Nghiên cứu tính phù hợp sinh học,kháng khuẩn và khả năng liền mô của keo phẫu thuật lepamed

Tuy nhiên, ngoài mét sè yếu tố cơ học cần phải có như độ kết dính,khả năng polymer hoá, tất cả các loạikeo khi đưa vào cơ thể phảikhôngđộc với tế bào,không gây nhiễm khuẩn, có tính phù h

2008, Viện trang thiết bị và công trình Y tế thuộc bộ Y tế (Việt Nam) đã sảnxuất thành công keo phẫu thuật LEPAMEDvới sự giúp đỡ của chuyên gia Nga.

Bên cạnh tác dụng cầm máu thay cho dùng kẹp, khâu, đốt điện hoặcdùngcác hoạt chất sinh học dạng keo cú chứa thrombin, keo sinh học tổnghợp còn có tác dụng bịt kín vết thương mà không cần khâu, giúp bệnh nhânrót ngắn thời gian nằm viện do chê cắt chỉ Keo sinh học có thể giúp các Bác

sĩ trong mét sè thao tác khó hoặc trong phẫu thuật nội soi Nếu sử dụngđúng, vết thương sẽ có sẹo đẹp, đảm bảo tính thẩm mỹ cao

Tuy nhiên, ngoài mét sè yếu tố cơ học cần phải có như độ kết dính,khả năng polymer hoá, tất cả các loạikeo khi đưa vào cơ thể phảikhôngđộc với tế bào,không gây nhiễm khuẩn, có tính phù hợp sinh học cao, cókhảnăng cầm máu vàlàm liền vết thương

Nhằmđánh giá những đặc tính trên của keo Lepamed, chúng tôi tiếnhành nghiên cứu đề tài:

" Nghiên cứu tÝnh phù hợp sinh học, tính kháng khuẩn và khả năng liền mô của keo phẫu thuật Lepamed"

Đề tài nhằm 3 mục tiêu:

tiêuhuyết học, sinh hoá, mô học)của keo phẫu thuật LEPAMED

thuậtLEPAMED.

Những kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung cho các mục tiêunghiên cứu của đề tài cấp Bộ và làm cơ sở cho việc ứng dụng keo phẫuthuật Lepamed trên lõm sàng

2.TỔNG QUAN

2.1 Nguồn gốc, thành phần hoá học, tên gọi.

Keo dán ngoại khoa hay hồ dán sinh học được tìm ra bởi HarryCoover từnhững nămchiến tranh thế giới thứ 2 với mục đích gắn cácvết thương do đạn bắn để cầmmáutạm thời

Trong chiến tranh Việt Nam, 1966, quân đội Mỹ đã sử dụng keo dướidạng xịt để cầm máu vết thương trong khi chuyển thương binh về về BVtuyến sau Keo sinh học được lưu thông trên thị trường từ tháng 2-

1955, với nhiều tên gọi cũng khác nhau nhưng đều dựa trên thành phần hoáhọc giống nhau: Cyanoacrylate.(From Wikipedia)

Keo phÉu thuật LEPAMED do Viện trang thiết bị và công trình y tế

- bộ Y tế Việt Nam chế tạo 2/ 2008 dựa trên thành phần hoá học của hồ dánsinh học của LB Nga sulpha-acrylate

Keo phẫu thuật Lepamed hiện chưa được thử nghiệm tại Việt Nam.Thành phần hóa học:

Tên gọi: KEO PHẪU THUẬT LEPAMED

2.2 Mét sè nghiên cứucủa thế giới về keo sinh học

2.2.1.Nghiên cứu thực nghiệm nối khí quản và hàn vết thủng phổi cừu bằng keosinh học Bioglue [7]

Georg W Herget, Mulugeta Kassa.Viện phẫu thuật lồng ngựcFreiburg, Đứcsử dụng24 cừu chia 2 nhóm:

keo Để 2, 4, 12 tuần

Kết quả:

Đại thể: Quan sát đại thể thấy vùng nối kín, tổ chức chặt chẽ trong tất

cả các giai đoạn thời gian

Vi thể: Phản ứng viêm với sự xuất hiện của các tế bào viêm xungquanh vùng keo sau 2 tuần Sau 4 tuần phản ứng mô đặc trưng là mô hạt.Các đặc trưng này không quan sát thấy ở mô cừu dùng chỉ khâu.12 tuầnkhông còn thấy dấu hiệu phản ứng với vật lạ, không còn mô hạt

Kết luận: Bioglue như một vật liệu hỗ trợ hàn gắn các mối nối khí quản và

và các tổn thương nhu mô phổi cừuvới kích thước bé

2.2.2 So sánh phục hồi đứt dây thần kinh bằng phương pháp khâu cổ điển

và dùng keo dán sinh học.

