Bài viết trình bày việc kiểm tra tính tương hợp sinh học của keo sinh học được tổng hợp từ Hyaluronan (HA) và polyvinyl phosphonic acid (PVPA).
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU TÍNH TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA KEO HA/PVPA TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT Hồ Văn Hai*, Nguyễn Thị Hiệp*, Lê Quốc Tuấn**, Nguyễn Thị Lệ**, Bùi Chí Bảo**, Võ Văn Tới* TĨM TẮT Mục tiêu: Kiểm tra tính tương hợp sinh học keo sinh học tổng hợp từ Hyaluronan (HA) polyvinyl phosphonic acid (PVPA) Phương pháp: Bằng phương pháp este hóa keo HA/PVPA tạo theo nhiều nồng độ khác nhau, sau keo làm khô phương pháp đông khô lạnh Keo gia cơng thành hình tròn đường kính 1cm độ dày 1mm Mẫu keo sau tạo hình cấy lên lưng chuột sau khả làm lành vết thương quan sát liệu hình ảnh vết thương qua ngày (cho đến ngày thứ 14 sau cấy mẫu) Khu vực da cấy vật liệu tách khỏi vật chủ sau 14 ngày sử dụng phương pháp cắt lát nhuộm H&E để xác định mức độ phát triển mô bên khu vực xử lý keo Kết quả: Kết cho thấy keo có khả kết dính hỗ trợ hồi phục vết thương cao tuần Ngoài ra, kết nhuộm H&E cho thấy có mạch máu phát triển mơ hình thành Tuy nhiên, tế bào phát triển tập trung dày khu vực cấy mẫu cấu trúc mơ chưa ổn định Có thể kết luận rằng, keo tính tương hợp sinh học cao Kết luận: Kết từ thí nghiệm vật liệu tạo từ keo HA/PVPA có khả hỗ trợ hồi phục vết thương có độ tương hợp sinh học cao, thích hợp cho tế bào phát triển sử dụng cho vết thương da Từ khóa: Hyaluronan (HA), Polyvinyl Phosphonic acid (PVPA) ABSTRACT IN-VIVO STUDIES OF HA/PVPA GEL USING MICE MODEL Ho Van Hai, Nguyen Thi Hiep, Le Quoc Tuan, Nguyen Thi Le, Bui Chi Bao, Vo Van Toi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - Supplement of No - 2016: 53 - 58 Objective: To investigate the biocompatibility of hyaluronan (HA) and polyvinyl phosphonic acid (PVPA) hydrogel Method: HA/PVPA was fabricated by cross-linking between HA with PVPA in various PVPA concentration, then the gel was hydrated by using freeze-drying method in order to make scaffolds Scaffolds were shaping by surgery blade with 1cm diameter and 1mm thickness Scaffolds were implanted on mouse dorsal and monitored for 14 day The implanted zoneswere extracted after implanting 14 days and stained by H&E staining method to observe tissue formation Result: The results showed that scaffolds were adhesive with skin wound and accelerate the wound healing process H&E staining results showed that scaffolds were excellent biocompatible materials and provided a matrix for cell regeneration Conclusion: HA/PVPA hydrogel can be used as bioglue because it’s adhesive properties and excellent biocompatibility Key words: Hyaluronan (HA), Polyvinyl Phosphonic acid (PVPA) * Đại Học Quốc Tế - Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược TP.HCM ĐT: 0983888700 Email: nthiep@hcmiu.edu.vn Địa liên hệ : TS Nguyễn Thị Hiệp Khoa học Cơ 53 