anthocyanin glucozit, thuéc hä flavonoid, gèc ®−êng glucose, glactose kết hợp với gốc aglucon có màu (anthocyanidin) Aglucon chúng có cấu trúc đợc mô tả hình Các gốc đờng thờng đợc gắn vào vị trí 5, gắn vào vị trí Các aglycon anthocyanin khác nhóm gắn vào vị trí R1 R2, thờng H, OH hc OCH3 [2] R1 OH B O+ OH A R2 đỏ, hạt ngô đen Gần đây, chức anthocyanin đợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [6, 7, 12, 14] Các chức anthocyanin bao gồm: bảo vệ lục lạp khỏi tác động bất lợi ánh sáng, hạn chế xạ tia UV-B, hoạt tính chống oxi hoá chống viêm Ngoài ra, chúng tạo điều kiện cho thụ phấn, phát tán hạt nhờ màu sắc sặc sỡ cánh hoa Sinh tổng hợp anthocyanin đợc tăng cờng để đáp ứng với stress môi trờng: hạn, ánh sáng mạnh, UV-B, nhiệt độ cao, thiếu nitơ photpho, nhiễm nấm vi khuẩn, tổn thơng, côn trùng, ô nhiễm [9, 15] Với khả chống oxy hóa cao, anthocyanin đợc sử dụng để chống l o hóa, chống oxy hóa sản phẩm thực phẩm, hạn chế suy giảm sức đề kháng Điều mở triển vọng việc sản xuất dợc phẩm chức chữa bệnh có hiệu Việt Nam, anthocyanin đợc tách chiết từ nguyên liệu thực vật sẵn có Bài báo trình bày số dung môi tách chiết anthocyanin kết xác định hàm lợng anthocyanin số nguyên liệu tơi phơng pháp pH vi sai, làm sở cho việc lựa chọn dung môi nguyên liệu giàu anthocyanin để khai thác sử dụng OH OH Hình Cấu trúc aglycon anthocyanin Anthocyanin chất màu thiên nhiên đợc sử dụng an toàn thực phẩm dợc phẩm với giá thành cao (khoảng 1000 USD/100mg) Chúng tồn hầu hết thực vật bậc cao có nhiều rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím nh: nho, dâu, tía tô, gạo i PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Các loại rau, củ, đợc thu thập Hà Nội (tháng 12 năm 2009) Hóa chất Chúng sử dụng hãa chÊt nh−: ethanol, acetone, chloroform, methanol, KCl 79 (dung dịch đệm pH 1,0), K2S2O5, CH3COONa (dung dịch đệm pH 4,5) h ng Fluka; HCl đặc Trung Quốc Phơng pháp a Tách chiết anthocyanin Anthocyanin đợc tách chiết theo quy trình sau [5, 11]: Nguyên liệu tơi thu thập đợc rửa sạch, để hết nớc nhiệt độ phòng, mẫu thí nghiệm cân lấy 10 g (mỗi loại nguyên liệu lấy mẫu); nghiền nhỏ mẫu thành bột mịn nitơ lỏng, bổ sung 20 ml dung môi có HCl, để mẫu 40C 24 h; lọc chân không thu lấy dịch (lặp lại lần), bổ sung chloroform (theo tỉ lệ 1v:1v) thu dịch màu phía Đo phổ hấp thụ mật độ quang b Xác định hàm lợng anthocyanin theo phơng pháp pH vi sai [3] Dựa nguyên tắc: chất màu anthocyanin thay đổi theo pH Tại pH 1,0 anthocyanin tồn dạng oxonium flavium có độ hấp thụ cực đại, pH 4,5 chúng lại dạng carbinol không màu Đo mật độ quang mẫu pH 1,0 pH 4,5 bớc sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ bớc sóng 700 nm Dựa công thức định luật LambertBeer: I (1) lg = ì l ì C I Trong đó: lg I0 đặc trng cho mức độ ánh I sáng yếu dần qua dung dịch (mật độ quang, A); I Cờng độ ánh sáng sau qua dung dịch; I0 Cờng độ ánh sáng chiếu vào dung dịch; C Nồng độ chất nghiên cứu, mol/l; l Chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng qua; Hệ số hấp