Jin Y, Dehesdin và Hemet J Labor tạo hình thực nghiệm, U F

R Pháp.Gây tổn thương dây thần kinh hông 70 chuột, 22 chuột được phụchồi bằng phương pháp khâu vi phẫu, 47 bằng keo dán sinh học 1 chết Để

120 ngày Đánh giá mô học,không thấy hình ảnh viêm thải loại vật lạ trongnhóm sử dụng keo [6]

2.2.3 Túm tắt một số nghiên cứu của Cryolife về keo sinh học:

- Phẫu thuật phục hồi đứt động mạch chủ bằng keo Bioglue surrgical adhesive.[7]

Sử dụng26 cừu chia làm 2 nhóm:13 bằng phương pháp khâu nối, 13bằng keo Bioglue Để 90 ngày

Kết quả:Phẫu thuật dùng Bioglue giảm tỷ lệ phải mổ lại từ 30% đến 0%

- Nối động mạch vành bằng keo Bioglue.[7]

Nối các nhánh động mạch chủ ngực trái trên dê bằng keo Đánh giá sausau 24 giờ, 10 tháng, 1 năm Tất cả các chỗ nối liền tốt, lòng không bị chít hẹp.

2.2.4 Nối dây TK bằng keo: So sánh mô học giữa dùngfibrin và keocyanoacrylate.[6]

K Wieken, MD, Angioi Dupprez sử dụng 18 chuộtcống trắng 600g/con), gây mê, bộc lộ dây TK hông to 2 bên Bên trái cắt và nối lại bằngkeofibrin (Tissucol), bên phải bằng keo cyanoacrylate(Glubran) Theo dõiđại thể, vi thể, siêu vi thể sau 1, 2, 3, 4 tuần

(500-Kết quả: dây TK gắn bằng keo cyanoacrylate không thể phục hồi vì gây raphản ứng viêm thải loại vật lạ, làm co rút và xơ hoá

2.2.5 Kết quả nghiên cứu thực nghiệm bước đầu về tính phù hợp sinh học của keo gắn xương [7]

C Heiss, P.Pokinskyj.Khoa chấn thương, Viện Justus-Liebig, LBĐức vàViện vật liệu sinh học Darmstadt, Đứcsử dụng 36 thỏ, chia 4 nhóm:7,21,42 và 84 ngày Mỗi nhóm 3 chứng, 6 thực nghiệm Mỗi thỏ tạo cácmảnh khuyết ở đầu dưới xương đùi sau đó gắn trở lại Nhóm chứng gắnkhông dùng keo, nhóm thực nghiệm gắn bằng keo, thời gian cố định 60 giây,chờ đợi 5 phút Đánh giá vi thể, siêu vi thể

Kết quả: Keo đảm bảo tính phù hợp sinh học cao Các giai đoạn của quátrình liền xương diễn ra đúng qui luật Mảnh ghép liền hoàn toàn sau 84ngày ở cả 2 nhóm chứng và thực nghiệm

2.2.6.Nghiên cứu về độc tính tế bào, tính tương thích máuvà khả năng kháng

khuẩn của hai loại keo phẫu thuật Glubran và Glubran 2 [3]

Đánh giá độc tính tế bào là mét trong những yêu cầu rÊt quan trọngđối với các loại keo chứa cyanoacrylate Mét sè keo chứa các chất methyl,ethyl, alkyl đã được thông báo về khả năng độc với tế bào Ngoài tính độc vềmặt hoá học, các loại keo còn được biết đến với tính độc do sù toả nhiệt củaquá trình polymer hoá Mét sè công trình nghiên cứu cho thấy nhómcyanoacrylate không độc với tế bào trong mét sè nồng độ pha loãng Kết quả

thử nghiệm đối với Glubran và Glubran 2 của Italia, là 2 loại keo đã đượcthương mại hoá, cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào trong nồng độ pha loãng1/ 10 là > 70% [3] Đây được coi là không độc với tế bào.