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến thời điểm tại, nhu cầu y tế loại vật liệu thuốc để chữa trị bệnh mãn tính gây tổn thương sâu khiếm khuyết da, tai nạn gây tổn thương sâu cho da bỏng nhiệt, bỏng hóa chất, da tai nạn lấy da để cấy ghép cho phần khác, cao(1,2) Hiện có nhiều biện pháp để chữa trị cho tổn thương kể ví dụ như: cấy ghép da từ phận khác, tế bào gốc, thuốc mỡ trị bỏng… Tuy nhiên biện pháp tồn nhiều điểm hạn chế hạn hẹp da nguồn phận lấy da để cấy ghép dễ bị đào thải hoại tử, tế bào gốc thường khơng ổn định chi phí cao khó bảo quản qui trình chiết tách phức tạp….Do đó, nhu cầu loại vật liệu sinh học có đầy đủ ưu điểm cần thiết dễ sử dụng, tính tương hợp sinh học cao cao(3) Polymer sinh học nguồn tự nhiên tổng hợp lĩnh vực nghiên cứu nhiều hứa hẹn để thỏa mãn tất yêu cầu y tế chữa trị tổn thương da, chí tốt mong đợi Do loại keo sinh học tạo từ Hyaluronan (HA) polyvinyl phosphonic axit (PVPA) với tính lí, tương hợp sinh học, hỗ trợ cho phát triển tế bào tạo nhằm ứng dụng để chữa trị tổn thương da, kết dính tốt với khu vực tổn thương tạo thành lớp bảo vệ ngăn cách bụi bẩn/vi khuẩn tiếp xúc với vết thương mặt hỗ trợ cho tế bào phát triển làm lành vết thương nhan(4) Hyaluronan có chứa glycosaminoglycan (GAG) glucuronic axit thành phần tổ hợp ma trận ngoại bào có liên kết hầu hết biểu mơ, mô thần kinh HA nonsulfated glycosaminoglycans hình thành màng tế bào thay Golgi, với khối lượng phân tử lớn Là thành phần ma trận ngoại bào, hyaluronan góp phần đáng kể vào chuyển dời tế bào tăng sinh tế bào(5) Trong da, 54 hyaluronan chiếm thành phần cao Do đó, HA polyme nhiều tiềm với tính chất thích hợp để tái tạo mô mềm, đặc biệt tái tạo da(6) Polyvinyl phosphonic axit (PVPA) phosphonate tổng hợp thường dùng tái tạo xương Trong nghiên cứu này, PVPA kết hợp với HA nhằm tạo keo HAPVPA có tương hợp sinh học cao có lỗ xốp rộng cho phép tế bào di chuyển vào phát triển chúng(7) Quá trình tạo keo tính chất tương hợp tế bào nghiên cứu nghiên cứu trước Trong này, khảo sát khả tương thích keo HA-PVPA mơ hình chuột ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tính tương hợp sinh học keo sinh học HA/PVPA mơ hình da chuột Vì muốn xem tính chất tương hợp hỗn hợp keo keo dùng thí nghiệm keo lấy nước hoàn toàn phương pháp đông khô Thiết kế nghiên cứu Keo sinh học tạo cách trộn dung dịch HA 0,1% với PVPA 30% sau trung hòa tính acid hỗn hợp keo sinh học NaOH, chuẩn độ cho pH keo vào khoảng 7,0-7,04 nhằm tạo môi trường trung tính, khơng gây độc cho tế bào Trong thí nghiệm này, có mẫu đợc tạo cách thay đổi nồng độ PVPA Cụ thể thể tích PVPA 30% tăng dần từ 10, 20, 30, 40, 50µL vào ống nghiệm có chứa 0,1 mL HA 0,1% Các ống nghiệm có chứa keo sinh học sau chuẩn độ để điều chỉnh pH mức 7-7,04 NaOH 0,1 M Các ống nghiệm chứa mẫu sau đánh số từ 1-5 tương ứng với tỉ lệ nồng độ PVPA (Xem bảng 1) Những ống nghiệm chứa mẫu keo sinh học sau cho vào máy đơng khơ nhằm loại bỏ tất phân tử nước có keo