Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu môi trường nuôi cấy In vitro cây bình vôi (Stephania spp) (Luận văn thạc sĩ)

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN 34 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Thongkham LAPHASY NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BÌNH VƠI (Stephania spp) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, NĂM 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Thongkham LAPHASY NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BÌNH VƠI (Stephania spp) Chun ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Thanh Nhàn THÁI NGUYÊN, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu mơi trường ni cấy in vỉtro Bình vơi (Stephania spp)” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Mọi kết thu trung thực, không chép từ kết nghiên cứu khác Tất tham khảo kế thừa trích dẫn đầy đủ Thái Nguyên, tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Thongkham LAPHASY Xác nhận BCN Khoa Sinh học Xác nhận cán hướng dẫn TS Phạm Thị Thanh Nhàn i ii LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều cá nhân, quan đơn vị Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn, người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn hỗ trợ Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09 Tôi xin cảm ơn thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, phận Sau đại học Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, Hứa Quỳnh Liên cán phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện cho tiến hành luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, đồng nghiệp bạn bè tạo điều kiện, giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Thongkham LAPHASY ii iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Bình vơi 1.2 Giá trị dược liệu Bình vơi ………………… …………… 1.2.1 Các hợp chất alkaloid Bình vơi………… 1.2.2 Hợp chất rotundin tình hình nghiên cứu dược chất Bình vơi………………………………………………………………………… 1.3 Một số phương pháp nhân giống Bình vơi ………… …… 13 1.3.1 Nhân giống Bình vơi tự nhiên ……………………….… 13 1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật nghiên cứu bảo tồn nguồn gen Bình vơi ……………………………………………… 14 1.3.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật ……………… 14 1.3.2.2 Vai trò chất kích thích sinh trưởng tái sinh in vitro ……………………………………….……………………….……… 15 1.3.2.3 Các phương pháp nhân giống in vitro …………………………… 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.2 Hóa chất thiết bị ….………………… 20 iii iv 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Các phương pháp nghiên cứu …… 20 2.2.1.Pha môi trường hấp khử trùng môi trường nuôi cấy……………… 20 2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu cấy …………………………………… 21 2.2.3 Phương pháp ni cấy in vitro Bình vơi …………………………… 21 2.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi Bình vơi … 21 2.2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tạo chồi Bình vôi 22 2.2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vơi …… 22 2.2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi …… 23 2.2.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng chất phụ da đến khả sinh trưởng phát triển Bình vơi …………………………………………… 24 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu … ……………………………………… 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu ……………………………… 25 3.