thụ phân tử, mol-1 cm-1 Hàm lợng sắc tố anthocyanin đơn tử theo công thức: A ì M × HSPL × V (2) a= ε ×l Trong ®ã: A MËt ®é quang, A = (Aλmax, pH=1,0 - A700nm, pH=1,0) - (Aλmax, pH=4,5 - A700nm, pH=4,5); Aλmax, A700nm Độ hấp thụ bớc sóng cực đại 700 nm pH 1,0 pH 4,5; a Lợng anthocyanin (mg/l); M Khối lợng phân tử anthocyanin (g/mol); HSPL HƯ sè pha lo ng; 80 V ThĨ tÝch dÞch chiÕt (l); l ChiỊu dµy cuvet (cm); ε = 26900 Từ tính đợc phần trăm hàm lợng anthocyanin toàn phần: %anthocyanin = a ì 100% (3) m ì (100 - w) ì 10 -2 Trong đó: a Lợng anthocyanin tính đợc theo công thức (2); m Khối lợng nguyên liệu ban đầu (g); w Độ ẩm nguyên liệu (%.) Dịch chiết anthocyanin đợc xử lý nớc cất thay cho đệm pH trên, đem đo bớc sóng tơng ứng xác định mật độ sắc màu theo công thức [11]: M = [(A 420nm - A 700nm ) + (A λmax − A700 nm )] ì HSPL (4) Dịch chiết anthocyanin lại đợc xử lý dung dịch K2S2O5 20% thay cho đệm pH, đem đo bớc sóng tơng ứng tính tỉ lệ phần trăm màu đa tử theo công thức [11]: D = [(A 420nm - A 700nm ) + (A max A700 nm )] ì HSPL % Màu đa tử = D ì 100% M (5) c Phơng pháp tính toán số liệu Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê, mẫu nghiên cứu đợc nhắc lại ba lần Các số liệu đợc xử lý máy vi tính chơng trình Excel theo Chu Hoàng Mậu (2008) [13] ii KếT QUả Và THảO LUậN Phổ hấp thụ anthocyanin số rau, củ, Nguyên liệu tơi thu thập đợc xử lý theo quy trình mục 3.a sử dụng loại dung môi chiết anthocyanin khác nhau: ethanol: dung dÞch HCl 1%= 1:1 (v/v), acetone cã 0,01% HCl (v/v), methanol cã 0,1% HCl (v/v), methanol cã 0,01% HCl (v/v) [2, 5, 11] Sau lÊy 0,5 ml dÞch chiÕt pha lo ng víi ml dung dịch đệm pH 1,0, quét phổ hấp thụ bớc sóng từ 250 nm đến 750 nm máy quang phổ Kết đợc minh họa hình Kết cho thấy, phổ hấp thụ dịch chiết từ mẫu nghiên cứu nằm vùng phổ hÊp thơ cđa c¸c anthocyanin (510-540 nm), b−íc sãng hÊp thụ cực đại dịch chiết anthocyanin từ tía tô khoảng 520 nm- 524 nm, dâu ta 513-526 nm, vỏ nho 519-523,5 nm Trong kết công bố trớc tía tô 524 nm, dâu 513,5 nm, vỏ nho 523,5 nm [2] Điều đ chứng tỏ độ tin cậy phơng pháp thử nghiệm dung môi tách chiết cao 3,449 Abs Abs 4,360 2,200 1,568 4 -0,312 250 0,041 500 nm 4,360 750 A 250 500 nm 750 B 4,302 Abs Abs 2,200 2,0 1,8 1,6 1,971 0,041 250 750 500 nm -0,361 C 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 260 750 D 500 nm 250 Abs pH 1,0 pH 4,5 360 460 nm 560 760 660 E Hình Phổ hấp thụ dịch chiết anthocyanin từ số nguyên liệu tơi pH 1,0 A thân ngô non; B rau dền; C tía tô; D Lá mơ; E Phổ anthocyanin chuẩn pH 1,0 vµ pH 4,5 (theo M Mãnica Giusti vµ Ronald E Wrolstad, 2001); dung môi ethanol: dung dịch HCl 1% (1v: 1v); dung m«i acetone cã 0,01% HCl (v/v); dung m«i methanol cã 0,1% HCl (v/v); dung môi methanol có 0,01% HCl (v/v) Bảng Giá trị mật độ quang dịch chiết anthocyanin từ bốn dung môi nghiên cứu S TT Mẫu Thân loài ngô (Zea mays L.) Lá chua, bụp dấm max (nm) Ethanol Giá trị mật độ quang A (Abs.) Methanol Methanol Acetone HCl 1% 0,01% HCl 0,1% HCl 0,01% HCl 512 0,23 0,29 