trước tiến hành cấy da chuột Hình hình ảnh Chuyên Đề Khoa học Cơ – Y tế Cơng cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 keo sau 48 xử lí phương pháp đơng khơ Keo dạng khơ có dạng trụ tròn xốp có đường kính 1cm Các hình trụ cắt thành khoanh tròn có độ dày mm cho trình cấy mẫu lên động vật 15 chuột bạch (20-26 g) dùng thí nghiệm mua từ viện Pasteur nuôi tuần trước phân thành nhóm dùng thí nghiệm Lơng chuột khu vực lưng làm sạch, sau vết thương hình tròn đường kính 1cm tương đương tạo dao mổ Vùng khuyết bị cắt da thay A B Nghiên cứu Y học mẫu keo Quá trình vết thương lành theo dõi thứ 14 Bảng 1: Tỉ lệ nồng độ mẫu keo sinh học độ pH tương ứng mẫu Mẫu HA 1%(mL) PVPA 30% NaOH 2M pH (mL) (uL) 0,1 0,01 15 6,5 0,1 0,02 35 6,5-7 0,1 0,03 50 0,1 0,04 60 0,1 0,05 70 C 1cm 1cm Hình 1: A) Hình dạng mẫu keo khơ, B) vết thương nhân tạo lưng chuột, C) vết thương cấy mẫu dính tốt vào mơ, mẫu dính vào vết Mẫu da quanh khu vực cấy mẫu thương nhờ vào lỗ xốp rộng, đủ để hút thấm cắt khỏi thể chuột xử lí phọc-mơn máu dính vào vết thương trước nhuộm H&E để quan sát phát triển tế bào bên mẫu KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ kết dính mẫu vết thương sau cấy Nhằm khảo sát khả bám dính mơ, keo khơ phủ lên vết thương Theo kết thu sau thí nghiệm cấy mẫu lên vết thương, có mẫu số số dính tốt với toàn khu vực vết thương, mẫu số mẫu số bị vỡ rã thành mảnh nhỏ nên khơng bám dính lên khu vực vết thương Mẫu số số có độ cứng khơng đủ độ dẻo để kết dính hoàn toàn với vết thương nên bị rơi sau cấy Việc bám dính tốt mẫu mẫu giải thích rằng: mẫu mẫu tốt nhất, có phản ứng vừa đủ giúp cho mẫu bám Khoa học Cơ Độ hồi phục vết thương ngày thứ sau cấy mẫu Qua kết quan sát vết thương cho thấy ngày thứ thứ hai sau cấy mẫu khơng có tượng loại thải xảy ra, khơng gây kích ứng khơng quan sát thấy ửng đỏ xung quanh vết thương Qua quan sát nhóm vết thương khơng qua xử lí keo cho thấy, ngày thứ sau cấy, vết thương chưa ổn định dễ bị rách Với nhóm chuột có vết thương xử lí với keo sinh học mẫu số số cho thấy vết thương khơ nhanh khơng chảy nước hay máu sau ngày thứ sau cấy, vết thương thu hẹp nhanh so sánh với vết thương chưa qua xử lí keo Từ ngày thứ trở vết 55 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 thương khơ khơng có tượng viêm hay mưng mủ, mẫu keo cấy liên kết chắn tạo thành lớp vỏ bọc ngăn cách tốt vết thương với bụi bẩn môi trường bên Cho đến ngày thứ 7, vết thương xử lí với mẫu keo số số lành, khu vực xung quanh vết thương cấy mẫu mọc nhiều lơng gần có hình thái bình thường so với trước cạo để tạo vết thương Hình 2: Hình ảnh vết thương sau cấy, quan sát sau ngày thứ 2,3,4 ngày thứ với mẫu không xử lý keo mẫu có xử lý keo bố đồng Vùng da xung quang vết thương Quan sát tiêu hình thành lại lỗ chân lông phân lớp Qua quan sát tiêu bảng mẫu da xử lí mơ hồn chỉnh với mẫu keo số cho thấy, tế bào di chuyển Tiêu mang mẫu keo số cho kết hình thành lớp mơ bù vào lớp da quan sát kính hiển