Nghiên cứu này được tiến hành nhằm khảo sát khả năng tái sinh cây Lan Hài Đốm thu thập ở Thái Nguyên từ chồi non và hạt sau thụ phấn khoảng 170-200 ngày.
ISSN: 1859-2171 e-ISSN: 2615-9562 TNU Journal of Science and Technology 207(14): 113 - 119 TÁI SINH LAN HÀI ĐỐM PAPHIOPEDILUM CONCOLOR TỪ CHỒI NON VÀ HẠT Vũ Thị Lan1*, Trần Thị Thu Trang2 Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên Trường THCS Thạch Thất, Hà Nội TĨM TẮT Lan Hài Đốm lồi đặc hữu Việt Nam Hoa lan Hài Đốm lớn màu vàng nhạt với nhiều đốm nhỏ màu tím, có giá trị thẩm mĩ có giá trị dược học Một số nhà khoa học báo cáo kết nghiên cứu đa dạng, tái sinh nhân giống Lan Hài Đốm từ chồi ngủ, thân mầm Nghiên cứu tiến hành nhằm khảo sát khả tái sinh Lan Hài Đốm thu thập Thái Nguyên từ chồi non hạt sau thụ phấn khoảng 170-200 ngày Các kết thu là: Chồi non khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút cho tỷ lệ mẫu đạt 50% sau tuần Các chồi in vitro thu sinh trưởng phát triển tốt, số lá/chồi đạt 3,8 độ rộng đạt 0,70 cm sau tháng nuôi cấy Quả lan Hài có độ tuổi phù hợp khoảng 170 ngày khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% 15 phút cho tỷ lệ mẫu thu từ 75% đến 100% Hạt nảy mầm môi trường MS bổ sung BAP 2mg/l (tỉ lệ bình nảy mầm đạt 81,7%) Thời gian nảy mầm hạt 90 ngày đến 100 ngày Chồi hình thành đến sau 90 ngày nuôi cấy Các Lan Hài Đốm in vitro hoàn chỉnh khỏe mạnh thu sau 110 - 120 ngày nuôi cấy với 2-3 lá, 1-2 rễ nhỏ ngắn Các kết nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu ban đầu để nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống lan Hài Đốm Từ khóa: Lan Hài Đốm, nảy mầm, môi trường, hạt, tái sinh Ngày nhận bài: 05/8/2019; Ngày hoàn thiện: 25/9/2019; Ngày đăng: 04/10/2019 REGENERATION OF PAPHIOPEDILUM CONCOLOR FROM YOUNG BUDS AND SEEDS Vu Thi Lan*, Tran Thi Thu Trang University of Science – TNU, Thach That Secondary School, Ha Noi ABSTRACT Paphiopedillum concolor is one of the endemic species of Vietnam It is a small slipper orchird with relatively large pale yellowish fragrant flowers finely spotted with purple It has both aesthetic and medicinal value Some of scientists has been reporded the result of research on the diversity, regeneration or propagation of Paphiopedilum concolor from auxilary buds This research was conducted to investigate in vitro propagation of Paphiopedillum concolor collected in Thainguyen, Vietnam Materials for in vitro propagation include of young buds and seeds collected from fruits aged about 170-200 days after pollination (DAP) In conclusion, young buds sterilized by 0.1% HgCl2 for 15 minutes for a 50% clean sample rate after two weeks In vitro shoots grew and developed well, leaf number per shoot reached 3.8 and leaf width reached 0.70 cm after four months P concolor fruits aged about 170 days after pollination (DAP) sterilized by 0.1% HgCl2 solution for 15 minutes for a clean sample rate of 87,5% Seeds germinated