Về tính tương thích với máu:theo L Montanaro và cộng sự cả hai loạikeo phẫu thuật Glubran và Glubran 2 sau thử nghiệm đều không làm thayđổi có ý nghĩa các chỉ tiêu về hoạt động của prothrombin, fibrinogen, sốlượng hồng cầu, tiểu cầu cũng như công thức bạch cầu [3]

Nhiễm khuẩn là một yếu tố rất quan trọng làm cản trở sự liền vếtthương.Theo Nguyễn Trọng Lưu khi số lượng vi khuẩn vượt quá 100000/1gram mô thì quá trình liền vết thương có thể bị cản trở nghiêmtrọng [1] Bởi vậy, tất cả các vật liệu sinh học khi đưa vào cơ thể đều phảiđảm bảo vô trùng Mét số loại keo dùng trong phẫu thuật đã được đánh giá

là ngoài khả năng vô trùng còn có khả năng ức chế mét số loại vi khuẩn.Theo James V và cộng sù, keo sinh học N - 2 Butylcyanoacrylatecó khảnăng ức chế sự phát triển của mét sè cầu khuẩn gram dương nhưng khônglàm ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gram âm Hai loạikeo hiện đang sửdụng rộng rãi trên thế giới là Glubran và Glubran 2 cũng được thông báo là

có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Tại Việt Nam, chúng tôi chưa tìm thấy một nghiên cứu nào về keo sinhhọc

3 Quá trình liền vết thương và vai trò củanguyên bào sợi [1]

Quá trình liền vết thương là một quá trình rất phức tạp, trải qua 5 giaiđoạnchính với sù tham gia của nhiều loại tế bào vào những thời điểm khácnhau

ĐÔNG MÁU: tiểu cầu, fibrin

VIÊM : bạch cầu trung tính, đại thực bào, lympho bào

TẠO MÔ XƠ: proteoglycan, nguyên bào sơị, collagen

BIỂU MÔ HÓA: tạo mạch

SỬA CHỮA: collagen liên kết chéo, sẹo trưởng thành

Mỗi loại tế bào đảm nhiệm một chức năng trong cả mét qui trình từ khivết thương xuất hiện đến khi vết thương liền hoàn toàn.Tiểu cầu là lọai tếbào đầu tiên đi đến vết thương làm nhiệm vụ cầm máu và khởi phát hàngloạt cho quá trình sửa chữa làm lành vết thương Bạch cầu trung tính đến sau

đó với chức năng thực bào, loại bỏ các mô tổn thương, các dị vật, gây giãnmạch, tăng tính thấm mao mạch, tạo điều kiện cho các tế bào khác có nguồngốc từ máu đi vào vết thương Chúng thường chết theo chương trình sau khi

đã kết thúc nhiệm vụ Nguyên bào sợi là loại TB chiếm ưu thế trong mô liênkết, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc thành lập bé khung của mô liênkết do có khả năng tạo ra các loại sợi liên kết như collagen, elastin,proteoglycan, glycoprotein Nguyên bào sợi đóng vai trò quan trọng trongquá trình tạo sẹo, làm lành vết thương Khi mô liên kết bị huỷ hoại, nguyênbào sợi sẽ di chuyển đến, tăng sinh, tạo ra mét lượng lớn chất nền collagengiúp cho việc cô lập và sửa chữa vết thương.[2]

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

cứu dê và thỏ Sơn Tây cung cấp Thỏ được sử dụng trong nghiên cứuđánh giá các chỉ số về sinh hóa, huyết học, gây sốt và thí nghiệm cácvết thương da vùng lưng.

cung cấp Chuột cống được sử dụng nghiên cứu các vết thương tạng

- Phân lô

 15 thỏ chia 2 lô: 8 con để 1 tuần sau mổ, 7 con để 4 tuần sau mổ.LÊymáu định lượng các chỉ số huyết học, sinh hóa, lấy tiêu bản mô họcsau khi tạo vết thương da có sử dụng keo Lepamed.

cắt gan, 6 xẻ gan) trong đó 8 con sử dụng keo Lepamed dính vếtthương, 4 con chứng (không sử dụng keo)

3.2.Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm trên cơ thể động vật(in vivo) và trong ốngnghiệm(in vitro)

3.3.Cách thức tiến hànhnghiên cứu

3.3.1 Gây sốt thực nghiệm

phút

keoLepamed

Kỹ thuật được thực hiện tại Bộ môn Mô - Phôi trường Đại học Y Hà Nội

3.3.2 Đánh giá độc tính tế bào

loóng ẵ; 1/10; 1/ 20 vào các giếng chứa nguyên bào sợi đã nuôi cấy

Lô chứng(n=15)