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro Bình vơi hoa đầu … 27 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm cytokinin đến tạo chồi Bình vơi hoa đầu …… ………………………………………………………… 27 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi Bình vơi hoa đầu …………………………………………………………………………… 27 3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tạo chồi Bình vơi hoa đầu ……………………………………………………………………… 29 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm auxin đến khả tạo rễ Bình vơi hoa đầu ……………………………………………………………………… 31 3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vơi hoa đầu …………………………………………………………………………… 31 3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi hoa đầu …………………………………………………………………………… iv 32 v 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến khả sinh trưởng phát triển Bình vôi hoa đầu ……………………… 33 3.3 Nghiên cứu mơi trường ni cấy in vitro Bình vơi tím ……… 35 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm cytokinin đến tạo chồi Bình vơi tím …… ……………………………………………………………… 35 3.3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi Bình vơi tím 35 3.3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả tạo chồi Bình vơi tím…………………………………………………………………………… 37 3.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin với nồng độ tối ưu đến sinh trưởng chồi Bình vơi tím ………………………………………… 40 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm auxin đến khả tạo rễ Bình vơi tím ……………………………………………………………………… 41 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vơi tím 41 3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi tím 42 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến khả sinh trưởng phát triển Bình vơi tím ……………………… 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v vi NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic BAP - Benzyl Amino Purin CT Công thức ĐC Đối chứng IBA Indoly Butyric Acid Kinetin - Fururolamino purine Axit – Indolebutyric Khử trùng KT MS Murashige and Skoog NAA α - Naphthalen Acetic Acid Mơi trường MS Thí nghiệm TN vi vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Mặt trước sau Bình vơi tím ………………………… Hình 1.2 Cây Bình vơi hoa đầu ………………………………………… Hình 1.3 Cấu trúc hóa học L-tetrahydropalmatin …………………… 12 Hình 3.1 Chuẩn bị mẫu …………………………………………………… 26 Hình 3.2 Mẫu tái sinh môi trường MS bổ sung nước dừa … 26 Hình 3.3 Chồi Bình vơi hoa đầu mơi trường NC2 …………………… 29 Hình 3.4 Chồi Bình vơi hoa đầu mơi trường Ki1 ……………………… 30 Hình 3.5 Ảnh hưởng BAP đến tạo chồi Bình vơi tím sau tuần … 37 Hình 3.6 Ảnh hưởng kinetin đến tạo chồi Bình vơi tím sau tuần 39 Hình 3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP 2,0 mg/l kinetin 1,5 mg/l đến khả tạo chồi Bình vơi tím sau tuần ni cấy …………………………… 40 Hình 3.8 Ảnh hưởng NAA đến rễ Bình vơi tím sau tuần …… 42 Hình 3.9 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ Bình vơi tím sau tuần 43 vii viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học số alkaloid Bình vơi ………… Bảng 1.2 Kết khử trùng Bình vơi từ đoạn thân non sau tuần nuôi cấy ………………………………………………………………… 25 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi Bình vơi hoa đầu … 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến khả tạo chồi Bình vơi hoa đầu 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vôi hoa đầu …… 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi hoa đầu … 33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả sinh trưởng phát triển Bình vơi hoa đầu …………………………………………… 34 Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi Bình vơi tím ……… 36 Bảng 3.8 Ảnh hưởng kinetin đến khả tạo chồi Bình vơi tím …… 38 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vơi tím ………… 41 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi tím …… 43 Bảng 3.11 