on MS medium supplemented with BAP 2mg/l (Seed germination rate reached 81,7%) Seed germination time was 90 days to 100 days Shoots formed to leaves after 90 days of culture In vitro P concolor plantlets have been created with 2- leaves, 1-2 small and short roots after 110-120 days cultivaion This reseach has created materials to complete the protocol of propagation of Paphiopedillum concolor Keywords: Paphiopedilum concolor, germination, medium, regeneration, seed Received: 05/8/2019; Revised: 25/9/2019; Published: 04/10/2019 * Corresponding author Email: lanvt@tnus.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 113 Vũ Thị Lan Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Đặt vấn đề Việt Nam trung tâm lan Hài lớn giới, với 22 loài thuộc chi Paphiopedilum, số có nhiều lồi đặc hữu có giá trị xuất Việt Nam lan Hài Bóng, Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,….[1] Tuy nhiên, tất loài thuộc chi Paphiopedilum biến cách nhanh chóng Những nghiên cứu thực địa điều tra thực tế Averyanov đồng tác giả (2004) cho thấy mức độ đe dọa tuyệt chủng loài lan Hài nguy cấp, cần ưu tiên bảo tồn Việt Nam [1] Nguyên nhân làm suy giảm nhanh chóng số lượng lồi lan Hài Việt Nam hai yếu tố: Thứ thay đổi môi trường sống người gây nên với việc khai thác gỗ, chặt phá rừng không theo kế hoạch với nạn đốt rừng làm nương rẫy làm nơi sinh sống loài lan Hài; Yếu tố thứ hai việc thu hái lan Hài quy mô lớn người dân địa phương để bán cho người buôn Lan Việc bảo tồn loài lan Hài thu hút quan tâm lớn nhà khoa học Những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để nhân nhanh loài lan Hài đặc hữu Việt Nam kết thu hạn chế gặp nhiều khó khăn khâu vào mẫu thành công ban đầu vài giống Hài [2], Hài hồng [3], Hài Bóng [4] Lan Hài Đốm có tên khoa học Paphiopedilum concolor loài mọc hốc núi đá vôi vùng núi đá vôi thấp miền Bắc Việt Nam Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Lạng Sơn, Hà Nam, Nam Định [1] Hoa màu vàng tươi có đốm nhỏ màu đỏ Kích thước hoa khiêm tốn, chúng thường nở thành chùm tứ 1-3 đẹp, hương thơm nhẹ nhàng Đã có số 114 207(14): 113 - 119 nghiên cứu đối tượng lan Hài P concolor Việt Nam công bố Nghiên cứu đa dạng di truyền Khuất Hữu Trung cộng cho thấy loài Lan Hài Đốm địa Việt Nam đa dạng phong phú [5] Nguyễn Thị Tình cộng (2017) báo cáo nhân giống lan Hài Gấm/Hài Đốm từ mầm ngủ thân mầm Tác giả thu tái sinh nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh, rễ đưa vườn ươm [6] Tuy nhiên, Lan Hài Đốm gần khơng có thân (thân ngắn) nên vật liệu thân mầm hạn chế Hiện nay, chưa có cơng bố Việt Nam nghiên cứu nhân giống Lan Hài Đốm P concolor nguyên liệu chồi ex vitro hay gieo hạt in vitro Bài báo trình bày số kết nghiên cứu tái sinh Lan Hài Đốm từ nguyên liệu chồi non hạt từ thụ phấn phòng thí nghiệm Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu: Vật liệu cho nhân giống in vitro gồm hai loại là: (1) Chồi non khoảng tháng tuổi tái