Lô 1(n=15)

Lô 2(n=15)Trước dùng keo 5 2 ± 0 3

Kết quả trình bày ở bảng 2 cho thấy: sau 6 ngày và 12 ngày dùng keo,

số lượng hồng cầu thay đổi có ý nghĩa ở 2 lô so với lô chứng (p<0.05)

Lô chứng(n=15)

Lô 1(n=15)

Lô 2(n=15)Trước dùng keo 61 0 ± 2 4

MCV được tính bằng tổng thể tích của hồng cầu chia cho số lượnghồng cầu Thể tích trung bình hồng cầu phản ánh đặc điểm của tình trạngthiếu máu

Kết quả trình bày ở bảng 3 cho thấy: thể tích hồng cầu thỏ ở cả 2 lôsau dùngkeo 6 ngày và 12 ngày, thay đổi không có ý nghĩa so với lô chứng (p>0.05)

Lô chứng(n=15)

Lô 1(n=15)

Lô 2(n=15)

H.5 Lepamed kháng với S pneumoniae Đường kính vùng 2: 39mm

H.6.Lepamed không kháng với E.Colli Không có vùng 2

4 4 2 Vết thương cắt bỏ mét phần thùy gan vùng ngoại vi

Cắt bỏ mét phần thùy gan vùng ngoại vi, mặt cắt còn lại chảy máunhiều (H 10 A) Tuy nhiên sau khi được phủ một lớp keo Lepamed trongkhoảng 10 giây, lớp keo đông đặc lại, mặt cắt ngay lập tức không còn chảymáu (H 10 B)

A B

H.9.Vết cắt gan

A Chưa phủ keo Lepamed B Phủ keo Lepamed sau 10 giây

4 4 3 Vết thương xẻ dọc thùy gan

Tại hai bê mép vết thương, mét lớp keo Lepamed máng được đưa vào,khép hai bê méo vết thương bằng hai ngón tay, để khoảng 10 giây, hai mépvết thương dính liền, không còn chảy máu (H11 A,B)

A B

H.10 Vết thương xẻ dọc thùy gan

A Chưa phủ keo Lepamed; B Đã phủ keo Lepamed

H 14 Hình ảnh vi thể vết thương da thỏ dùng keo Lepamed sau 1 tuần thí nghiệm

4 4 4 2.Vết thương da thỏ vùng lưng sau 4 tuần thí nghiệm

- Ở vết thương không dùng keo Lepamed

Vết thương đã liền hoàn toàn Chân bì và hạ bì mô liên kết phát triển,nhú chân bì cao, rất Ýt lông Biểu mô dày gồm nhiều hàng tế bào sừng, pháttriển mạnh hơn, dày hơn vùng chung quanh vết thương (H 15)

H 15 Hình ảnh vết thương da thỏ không dùng keo sau 4 tuần thí nghiệm.(H E x50)

- Ở vết thương da có dùng keo Lepamed

Biểu mô mới sinh dày hơn biểu mô vùng xung quanh Nhú chân bìphẳng, chân bì chủ yếu là mô liên kết, rất Ýt các côm nang lông (H 16)

H.16 Hình ảnh vi thể vết thương da thỏ có dùng keo Lepamed sau 4 tuần

thí nghiệm (H E x 50)

4 4.5.Hình ảnh phục hồi vết thương gan chuột cống trắng sau 4 tuần thí nghiệm

-Vết xẻ dọc thùy gan không phủ keo Lepamed

Hai mép đường xẻ đã liền hoàn toàn bởi một mô liên kết mỏng

Mô gan xung quanh dải mô liên kết bình thường Đỉnh mép vết thương môliên kết dày hơn hẳn và tiếp nối với bao xơ của gan (H 17 H E x50)

H 17 Hình ảnh vi thể vÕt thương gan chuột sau xẻ 4 tuần không phủ keo

Lepamed (H E x50)

đường xẻ cũng đã liền hoàn toàn, liên kết với nhau bởi một dải mô liênkết mỏng Các tế bào gan quanh vết thương hoàn toàn bình thường ( H4.10A H E x 50 B H E x 200)

ượng keo trong một lần sử dụng là rất cần thiết, sao cho lớp keo càngmỏng càng tốt