Ảnh hưởng than hoạt tính đến sinh trưởng Bình vơi 44 viii 36 liên tục lần lấy số liệu: sau tuần 1,73; sau tuần 3,92; sau tuần 7,03 Các tiêu lại như: Chiều cao chồi, màu sắc lá, màu sắc thân cho thấy mẫu sinh trưởng bình thường Bảng 3.7 Ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi Bình vơi tím Cơng thức Nồng độ môi trường BAP (mg/l) ĐC NC1 0,5 NC2 NC3 1,0 1,5 NC4 NC5 2,0 2,5 ĐC NC1 NC2 NC3 0,5 1,0 1,5 NC4 NC5 2,0 2,5 ĐC NC1 NC2 NC3 0,5 1,0 1,5 NC4 NC5 2,0 2,5 Tỷ lệ mẫu Số chồi/mẫu tạo chồi (%) Sau tuần 100 1,31 ± 0,04 100 1,40 ± 0,03 Chiều cao chồi (cm) 7,26 ± 0,12 7,33 ± 0,05 1,43 ± 0,14 1,50 ± 0,05 7,52 ± 0,05 6,21 ± 0,04 100 100 Sau tuần 100 100 100 100 1,73 ± 0,06 1,32 ± 0,04 3,89 ± 0,04 4,11 ± 0,05 1,43 ± 0,09 1,50 ± 0,14 1,53 ± 0,14 1,63 ± 0,12 8,33 ± 0,13 8,81 ± 0,04 8,60 ± 0,11 7,58 ± 0,06 100 100 Sau tuần 100 100 100 100 3,92 ± 0,07 1,67 ± 0,04 4,17 ± 0,05 5,21 ± 0,04 1,5 ± 0,08 1,62 ± 0,15 1,98 ± 0,07 2,66 ± 0,13 10,42 ± 0,12 10,88 ± 0,04 9,62 ± 0,05 8,30 ± 0,06 7,03 ± 0,19 2,69 ± 0,15 5,69 ± 0,05 6,84 ± 0,07 100 100 100 100 Như vậy, phạm vi nghiên cứu đề tài, nồng độ BAP 2mg/l có hiệu cao việc tạo đa chồi BAP Bình vơi tím Chồi sinh trưởng mơi trường có đường kính nhỏ sinh trưởng 36 37 môi trường ĐC, NC1, NC2, NC3, NC5 tập trung dinh dưỡng để tạo đa chồi So sánh với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Tình cộng (đạt 3,9 chồi/ mẫu môi trường MS bổ sung BAP nồng độ tối ưu 0,5mg/l) cho thấy, kết nghiên cứu khác nồng độ kích thích sinh trưởng BAP tối ưu [20] Có thể khác hóa chất, thao thác ni cấy dẫn đến khác biệt Tuy nhiên, tỷ lệ đa chồi sức sống mẫu nuôi cấy đạt tốt so với nghiên cứu tác giả trên, thể hình 3.5 Hình 3.5 Ảnh hưởng BAP đến tạo chồi Bình vơi tím sau tuần 3.3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng kinetin đến khả tạo đa chồi Bình vơi tím Tương tự BAP, kinetin chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, có khả kích thích tạo đa chồi sử dụng phổ biến 37 38 Cắt thân Bình vơi tím thành đoạn chồi có kích thước từ - cm Các mẫu cắt bỏ lá, đem cấy vào mơi trường MS có bổ sung kinetin nồng độ khác Mỗi công thức môi trường cấy 30 chồi Theo dõi sinh trưởng khả tăng tạo đa chồi Bình vơi tím sử dụng kinetin Kết theo dõi sau tuần, tuần, tuần thể bảng 3.8, hình 3.6 Bảng 3.8 Ảnh hưởng kinetin đến khả tạo chồi Bình vơi tím Cơng thức Nồng độ mơi trường Kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Sau tuần ĐC 100 1,31 ± 0,04 6,26 ± 0,12 Ki1 0,5 100 1,26 ± 0,09 6,23 ± 0,15 Ki2 1,0 100 1,37 ± 0,04 5,52 ± 0,08 Ki3 1,5 100 1,50 ± 0,05 2,41 ± 0,04 Ki4 2,0 100 1,31 ± 0,16 3,85 ± 0,09 Ki5 2,5 100 1,16 ± 0,04 4,11 ± 0,11 Sau tuần ĐC 100 1,43 ± 0,09 6,33 ± 0,13 Ki1 0,5 100 1,46 ± 0,04 6,78 ± 0,14 Ki2 1,0 100 1,49 ± 0,14 6,15 ± 0,12 Ki3 1,5 100 1,83 ± 0,09 2,68 ± 0,16 Ki4 2,0 100 1,53 ± 0,17 3,91 ± 0,15 Ki5 2,5 100 1,21 ± 0,04 4,85 ± 0,05 Sau tuần ĐC 100 1,5 ± 0,08 6,88 ± 0,12 Ki1 0,5 100 1,51 ± 0,11 6,22 ± 0,14 Ki2 1,0 100 1,88 ± 0,05 6,35 ± 0,09 Ki3 1,5 100 3,74 ± 0,06 3,77 ± 0,07 Ki4 2,0 100 2,47 ± 0,09 3,96 ± 0,15 Ki5 2,5 100 2,12 ± 0,05 4,92 ± 0,08 38 39 Trong thí nghiệm này, nghiên cứu ảnh hưởng kinetin đến khả tạo đa chồi Bình vơi tím tiến hành qua công thức môi trường Nồng độ kinetin sử dụng 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l 2,5 mg/l Kết bảng 3.8 cho thấy với nồng độ kinetin nghiên cứu cho tỷ lệ mô tạo chồi 100%, tỷ lệ số chồi/mẫu cao môi trường đối chứng Trong đó, cơng thức mơi trường nồng độ kinetin 1,5mg/l cho tỷ lệ số chồi/mẫu cao (1,5 chồi/mẫu tuần 3; 1,83 chồi/mẫu tuần 5; 2,74 chồi/mẫu tuần 