sinh từ rễ Hài Đốm; (2) Quả Lan Hài Đốm thu thập từ Lan Hài Đốm nuôi trồng vườn bảo tồn lan Hài trường Đại học Khoa học Thái Nguyên 2.2 Phương pháp khử trùng chồi ex vitro Mẫu chồi non thu rửa đất cát vòi nước chảy, sau rửa xà phòng lỗng, rửa xà phòng, mang vào box cấy để khử trùng Mẫu ngâm dung dịch cồn 70% 30 giây, tráng lại nước cất khử trùng lần, khử trùng HgCl2 0,1% khoảng thời gian 10 phút, 12 phút 15 phút có bổ sung vài giọt Tween 20, sau lần khử trùng rửa lại mẫu nước cất khử trùng nhiều lần Sau khử trùng, mẫu cấy lên môi trường chuẩn bị môi trường MS (đối chứng) môi trường MS bổ sung BAP mg/l để theo dõi đánh giá hiệu khử trùng khả sống sót đặc điểm sinh trưởng phát triển mẫu http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Vũ Thị Lan Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 2.3 Phương pháp khử trùng Lan Hài Đốm Quả Lan Hài Đốm sau thụ phấn vườn bảo tồn theo dõi sinh trưởng phát triển Quả thu hái từ 170 ngày đến 200 ngày sau thụ phấn (days after pollination, viết tắt DAP) Quả cắt rửa vòi nước chảy, ngâm xà phòng lỗng khoảng phút, rửa xà phòng tráng mẫu nước cất, mang vào box cấy để khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút (chế độ 1) khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút, sau nhúng cồn đốt (chế độ 2) Sau lần khử trùng HgCl2 rửa lại mẫu nước cất khử trùng nhiều lần Quả sau khử trùng dùng dao bổ dọc quả, tách lấy hạt nuôi cấy môi trường MS bổ sung BAP 2mg/l MS bổ sung BAP mg/l, nước dừa 100ml/l Lượng hạt gieo bình ni cấy tương đương Theo dõi hiệu khử trùng khả nảy mầm hạt 2.4 Ảnh hưởng tuổi môi trường đến khả nảy mầm hạt Quả Lan Hài Đốm sau thụ phần ghi lại ngày tháng tính tuổi để thu đem ni cấy Quả thu có độ tuổi 170 DAP 200 DAP, tiến hành khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% 15 phút tách lấy hạt nuôi cấy hai môi trường MS bổ sung BAP mg/l MS bổ sung BAP mg/l nước dừa 100ml/l Lượng hạt gieo bình ni cấy tương đương Theo dõi khả nảy mầm hạt 207(14): 113 - 119 Excel Các giá trị trung bình theo sau chữ khác (a, b, c,…) cột bảng số liệu biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05 Kết bàn luận 3.1 Nghiên cứu khử trùng mẫu chồi non Các loài thuộc chi Paphiopedilum coi khó tái sinh từ ni cấy mơ nguồn nguyên liệu hiếm, khó khăn khâu vào mẫu nhiễm bẩn vi khuẩn nhiễm nấm mẫu có nguồn gốc từ ex vitro phát triển điều kiện in vitro Các quy trình khử trùng mẫu ảnh hưởng đến hiệu bước vô trùng chất lượng mẫu ảnh hưởng đến phát sinh quan mẫu mơ sau [7] Trong nghiên cứu này, chồi non ex vitro khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% ba khoảng thời gian 10 phút, 12 phút 15 phút (Bảng 1) Quả lan Hài Đốm khử trùng theo hai chế độ: chế độ chế độ (Bảng 2) 3.1.1 Hiệu khử trùng mẫu chồi non Hạt ni cấy mơi trường thích hợp theo dõi phát sinh hình thái giai đoạn trình nảy mầm hạt đến tạo chồi in vitro hoàn chỉnh Ghi lại thời gian giai đoạn (ngày) theo dõi Kết thu bảng cho thấy