vi gần tương đồng bị cắt đi, hình ảnh cho thấy: mô xung quanh vết với mẫu số mạch máu bên khu thương liên kết tốt với mô hình thành vực xử lí keo phát triển mạnh mật vết thương, quan sát kỹ cho thấy có mạch máu độ tế bào tập trung nhiều Tuy nhiên, nhìn nhỏ xung quanh khu vực cấy mẫu, mơ tái chung mơ hình thành mẫu số tạo có hình thái tương đối hoàn chỉnh Tuy chưa hoàn thiện mẫu số nhiên, khu vực cấy mẫu cho thấy mô chưa tái tạohoàn chỉnh, tế bào tập trung dày đặc phân 56 Chuyên Đề Khoa học Cơ – Y tế Cơng cộng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Nghiên cứu Y học A 500µm B 500µm Hình 3: Sự phát triển tế bào bên vết thương xử lí keo số 2(A), keo số 5(B) tính chất trên, keo số thích hợp để ứng dụng KẾT LUẬN cho chữa trị vết thương da kích thích vết Nhằm tìm tỷ lệ thích hợp chất thương da phục hồi nhanh tham gia keo HA/PVPA vào kết TÀI LIỆU THAM KHẢO khảo sát tính tương hợp sinh học mô Burdick JA and Prestwich GD (2011) Hyaluronic acid hydrogels for hình chuột, cấy mẫu biomedical applications Advanced Materials, 23, H41-H56 Nguyen DT, Orgill DP, Murphy GF (2009) Chapter 4: The loại chuột với kích thước Kết Pathophysiologic Basis for Wound Healing and Cutaneous cho thấy keo số keo tốt nhất, ứng Regeneration Biomaterials For Treating Skin Loss, p 32 dụng điều trị vết thương da keo có tính bám Nguyen MK and Lee DS (2010) Injectable biodegradable hydrogels Macromolecular Bioscience, 10, 563-579 dính mơ tốt, tính bám dính giúp bảo vệ Shah DN, Recktenwall-Work SM and Anseth KS (2008) The da khỏi cơng vi khuẩn bên ngồi, effect of bioactive hydrogels on the secretion of extracellular keo số có tính tương hợp sinh học matrix molecules by valvular interstitial cells Biomaterials, 29, 2060-2072 caogiúp cho tế bào kết dính phát triển Với Khoa học Cơ 57 Nghiên cứu Y học 58 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ Số * 2016 Nguyen Thi Hiep, Kim YH, Song HY, Lee BT (2011) Nano Ag loaded PVA nano-fibrous mats for skin applications Applied Biomaterials, 968(2): p Trần Văn Tiến (2011) Đánh giá hiệu thuốc bôi DAIVONEX điều trị bệnh vảy nến thể thơng thường Tạp chí khoa học cơng nghệ 89(01/2): - 7 Zheng SX, et al (2004) In situ crosslinkable hyaluronan hydrogels for tissue engineering Biomaterials, 25, 1339-1348 Ngày nhận báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ – Y tế Công cộng ... cứu tính tương hợp sinh học keo sinh học HA/PVPA mơ hình da chuột Vì muốn xem tính chất tương hợp hỗn hợp keo keo dùng thí nghiệm keo lấy nước hồn tồn phương pháp đơng khơ Thiết kế nghiên cứu Keo. .. tạo keo tính chất tương hợp tế bào nghiên cứu nghiên cứu trước Trong này, chúng tơi khảo sát khả tương thích keo HA-PVPA mơ hình chuột ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu. .. đó, nhu cầu loại vật liệu sinh học có đầy đủ ưu điểm cần thiết dễ sử dụng, tính tương hợp sinh học cao cao(3) Polymer sinh học nguồn tự nhiên tổng hợp lĩnh vực nghiên cứu nhiều hứa hẹn để thỏa