0,27 0,25 521 1,21 1,27 1,26 1,25 81 10 11 12 (Hibiscus sabdariffa L.) Hoa cđa loµi chi tiêu (Musa paradisiaca L.) Lá loài hoa sói (Chloranthus spicatus (Thunb.) Makino) Lá loài huyết dụ (Cordyline fruticosa (L.) Goepp.) Quả loài dâu tằm (Morus alba L.) Lá loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) Củ cđa loµi khoai lang tÝm (Ipomoea batatas (L.) Poir.) Vá loài nho (Vitis vinifera L.) Lá loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) Merr.) Củ loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban) Lá loài rau dÒn tÝa (Amaranthus tricolor L.) 516 0,10 0,12 0,10 0,10 522 1,08 1,18 1,16 1,06 519 1,57 1,65 1,59 1,50 513- 526 2,43 2,55 2,43 2,34 520- 524 1,81 2,32 2,21 2,02 520 2,08 2,12 2,02 2,02 519523,5 2,06 2,10 2,04 2,02 522 0,59 0,62 0,51 0,44 511 1,49 1,86 1,75 1,55 540 1,04 1,06 1,02 1,00 So s¸nh phỉ hấp thụ giá trị mật độ quang dịch chiết anthocyanin thu đợc từ bốn loại dung môi cho thÊy, sư dơng dung m«i acetone cã 0,01% HCl (v/v) thu đợc lợng anthocyanin tối u cả, phổ hấp thụ giống với phổ chuẩn [11] Kết tơng tự đối tợng lại (bảng 1) Hàm lợng anthocyanin số rau, củ, Độ hấp thụ anthocyanin liên quan mật thiết đến màu sắc, nồng độ chúng phụ thuộc vào pH dung dịch (thờng pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn) Sau tách chiết anthocyanin dung môi acetone, tiến hành đo mật độ quang mẫu nghiên cứu bớc sóng hấp thụ cực đại, 420 nm 700 nm, pH 1,0 pH 4,5, từ áp dụng công thức (2), (3), (4) (5) tính đợc hàm lợng anthocyanin loại nguyên liệu Kết đợc thể bảng Bảng Hàm lợng anthocyanin mẫu nghiên cứu S TT 82 Mẫu Thân loài ngô (Zea mays L.) Lá chua, bơp dÊm (Hibiscus sabdariffa L.) Hoa cđa loµi chi tiêu (Musa paradisiaca L.) Hàm lợng toàn phần (%) Sắc tố anthocyanin đơn tử (mg/l) Màu đa tử (%) 0,59 19,57 31,42 1,49 84,63 23,30 0,34 7,88 35,21 10 11 12 Lá loài hoa sói (Chloranthus spicatus (Thunb.) Makino) Lá loài huyết dụ (Cordyline fruticosa (L.) Goepp.) Quả loài dâu tằm (Morus alba L.) Lá loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) Cđ cđa loµi khoai lang tÝm (Ipomoea batatas (L.) Poir.) Vỏ loài nho (Vitis vinifera L.) Lá loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) Merr.) Củ loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban) Lá loài rau dền tía (Amaranthus tricolor L.) Kết bảng cho thấy, hàm lợng anthocyanin toàn phần mẫu nghiên cứu dao động khoảng từ 0,34 % đến 2,04% Đáng ý hàm lợng anthocyanin tía tô 1,72%, dâu ta 1,75%, vỏ nho 1,27%, cao kết tác giả Huỳnh Thị Kim Cúc (2007) (0,397%, 1,188%, 0,564%) [2] Sự khác mẫu đợc lấy địa 0,56 78,89 23,66 1,28 110,28 22,12 1,75 170,26 17,73 1,72 154,77 19,97 0,46 141,67 21,95 1,27 140,20 22,06 1,05 41,28 25,88 2,04 124,37 21,87 1,74 70,54 24,02 ®iĨm thời gian khác nhau, nhng so sánh hàm lợng anthocyanin tách đợc từ dung môi acetone cho kết cao dung môi khác, đặc biệt thân ngô Khi phân tích số liệu sắc tố anthocyanin đơn tử màu đa tử cho thấy, giá trị hai đại lợng tỉ lệ nghịch với Kết đợc minh họa h×nh (mg/l) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 (%) 40 35 30 25 20 15 S?ctốt?anthocyanin anthocyanin ủn t? Sắc đơn tử (mg/l) (mg/l) Mu ®a đatưt?