có khác biệt hiệu khử trùng chế độ khử trùng nghiên cứu Trong đó, khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút thu hiệu khử trùng cao nhất, tỷ lệ mẫu sống sau tuần 50%, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (20%) Khi khử trùng HgCl2 0,1% 10 phút tỷ lệ mẫu nhiễm cao (80%), mẫu lại bị chết (20%), khơng thu mẫu Khi khử trùng HgCl2 0,1% 12 phút tỷ lệ mẫu nhiễm cao (50%), tỷ lệ chết chiếm 30%, tỷ lệ mẫu sống 20% Trong ba chế độ khử trùng, có tỷ lệ chết từ 20 - 30%, điều phần hóa chất gây độc mẫu làm tổn thương mơ non 2.6 Phương pháp xử lí số liệu: Các số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học máy tính phần mềm Microsoft Cho đến nay, có ba báo cáo q trình vi nhân giống Paphiopedilum từ mẫu mô ex vitro [7]: Stewart & Button (1975) sử dụng 2.5 Theo dõi thời gian giai đoạn phát sinh hình thái gieo hạt in vitro http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 115 Vũ Thị Lan Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN mẫu hoa non trưởng thành, đầu lá, rễ, nhị hoa, bầu nhụy chồi đỉnh ba loài thuộc chi Paphiopedilum trồng tự nhiên (P villosum, P fairrieanum, P insigne) Huang (1988) khử trùng đỉnh chồi giống lai Paphiopedilum dung dịch NaClO 0,5% 15 phút áp suất chân khơng nhẹ, sau đỉnh chồi khoảng 2-3 mm cắt bỏ kính hiển vi để giảm nhiễm trùng Ngồi ra, mơi trường MS có chứa kháng sinh carbenicillin cefotaxime với nồng độ 100-500 mg/l có hiệu hạn chế nhiễm vi khuẩn môi trường nuôi cấy ban đầu Liao et al (2011) báo cáo lát cắt ngang giống Paphiopedilum lai P Deperle P Armeni White tạo chồi bất định tái sinh 3.1.2 Hiệu chế độ khử trùng lan Hài Đốm Kết thu theo dõi hiệu khử trùng khả nảy mầm hạt sau khử trùng sau tháng cho thấy hai chế độ khử trùng nghiên cứu cho hiệu khác rõ rệt khác biệt so với đối chứng (Bảng 207(14): 113 - 119 2) Quả lan Hài có độ tuổi khoảng 170 DAP khử trùng dung dịch HgCl 0,1% 15 phút (chế độ 1) cho thấy hiệu khử trùng tốt, tỷ lệ mẫu thu cao khoảng 87,5% (trung bình hai lần lặp lại) Các bình tiếp tục theo dõi khả nảy mầm hạt Các hạt từ khử trùng chế độ nảy mầm sau khoảng 90 ngày nuôi cấy Điều chứng tỏ chế độ khử trùng vừa thu mẫu cao vừa không ảnh hưởng đến khả nảy mầm hạt Ở chế độ (khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút, sau dùng panh gắp nhúng cồn đốt) cho tỷ lệ mẫu đạt tuyệt đối 100%, nhiên, theo dõi không thu bình có hạt nảy mầm Điều hạt lan Hài bị nóng làm tổn thương khơng nảy mầm Ở mơi trường đối chứng, Lan Hài Đốm lắc rửa nước cất khơng thu mẫu sạch, tỉ lệ nhiễm 100% Vì vậy, để thu mẫu Lan Hài Đốm nên chọn chế độ khử trùng Bảng Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 chồi Lan Hài Đốm sau tuần Thời gian khử trùng HgCl2 0,1% (phút) 10 12 15 Số mẫu 20 20 20 Tỷ lệ mẫu chết (%) 20 30 30 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 80 50 20 Tỷ lệ mẫu (%) 20 50 Bảng Hiệu khử trùng Lan Hài Đốm Chế độ Đối chứng Chế độ Chế độ Khử trùng HgCl2 0,1% (phút) 15 