7) Chiều dài cuống lá, màu sắc màu sắc thân công thức môi trường Ki cho thấy mẫu sinh trưởng tốt Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, nồng độ kinetin 1,5 mg/l có hiệu việc tạo đa chồi Bình vơi tím kinetin Hình 3.6 Ảnh hưởng kinetin đến tạo chồi Bình vơi tím sau tuần 39 40 So với môi trường bổ sung BAP mơi trường bổ sung kinetin thu tiêu thấp ảnh hưởng nồng độ kinetin đến phát triển Bình vôi không rõ rệt BAP Cũng nhiều đối trường khác, Bình vơi thích hợp với mơi trường nuôi cấy bổ sung thêm BAP để tạo đa chồi 3.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP kinetin với nồng độ tối ưu đến sinh trưởng chồi Bình vơi tím Chúng tơi nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp chất kích thích sinh trưởng với nồng độ tối ưu đến phát sinh chồi Bình vơi tím BAP kinetin chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokynin Theo nhiều kết nghiên cứu BAP kinetin ảnh hưởng đến tạo chồi sinh trưởng chồi Tuy nhiên tác động chúng lên đối tượng thực vật đến tạo chồi sinh trưởng chồi có khác Các đoạn thân cắt với kích thước 1,5 cm – 2,0 cm ni cấy mơi trường MS có bổ sung 200 ml/l nước dừa, chất kích thích sinh trưởng kinetin BAP với nồng độ tối ưu Kết nghiên cứu cho thấy, số chồi trung bình đạt 2,86 chồi/mẫu sau tuần nuôi cấy với phương sai nhỏ 0,14 chiều cao trung bình mẫu cấy đạt 5,01 cm với phương sai nhỏ 0,09 Hình 3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP 2,0 mg/l kinetin 1,5 mg/l đến khả tạo chồi Bình vơi tím sau tuần ni cấy So sánh với môi trường bổ sung riêng rẽ BAP kinetin, mơi trường bổ sung tổ hợp kích thích sinh trưởng BAP kinetin với nồng độ tối 40 41 ưu cho hệ số nhân thấp Môi trường bổ sung BAP 2,0 mg/l có số chồi/mẫu đạt tối đa 7,03 chồi/mẫu Mơi trường bổ sung kinetin 1,5 mg/l có số chồi/mẫu đạt tối đa 2,74 chồi/mẫu Tuy nhiên, sử dụng công thức môi trường tổ hợp cho chiều cao chồi tốt 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm auxin đến tạo rễ Bình vơi tím 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vơi tím Các chồi đỉnh Bình vơi tím ni cấy mơi trường có chứa NAA nồng độ khác để nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hình thành rễ Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Bình vơi tím Cơng thức Nồng độ Tỷ lệ chồi môi trường (mg/l) rễ (%) Số rễ/ chồi Chất lượng rễ Sau tuần ĐC 0 NAA1 0,3 12,43 0,55 ± 0,05 - NAA2 0,6 22,22 0,67 ± 0,31 + NAA3 0,9 0 Sau tuần ĐC 0 NAA1 0,3 10,32 0,61 ± 0,17 - NAA2 0,6 33,13 1,20 ± 0,09 + NAA3 0,9 0 (-): Rễ mảnh ; (+): Rễ nhiều mảnh Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến hình thành rễ Bình vơi tím công thức môi trường với nồng độ NAA tương ứng 0,3; 0,6; 0,9 mg/l Cây môi trường tạo đa chồi sử dụng để cắt lấy chồi, chồi cao khoảng - cm, cắt bỏ bớt lá, cấy vào môi 41 42 trường tạo rễ Mỗi công thức môi trường cấy 30 chồi Theo dõi hình thành rễ chồi sau tuần tuần Kết theo dõi thể bảng 3.9, hình 3.8 Kết bảng 3.9 cho thấy, có cơng thức NAA1 kích thích Bình vơi tím rễ với tỷ lệ chồi rễ thấp Cụ thể, cơng thức NAA1 có tỷ lệ chồi rễ 10,32% tuần 8, cho rễ mảnh, nồng độ NAA 0,3 mg/l đủ để kích thích rễ Bình vơi tím Khi tăng dần nồng độ NAA đến 0,6 mg/l tỷ lệ chồi rễ tăng dần đạt cao công thức môi trường NAA2 với tỷ lệ chồi rễ 22,22% tuần 33,13% tuần Công thức NAA3 với nồng độ 0,9 mg/l gây ức chế khả tạo rễ Bình vơi tím Vậy, phạm vi nghiên cứu đề tài, nồng độ NAA thích hợp để tạo rễ bình vơi 0,6 mg/l Hình 3.8 Ảnh hưởng NAA đến rễ Bình vơi tím sau tuần Kết cho thấy, khả kích thích rễ chồi Bình vơi tím NAA chưa cao 3.3.2.2.Nghiên cứu ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi tím IBA chất kích thích rễ sử dụng rộng rãi có hoạt tính cao Do đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khả kích thích rễ IBA Bình vơi tím Các mẫu chồi Bình vơi tím nghiên cứu khả tạo rễ IBA IBA bổ sung vào môi trường MS với nồng độ: 0,3; 0,6; 0,9 mg/l tương ứng với công thức môi trường IBA1, IBA2, IBA3 Các tiêu ghi lại sau tuần tuần, kết nghiên cứu ghi bảng 3.10 42 43 Kết bảng 3.10 cho thấy, công thức IBA1, IBA2, IBA3 kích thích Bình vơi tím rễ với tỷ lệ chồi rễ thấp Trong đó, công thức IBA1 với tỷ lệ chồi rễ cao 18,84% tuần 20,01% tuần 8, số rễ/chồi cao đạt 2,33 tuần 2,75 tuần Công thức IBA2 IBA3 có nồng độ IBA cao lại cho tỷ lệ chồi rễ thấp dần tăng nồng độ Mơi trường có IBA 0,9 mg/l cho tỷ lệ chồi rễ thấp (5,67 %) cho rễ mảnh Ở nồng độ IBA gây ức chế khả tạo rễ Bình vơi tím Bảng 3.10 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Bình vơi tím Cơng thức Nồng độ Tỷ lệ chồi môi trường (mg/l) rễ (%) Số rễ/ chồi Chất lượng Sau tuần ĐC 0 IBA1 0,3 18,84 2,33 ± 0,19 ++ IBA2 0,6 9,67 1,17 ± 0,18 + IBA3 0,9 4,33 1,00 ± 0,03 - Sau tuần ĐC 0 IBA1 0,3 20,01 2,75 ± 0,14 ++ IBA2 0,6 10,11 1,33 ± 0,06 + IBA3 0,9 5,67 1,14 ± 0,07 - (-): Rễ mảnh; (+): Rễ nhiều mảnh; (++): Rễ nhiều mập Hình 3.9 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ Bình vơi tím sau tuần 43 44 Như vậy, phạm vi nghiên cứu đề tài, nồng độ IBA thích hợp để kích thích tạo rễ Bình vơi tím 0,3 mg/l 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng than hoạt tính đến sinh trưởng, phát triển Bình vơi tím Than hoạt tính với nồng độ 1,0 g/l bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS có bổ sung nước dừa 200 ml/l + BAP 2,0 mg/l + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l (TN) Môi trường đối chứng MS + BAP 2,0 mg/l + sucrose 30 g/l + agar 8,5 g/l + nước dừa 200 ml/l (ĐC) Bảng 3.11 Ảnh hưởng than hoạt tính đến sinh trưởng Bình vơi tím Cơng Nồng độ than thức hoạt tính (g/l) tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu Số chồi/mẫu Chiều dài chồi (cm) Hình thái chồi Sau tuần ĐC 100 1,71 ± 0,05 1,39± 0,05, Xanh đậm, khỏe TN 1,0 100 1,71 ± 0,04 2,05 ± 0,05 Xanh, khỏe Sau tuần ĐC 100 3.28 ± 0,27 2,16 ± 0.17 Xanh đậm, khỏe TN 1,0 100 2.13 ± 0,12 2,93 ± 0.12 Xanh đậm, khỏe Sau tuần ĐC 100 6,05 ± 0,17 1,13± 0,21 Xanh đậm, khỏe TN 1,0 100 2,48 ± 0,11 3,51 ± 0,21 Xanh đậm, khơẻ Kết bảng 3.11 cho thấy nồng độ than hoạt tính nghiên cứu cho tỷ lệ mô tạo chồi 100% Công thức môi trường với nồng độ than hoạt tính 1,0 g/l cho số chồi/mẫu thấp ĐC liên tục lần lấy số liệu: sau tuần 1,71; sau tuần 2,13; sau tuần 2,48 Các tiêu lại như: chiều cao chồi, hình thái chồi cho thấy mẫu sinh trưởng tốt Việc bổ sung vào mơi trường than hoạt tính với nồng độ 1,0 g/l làm mơi trường “tối” nên tạo điều kiện nuôi cấy tương tự đất,loại bỏ 44 45 hợp chất gây độc in vitro tiết ra, giúp dễ dàng phát triển hấp thu chất dinh dưỡng môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, kết lô ĐC cho thấy, môi trường có than hoạt tính khơng phù hợp cho sinh trưởng phát triển Bình vơi tím in vitro 45 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu hiệu là: cắt lấy - cm đoạn thân non chứa chồi ngủ, rửa đoạn thân vòi nước máy, ngâm mẫu dung dịch xà phòng lỗng 30 phút, rửa mẫu vòi nước máy lắc dung dịch HgCl2 0,1% phút, rửa mẫu - lần nước cất khử trùng 1.2 - Môi trường nuôi cấy in vitro Bình vơi hoa đầu phù hợp là: Cơng thức mơi trường tạo đa chồi Bình vơi hoa đầu MS + agar 8,5 g/l + sucrose 30 g/l + than hoạt tính g/l + nước dừa 200 ml/l + BAP 1,0 mg/l - Công thức môi trường