(%) (%) Mµu 10 5 10 11 12 Nguyªn liệu thực vật Hình Đồ thị tơng quan lợng sắc tố anthocyanin đơn tử tỉ lệ phần trăm màu đa tử Ghi chú: Thân loài ngô; Lá chua, bụp dấm; Hoa loài chuối tiêu; Lá loài hoa sói; Lá loài huyết dụ; Quả loài dâu tằm; Lá loài tía tô; Củ loài khoai lang tím; Vỏ loài nho; 10 Lá loài mơ leo; 11 Củ loài sâm đại hành; 12 Lá loài rau dền tía iii KếT LUậN Dịch chiết anthocyanin đợc tách từ dung môi acetone cã 0,01% HCl (v/v) cã phỉ hÊp thơ vµ hàm lợng tối u so với dung môi lại (ethanol: dung dịch HCl 1% (1v: 1v), methanol cã 0,1% HCl (v/v), methanol cã 0,01% HCl (v/v)) 83 Dịch anthocyanin từ nguyên liệu khác có phổ hấp thụ cực đại bớc sóng từ 511-540 nm Giá trị hấp thụ sắc tố anthocyanin đơn tử tỉ lệ phần trăm màu đa tử có mối tơng quan nghịch Hàm lợng anthocyanin toàn phần thân ngô non 0,59%, chua 1,49%, hoa chuối 0,34%, hoa sói 0,56%, huyết dụ 1,28%, dâu ta 1,75%, tía tô 1,72%, củ khoai lang tím 0,46%, vỏ nho 1,27%, mơ 1,05%, củ sâm đại hành 2,04%, rau dền tía 1,74% Lời cảm ơn: Công trình hoàn thành đợc hỗ trợ từ kinh phí đề tài nghiên cứu khoa học cấp B2009- TN04- 25, phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam TàI LIệU THAM KHảO Chalker Scott L., 1999: Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses Photobiol, 70: 1-9 Huúnh ThÞ Kim Cúc, Nguyễn Thị Lan, Châu Thể Liễu Trang, 2005: Tối u hóa điều kiện chiết tách chất màu anthocyanin từ bắp cải tím môi trờng trung tính Tạp chí Khoa học Công nghệ, trờng đại học Đà Nẵng, 4(12): 44-50 Huỳnh Thị Kim Cúc, 2007: Nghiên cứu thu nhận ứng dụng anthocyanin công nghệ thực phẩm Luận án Tiến sĩ, trờng đại học Đà Nẵng David R., Kristen Bell, Gochenaur, 2006: Direct vasoactive and vasoprotective properties of anthocyanin-rich extracts Apllied Physiology, 00626(4): 1164-1170 Fuleki T., Francis F J., 1968: Quantitative Methods for Anthocyanins Determination of total anthocyanin and degradation Index for Cranberry Juice 84 J Food Science, 33: 78-83 Gould K., 2004: Nature’s Swiss army knife The diverse protective roles of anthocyanins in leaves J Biomed Biotech, 5: 314-320 Gould K S., Lister C., 2006: Flavonoid functions in plants Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and Applications CRC Press, Boca Raton: 397-441 Hooijmaijers C A M., Gould K S., 2007: Photoprotective pigments in red and green gametophytes of two New Zealand liverworts J Bot, 45: 451-461 Kevin Gould, Kevin Davies, Chris Winefield, 2009: Anthocyanins: Biosynthesis, Functions, and Applications Qc Springer Science+Business Media, LLC, New York, NY 10013, USA 10 Lee D W., Collins T M., 2001: Phylogenetic and ontogenetic influences on the distribution of anthocyanins and betacyanins in leaves of tropical plants J Plant Sci., 162: 1141-1153 11 Luis E., Rodriguez-Saona, Ronald E., Wrolstad, 2001: Current Protocols in Food Analytical Chemistry Copyright  2001 by