15 Khử trùng Tỷ lệ mẫu đốt cồn (%) Khơng Khơng Khơng Có Có 100 75 100 100 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Khả nảy mầm 100 Khơng 25 0 Có Có Không Không 3.2 Đặc điểm sinh trưởng chồi non nuôi cấy in vitro Các chồi non Lan Hài Đốm sau khử trùng cấy lên môi trường MS (đối chứng, khơng bổ sung BAP) mơi trường thí nghiệm (MS bổ sung BAP mg/l, than hoạt tính 0,5 g/l) để theo dõi đặc điểm sinh trưởng phát triển lan Hài điêu kiện in vitro (Bảng 3) Kết thu bảng cho thấy Lan Hài Đốm sau khử trùng sống sót tiếp tục sinh trưởng phát triển hai môi trường nghiên cứu Trên môi trường thí nghiệm 116 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Vũ Thị Lan Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN (TN), Lan Hài Đốm sinh trưởng phát triển khá, tiêu sinh trưởng đạt cao so với môi trường ĐC Đa số mới, số lá/chồi đạt 3,0 3,8 sau tháng tháng ni, có tăng trưởng độ lớn so với ban đầu so với cac môi trường đối chứng, đạt 0,55 cm 0,7cm sau tháng (Bảng 3, Hình 1) Tuy nhiên, tất không phát sinh rễ chồi Có thể mơi trường ni cấy chưa phù hợp khả tái sinh rễ tạo đa chồi lan Hài tương đối khó ni cấy in vitro Điều trở ngại lớn nhân giống in vitro lan Hài Dương Tấn Nhựt cộng (2005) thấy khơng có chồi P delenatii hình thành ni cấy chồi khơng bị thương tổn ống nghiệm tất loại môi trường thử nghiệm Khi tạo tổn thưởng cách tạo vết cắt chồi trung bình có 2,3 chồi khỏe mạnh thu thập từ nuôi cấy môi 207(14): 113 - 119 trường MS rắn có chứa TDZ 0,25 mg/l NAA 0,5 mg/l Các tế bào bị thương khu vực bị hư hỏng phản ứng dễ dàng với tác nhân kích thích TDZ trạng thái mơi trường lỏng cho phép biệt hóa thành chồi bất định [3] Do đó, cần có thêm nghiên cứu khả tạo rễ tái sinh chồi Lan Hài Đốm thời gian 3.3 Ảnh hưởng tuổi môi trường đến khả nảy mầm hạt Sự nẩy mầm phát triển hạt loài lan Hài thuộc chi Paphiopedilum chịu ảnh hưởng đáng kể số yếu tố, bao gồm trưởng thành hạt, tiền xử lý hạt, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy phương pháp nuôi cấy [7], [10] Trong nghiên cứu này, Lan Hài Đốm từ 170 đến 200 ngày sau thụ phấn thu tiến hành khử trùng HgCl 0,1% 15 phút nuôi cấy môi trường MS bổ sung BAP mg/L MS bổ sung BAP mg/L, nước dừa 100ml/l Bảng Đặc điểm sinh trưởng Lan Hài Đốm in vitro sau tháng Môi Nồng độ trường BAP (mg/l) Ban đầu ĐC TN Sau tháng nuôi cấy ĐC TN Sau tháng nuôi cấy ĐC TN A Chỉ tiêu sinh trưởng Độ rộng (cm) Số chồi/mẫu Chất lượng chồi 0,4 ± 0,18 0,39 ± 0,28 1,0 1,0 Vàng nhạt, nhỏ Vàng nhạt, nhỏ 2,2a ± 0,4 3,0b ± 0,63 0,45a ± 0,10 0,55ab ± 0,25 1,0 1,0 Xanh nhạt, nhỏ Xanh nhạt, mập 2,6a ± 0,49 3,8b ± 0,74 0,52a ± 0,28 0,70b ± 0,15 1,0 1,0 Xanh nhạt, nhỏ Xanh nhạt, mập Số lá/chồi 2,0 2,0 B C D Hình Tái sinh Lan Hài Đốm từ chồi ex vitro A) Chồi non ex vitro; B)Mẫu khử trùng; C) Mẫu môi trường ĐC sau tháng; D) Mẫu môi trường BAP 2mg/l sau tháng http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 117 Vũ Thị Lan Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Kết