tạo rễ Bình vơi hoa đầu MS + agar 8,5g/l + sucrose 30 g/l + than hoạt tính g/l + nước dừa 200 ml/l + IBA 0,1 mg/l - Mơi trường bổ sung than hoạt tính (1 g/l) phù hợp cho sinh trưởng, phát triển in vitro 1.3 - Môi trường nuôi cấy in vitro Bình vơi tím phù hợp là: Cơng thức mơi trường tạo đa chồi Bình vơi tím MS + agar 8,5 g/l + sucrose 30 g/l + nước dừa 200 ml/l + BAP mg/l - Cơng thức mơi trường tạo rễ Bình vơi tím MS + agar 8,5 g/l + sucrose 30 g/l + nước dừa 200 ml/l + IBA 0,3 mg/l - Mơi trường bổ sung than hoạt tính (1 g/l) không phù hợp cho sinh trưởng, phát triển in vitro Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân in vitro Bình vơi đưa trồng ngồi tự nhiên - So sánh hàm lượng hoạt chất rotundin từ phận khác tự nhiên in vitro 46 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bộ khoa học công nghệ, Viện khoa học công nghệ Việt Nam (1996), Sách đỏ Việt Nam, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Hà Nội, 258 - 264 [2] Bùi Thị Bằng (2006), Các phương pháp hóa lý ứng dụng phân tích kiểm nghiệm dược liệu, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [3] Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách rotundin từ củ số lồi Bình vơi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế rotundin sulfat để bào chế thuốc tiêm, NXB Đại học Cần Thơ, trang - [4] Ngô Quang Đại (1999), “Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vơi”, Tạp chí cơng nghệ hóa chất, số 12, trang [5] Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học kĩ thuật [6] Phạm Thanh Kỳ (1998), Nghiên cứu số dược liệu có tác dụng lên thần kinh trung ương làm thuốc, NXB Đại học Dược Hà Nội, trang 11-12 [7] Bùi Kim Liên Phạm Thanh Kỳ (2012), “Góp phần nghiên cứu hình thái lồi Bình vơi Nghĩa Bình”, Tạp chí dược học số, 5: - [8] Dương Hữu Lợi (1996), “Nghiên cứu hoạt chất từ củ Bình vơi’, Tạp chí y học Việt Nam, số 1, trang 14 – 23 [9] Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 779-781 [10].Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt (2014), “Ảnh hưởng chất bổ sung hữu lên trình sinh trưởng phát triển chồi lan Vân Hài (paphiopedilum callosum) nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 52 (1): 49-62 [11].Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại Học Quốc gia Hồ Chí Minh 47 48 [12].Chu Văn Mẫn (2000), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội [13].Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2005), Tài nguyên thực vật Việt Nam Những chứa hợp chất có hoạt tính sinh học tập I, NXB Nơng Nghiệp - Hà Nội, trang 39 - 40, trang 58 - 70 [14].Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Văn Vinh (2011), “Nghiên cứu nhân giống in vitro khảo sát hợp chất alkaloid rotundine từ Bình vơi (Stephania rotunda Lour)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ 49 (4): 51-58 [15].Lê Ánh Nguyệt, Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền Lê Xuân Đắc (2010), “Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh bảo tồn Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv.) vườn quốc gia Cúc Phương”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 26 (2):180 - 186 [16] Sách đỏ Việt Nam năm 2007 - phần thực vật – trang 285 [17].Nguyễn Tiến Thanh (2016), “Bài thuốc từ củ Bình vơi đánh bay bệnh ngủ kiêm niên”, Báo Phụ nữ đời sống, số 5, trang [18].Vũ Đức Thắng (2014), “Điều tra thu thập mẫu củ Bình vơi số tỉnh Việt Nam xây dựng phương pháp định lượng rotundin sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang”, Tạp chí Dược liệu, số 4: 375-380 [19].Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng, NXB Nơng nghiệp Hà Nội [20].Nguyễn Thị Tình, Phạm Thị Thủy, Dương Mạnh Cường, Nguyễn Hữu Thọ, Nguyễn Văn Bảo, Ngơ Xn Bình (2015), “Nhân giống Bình Vơi Tím (Stepharia rotunda Lour) kỹ thuật nuôi cấy đoạn thân” Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, 11: 242-248 [21].Viện dược liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kĩ thuật, trang 88 – 91 48 49 [22].Viện dược liệu (2003), Kỹ thuật trồng thuốc, NXB Y học, trang 3- [23].Đỗ Văn Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [24].Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Hà Nội [25].Nguyễn Tiến Vững (2000), Nghiên cứu thực vật, hóa học tác dụng sinh học số loại thuộc chi Stephania Lour Việt Nam, Luận án tiến sĩ Dược học [26].Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, Bùi Kim Liên, Chu Đình Kính, Trịnh Văn Bảo (1998) , “Tác dụng L-tetrahydropalmatin chiết suất từ củ lồi bình vơi Stephania glabra (Roxb.) Miers lên điện tim điện não thỏ, Tạp chí dược học”, 269: 21-23 Tài liệu tiếng Anh [27].Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignacimuthu S (2008), “Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) A valuable medicinal phant”, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 44(5): 436-441 [28].Mantsch J.R et al (2007), “Levo-tetrahydropalmatine attenuates cocaine self-administration and cocaine- induced reinstatement in rats”, Psychopharmacology, 192 (4): 581-591 [29].Deepak Kurmar Semwal, Ruchi Badoni, Ravindra Semwal, Sudhir Kumar Kothiyal, Gus Jas Preet Singh, Usha Rawat (2010), “The genus Stephania (Menispermaceae): Chemical and pharmacological perspectives”, Journal of Ethnopharmacology, 132: 369- 383 [30].Gamborg O.L., Murashige T., Thorpe T.A and Vasil i.K.(1976), “Plant tissue culture media In vitro”, Cellular and Developmental Biology-Plant, 12:473 - 478 49 50 [31].Murashige T (1980), Plant growth substances in commercial uses of tissue culture, Plant Growth Substances Berlin: Springer-Verlag, pp.42634 [32].Manske R.H.F (1973), The alkaloid- chemistry and Physiology, volume XIV, Academic Press- New York- London [33].Yeu K et al (2014), “L- Stepholidine, a naturally occurring dopamine D1 receptor agonist and D2 receptor antagonist, attenuates heroin selfadministration and cue-induced reinstatement in rats”, Neuro Report, 25 (1): 7-11 Tài liệu website [34].http://text.123doc.org/document/1341795-nghien-cuu-dac-diem-sinhvat-hoc-va-nhan-giong-loai-cay-binh-voi-stephania-rotunda-lour-bangphuong-phap-giam-hom.htm [35].http://www.duoclieu.org/2012/03/binh-voi-stephania-spp-ho-tiet-de.html [36].http://nongnghiep.vn/cay-binh-voi-chua-mat-ngu-post141438.html [37].http://suckhoedoisong.vn/dung-thuoc-an-than-rotundin-sao-cho-hieuqua-n41096.html [38].https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_B%C3%ACnh_v%C3%B4i [39].https://khonggiansinhhoc.com/nuoi-cay-mo-thuc-vat-va-cac-chat-bosung-vao-moi-truong-nuoi-cay-phan-ii/ 50 ... Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro Bình vơi (Stephania spp) Mục tiêu nghiên cứu Xác định công thức môi trường nuôi cấy in vitro phù hợp Bình vơi hoa đầu Bình vơi tím Nội dung nghiên cứu. .. Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu nuôi cấy - Nghiên cứu mơi trường ni cấy in vitro Bình vơi hoa đầu: Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đến khả phát sinh chồi, ảnh hưởng auxin... đến khả sinh trưởng, phát triển in vitro - Nghiên cứu môi trường ni cấy in vitro Bình vơi tím: Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đến khả phát sinh chồi, ảnh hưởng auxin (NAA,