John Wiley & Sons, Inc 12 Manetas Y., 2006: Why some leaves are anthocyanic, and why most anthocyanic leaves are red Flora, 201: 163-177 13 Chu Hoµng Mậu, 2008: Phơng pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng Nxb Đại học Thái Nguyên 14 Stintzing F C., Carle R., 2004: Functional properties of anthocyanins and betalains in plants, food, and in human nutrition Trends Food Sci Technol, 15(1): 19-38 15 Winkel-Shirley B., 2002: Biosynthesis of flavonoids and effects of stress Curr Opin Plant Biol., 5: 218-223 EXTRACTING AND ANALYSISING ANTHOCYANIN CONTENT FROM DIFFERENT PLANTS Pham Thi Thanh Nhan, Nguyen Huu Cuong, Le Tran Binh SUMMARY Anthocyanins are natural pigments used safely in foods and functional food They play the important role in photoprotection, antioxidant activity, biological defense and also in symbiotic functions between microbes and plant cells In addition, they are attractants for pollinating via flower color and dispersing seeds via brightly colored fruit This article presents some anthocyanin extraction buffers and the result of determination of anthocyanin content in different plants by pH-differential method Using the buffer containing acetone and 0.01% HCl to extract anthocyanin from different materials was more effective than three other types of buffers (ethanol: distilled water with HCl 1% (1v: 1v), methanol with 0.1% HCl (v/v), methanol with 0.01% HCl (v/v)) and the absorption spectrum of anthocyanin diluted extract was similar to that of standard anthocyanin Maximum absorption spectrum of the different diluted extracts was ranged from 511nm to 540nm In addition, the nonomeric anthocyanin pigment is in inverse proportion to the percent of polymeric color The content of anthocyanin was 0.59% in young stem of Zea mays L., 1.49% in leaf of Hibiscus sabdariffa L., 0.34% in flower of Musa paradisiaca L., 0.56% in leaf of Chloranthus spicatus (Thunb.) Makin, 1.28% in leaf of Cordyline fruticosa (L.) Goepp., 1.75% in fruits of Morus alba L., 1.72% in leaf of Perilla frutescens (L.) Britt., 0.46% in tuber of Ipomoea batatas (L.) Poir., 1.27% in fruit skin of Vitis vinifera L., 1.05% in leaf of Paederia scandens (Lour.) Merr., 2.04% in bulbus of Eleutherine bulbosa (Mill.) Urban and 1.74% in leaf of Amaranthus tricolor L Key word: Acetone, Anthocyanin, maize, absorption spectrum, pH-differential method Ngµy nhËn bµi: 23-6-2011 85 ... 24,02 điểm thời gian khác nhau, nhng so sánh hàm lợng anthocyanin tách đợc từ dung môi acetone cho kết cao dung môi khác, đặc biệt thân ngô Khi phân tích số liệu sắc tố anthocyanin đơn tử màu... a Lợng anthocyanin (mg/l); M Khối lợng phân tử anthocyanin (g/mol); HSPL HƯ sè pha lo ng; 80 V ThĨ tÝch dịch chiết (l); l Chiều dày cuvet (cm); = 26900 Từ tính đợc phần trăm hàm lợng anthocyanin. .. Trung Quốc Phơng pháp a Tách chiết anthocyanin Anthocyanin đợc tách chiết theo quy trình sau [5, 11]: Nguyên liệu tơi thu thập đợc rửa sạch, để hết nớc nhiệt độ phòng, mẫu thí nghiệm cân lấy 10