cho thấy có bình chứa hạt Lan Hài Đốm 170 ngày tuổi sau thụ phấn nảy mầm, hạt thu từ 200 DAP không nảy mầm Thời gian nảy mầm hạt lâu, phải khoảng 90-100 ngày Mặt khác, thu hạt nảy mầm môi trường MS bổ sung BAP mg/l với tỷ lệ hạt nảy mầm 81,7% (81,7a ± 2,33) Còn mơi trường MS bổ sung BAP mg/l nước dừa 100 ml/l chưa thu hạt nảy mầm Có thể chất lượng hạt từ thu không tốt nên chưa đánh giá hàm lượng nước dừa có phù hợp cho hạt nảy mầm hay không Điều cho thấy khả nảy mầm hạt lan Hài phụ thuộc vào yếu tố chế độ khử trùng, tuổi quả, mơi trường ni cấy phụ thuộc vào chất lượng cụ thể độ tuổi Vì vậy, cần có nhiều nghiên cứu sâu để xem xét ảnh hưởng yếu tố Theo Giang cộng (2010), lan Hài Hằng có tuổi từ 6-10 tháng có khả nảy mầm vởi tỷ lệ 58-67% Theo Zeng cs (2013) nghiên cứu khả nảy mầm Hài Hằng có độ tuổi từ 5-7 tháng cho hạt đạt 180 ngày sau thụ phấn (DAP) phù hợp cho nuôi cấy Tỷ lệ hạt nảy mầm (72.67%) mơi trường có chứa NAA 0.5 mg/ l, nước dừa 10%, than hoạt tính A B 207(14): 113 - 119 1,0 g/l [2] Ngoài ra, tỷ lệ hạt nảy mầm loài mơi trường khơng qn, ví dụ tỷ lệ nảy mầm hạt P armeniacum 120 ngày sau thụ phấn 25.2% [8] 18.4% [9] môi trường Robert Ernst 3.4 Theo dõi thời gian giai đoạn phát sinh hình thái gieo hạt in vitro Khi hạt Lan Hài Đốm nảy mầm có mầu trắng, sau khoảng 20 ngày hạt trương to dần lên chuyển sang màu xanh Sau 40 ngày tạo cụm protocorm màu xanh, cụm có 2-3 thể chồi Số hạt nảy mầm bình khoảng 10-20 hạt bình, lại khơng nảy mầm Ngồi ra, bình mẫu thu sau ni cấy khơng có hạt nảy mầm, điều hạt lại chất lượng hạt khơng tốt bị lép khơng có khả nảy mầm Sau đó, thể chồi tiếp tục sinh trưởng phát triển chậm, sau 90 ngày tạo chồi có 1-2 màu xanh chưa có rễ Sau nảy mầm khoảng 110 đến 120 ngày, Lan Hài Đốm in vitro hoàn chỉnh tạo thành với 2-3 xanh đậm 1-2 rễ nhỏ ngắn (Hình 2) C D E F Hình Hình ảnh tái sinh Lan Hài Đốm từ hạt A) Quả Lan Hài Đốm, B) Hạt Lan Hài Đốm gieo môi trường, C) Hạt bắt đầu nảy mầm, D) Protocorm hình thành, E) Chồi với 2-3 thật sau 100 ngày, F) Cây Lan Hài Đốm hoàn chỉnh sau nảy mầm 150 ngày 118 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Vũ Thị Lan Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Theo Zeng cs (2012), nảy mầm, tăng trưởng phát triển ống nghiệm chi Paphiopedilum thường chia thành giai đoạn: (1) trình nảy mầm: trình tách vỏ hạt giống cách phình to phơi; (2) xuất chồi (mô phân sinh non) và/hoặc rễ giả; (3) xuất kéo dài thứ nhất; (4) diện nhiều rễ; (5) diện hai nhiều rễ, hình thành [10] Như vậy, cơng trình Việt Nam công bố tái sinh in vitro Lan Hài Đốm từ nguyên liệu hạt (gieo hạt in vitro) theo dõi thời gian bước biệt hóa từ hạt lan đến tạo in vitro hoàn chỉnh Kết luận Cây Lan Hài Đồm tái sinh thành công từ chồi non hạt sau thụ phấn 170 ngày Chồi non sau khử trùng HgCl2 0,1% 15 phút thu 50% mẫu chồi tái sinh Các chồi in vitro sinh trưởng phát triển tốt, số lá/chồi đạt 3,8 độ rộng đạt 0,70 cm