4.3 Các chỉ sè huyết học và hóa sinh

Kết quả 2 lần xétnghiệm máu trên 15 thỏcách nhau

6 ngày (6; và 12 ngày)cho kết quả khác biệt không có ý nghĩa thống kê sovới các mẫu máu trước khi sử dụng keo Chúng tôi đặc biệt chú ý đến cácchỉ số về hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, các men gan Tuynhiên chúng tôi cóghi nhận sự khác biệt về số lượng vàhuyết sắc tố hồng cầu (giảm) giữa nhómchứng (trước khi sử dụng keo) và hainhóm sử dụng keo Đề nghị tiếp tụcnghiên cứu thêm.Còn các chỉ số khác, đặc biệt là bạch cầu (số lượng, côngthức), các men gan - đây là những chỉ số có liên quan nhiều đến khả năngphù hợp sinh học của vật liệu đều thay đổi không có ý nghĩa thống kê.Kếtquả này của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả của L Montanaro và cộng

sự đã nghiên cứu trên hai loại keo phẫu thuật là Glubran và Glubran 2 [3]

Vì qui mô của đề tài có hạn nên chúng tôi chưa có điều kiện nghiờncứu ảnh hưởng của keo lên thời gian hoạt húacủa prothrombin và fibrinogen

4.4 Khả năng kháng khuẩn của keo Lepamed

Trên thực tế sử dụng, chúng tôi nhận thấy tất cả các vết thương có sửdụng keo Lepamed trong ổ bụng cũng như ngoài da đều khô, không chảy

mủ, dịch Mặc dù trước khi sử dụng keo không được hấp, sấy tiệt trùng

Các kết quả nghiên cứu vi sinh vật bằng phương pháp khuyếch tántrên thạch cho thấy keo Lepamed cho hai vùng kháng khuẩn Vùng 1 do tácđộng cơ học của sự polymer húa gây ra làm ức chế sự phát triển đối với tất

cả các vi khuẩn Vùng này không sử dụng để đánh giá khả năng kháng

khuẩn của keo Vùng hai cho thấy Lepamed có khả năng ức chế sự phát

triểncủa3 loại cầu khuẩn gram dương:S.aureus; S.epidermidis; S pneumoniae.

Tuy nhiên kÕt quả còng cho thấyLepamed không có khả năng kháng với các 2

loại vi khuẩn gram âm là E coli và P aeruginosa Nội dung nghiên cứu này

chúng tôi dựa

theo phương pháp của James V và cộng sự trên keo N - 2Butylcyanoacrylate.[4] Kết quả của chúng tôi còng phù hợp với kết quả củanhóm tác giả này Tuy nhiên đường kính vùng 2 của chúng tôi lớn hơn

4 5 Khả năng cầm máu và kết dínhvết thương

Hình ảnh trên các vết thương da sau khi cắt, thấm máu nhanh và phủkeo Lepamed sau đó đưa hai mép vết thương áp sát vào nhau, giữ trongvòng 30 giây cho thấy vết thương gần như hoàn toàn không còn chảy máunhờ miệmg vết thương đã bịt kín do sù kết dính của keo, trong khi các vếtthương không dùng keo máu vẫn chảy (H.9, A,B) Thử nghiệm nàychứng tỏLepamed có khả năng cầm máu rất tốt đối với các mô da, tổ chứcdưới da Tuy nhiên, đối với các mô chứa nhiều máu như gan, các thao tácthường gặp khó khăn do máu chảy nhiều Mặt khác, do thời gian polymerhóa của keo để tạo ra sù kết dính khá nhanh nên phẫu thuật viên cần kết hợpmét lóc 3 động tác: thấm máu, nhá keo và Ðp hai mép vết thương hoặc dànđều keo lên mặt cắt (H 10,11) Vết thương da và mô mềm nếu có chiều dàivượt quá 2cm, nên khâu tăng cường, không nên chỉ dùng một mình keo

4.6.Các kết quả đại thể, vi thể mô thử nghiệm

- Đối với các vết thương da sau 1 tuần đã có biểu hiện liền đối với cảhai nhóm có sử dụng keo và không sử dụng keo Tất cả các vết thương đềukhô, không chảy dịch, không có mủ, không sưng tấy, phù nề Mặt dưới da vàvùng cơ dưới da thử nghiệm không có biểu hiện khác thường Dưới kínhhiển vi quang học, bằng phương phỏp nhuộm 2 màu Hematoxylin và Eosin,vùng da rạch có sử dụng keo để dính 2 mép vết thương, sau 1 tuần cấu trúc

đã được tái tạo gần như hoàn toàn Các tế bào lớp đáy tăng sinh làm cho