sau tháng nuôi cấy Hạt từ Lan Hài Đốm có độ tuổi khoảng 170 DAP sau khử trùng dung dịch HgCl 0,1% 15 phút cho tỷ lệ mẫu thu đạt 87,5% hạt có khả nảy mầm môi trường MS bổ sung BAP mg/l Các Lan Hài Đốm in vitro hoàn chỉnh thu sau 110-120 ngày Các kết tiền đề cho nghiên cứu nhân giống Lan Hài nói chung Lan Hài Đốm nói riêng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp, Lan Hài Việt Nam, Nxb Giao thông vận tải, Hà Nội, 2004 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 207(14): 113 - 119 [2] Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà, “ Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng lan Hài quý P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Phát triển, T 8, S 2,tr 194 – 201, 2010 [3] Dương Tấn Nhựt, “ Một số kỹ thuật nhân giống vơ tính lan Hài” Báo cáo khoa học Hội thảo ứng dụng kỹ thuật nhân giống ni trồng hoa Lan thành phố Hồ Chí Minh, tr.13- 18, 2005 [4] Thi Tinh Nguyen, Tien Dung Nguyen, Xuan Thanh Dao, Truc Dat Chu, Xuan Binh Ngo, “In vitro Propagation of a Vietnam Endemic Lady’s Slipper Orchid (Paphiopedilum vietnamense O.Gruss & Perner)”, Journal of Horticulture and Plant Research, Vol 1, pp 1-8,2018 ISSN: 0000-000X [5] Khuất Hữu Trung, “Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Lan Hài Đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer) địa Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, T.3, S 12, tr 70-77, 2009 [6] Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Tiến Dũng, Phạm Thị Nam, Chu Thúc Đạt, Ngô Xuân Bình, “Nghiên cứu nhân giống in vitro Lan Hài Đốm”, Tạp chí Nơng Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn, T.2, S.12, tr 79-83,2017 [7] Zeng S, Huang W, Wu K, Zhang J, da Silva JA, Duan J, “In vitro propagation of Paphiopedilum orchids”, Crit Rev Biotechnol, Vol 36, No.3, pp 521-534, 2016 [8] Chen TY, Chen JT, Chang WC., “Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids’, Plant Cell Tissue Organ Cult, Vol.76, pp.11–15, 2004 [9] Ding CC, Wu H, Liu FY “Factors affecting the germination of Paphiopedilum armeniacum”, Acta Bot Yunnanica, Vol.26, pp.673–637, 2004 [10] Zeng SJ, Wu KL, Teixeira da Silva JA Asymbiotic seed germination, seedling development and reintroduction of Paphiopedilum wardii Sumerh., an endangered terrestrial orchid Sci Hortic, Vol.138, 198-209, 2012 119 120 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn ... Việt Nam lan Hài Bóng, Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,….[1] Tuy nhiên, tất loài thuộc chi Paphiopedilum biến cách nhanh... (1) Chồi non khoảng tháng tuổi tái sinh từ rễ Hài Đốm; (2) Quả Lan Hài Đốm thu thập từ Lan Hài Đốm nuôi trồng vườn bảo tồn lan Hài trường Đại học Khoa học Thái Nguyên 2.2 Phương pháp khử trùng chồi. .. đến 120 ngày, Lan Hài Đốm in vitro hoàn chỉnh tạo thành với 2-3 xanh đậm 1-2 rễ nhỏ ngắn (Hình 2) C D E F Hình Hình ảnh tái sinh Lan Hài Đốm từ hạt A) Quả Lan Hài Đốm, B) Hạt Lan Hài Đốm gieo môi