Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây bình vôi (stephania spp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---Thongkham LAPHASY NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BÌNH VÔI Stephania spp Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 L

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-Thongkham LAPHASY

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO

CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-Thongkham LAPHASY

NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO

CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Thanh Nhàn

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vỉtro cây Bình vôi (Stephania spp)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi Mọi kết

quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác Tất cảnhững tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ

Thái Nguyên, tháng 05 năm 2019

Tác giả luận văn

Thongkham LAPHASY Xác nhận của BCN Khoa Sinh học Xác nhận của cán bộ hướng dẫn

TS Phạm Thị Thanh Nhàn

i

LỜI CẢM ƠNTrong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn,người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trongquá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗtrợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09

Tôi xin được cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộphận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại họcThái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóahọc

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, HứaQuỳnh Liên là cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học,Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiệncho tôi tiến hành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân tronggia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi trong

suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, tháng 05 năm 2019

Tác giả luận văn

Thongkham LAPHASY

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Bình vôi 3

1.2 Giá trị dược liệu của cây Bình vôi ……… ……… 7

1.2.1 Các hợp chất alkaloid ở cây Bình vôi………… 7

1.2.2 Hợp chất rotundin và tình hình nghiên cứu về dược chất ở cây Bình vôi……… 9

1.3 Một số phương pháp nhân cây giống cây Bình vôi ………… …… 13

1.3.1 Nhân giống cây Bình vôi trong tự nhiên ……….… 13

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật trong nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây Bình vôi ………

1.3.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ………

1.3.2.2 Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro ……….……….……….

14 14 15 16 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 20

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị ….……… 20

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Các phương pháp nghiên cứu …… 20

2.2.1.Pha môi trường và hấp khử trùng môi trường nuôi cấy……… 20

2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu cấy ……… 21

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy in vitro cây Bình vôi ……… 21

2.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi … 21 2.2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi 22

2.2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi …… 22

2.2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi …… 23

2.2.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ da đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi ……… 24

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu … ……… 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu ……… 25

3.2 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi hoa đầu … 27

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin đến sự tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu …… ……… 27 3.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình

vôi hoa

3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây

Bình vôi

3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi hoa

3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi

iv

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây Bình vôi hoa đầu ……… 33

3.3 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi tím ……… 35

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin đến sự tạo chồi cây Bìnhvôi tím …… ……… 353.3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây Bình vôi tím ……… 44KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleicBAP 6 - Benzyl Amino Purin

NAA α - Naphthalen Acetic Acid

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Mặt trước và sau lá cây Bình vôi tím ……… 6

Hình 1.2 Cây Bình vôi hoa đầu ……… 6

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của L-tetrahydropalmatin ……… 12

Hình 3.1 Chuẩn bị mẫu ……… 26

Hình 3.2 Mẫu cây tái sinh trong môi trường MS bổ sung nước dừa … 26

Hình 3.3 Chồi cây Bình vôi hoa đầu trên môi trường NC2 ……… 29

Hình 3.4 Chồi cây Bình vôi hoa đầu ở môi trường Ki1 ……… 30

Hình 3.5 Ảnh hưởng của BAP đến sự tạo chồi cây Bình vôi tím sau 7 tuần … 37

Hình 3.6 Ảnh hưởng của kinetin đến sự tạo chồi cây Bình vôi tím sau 7 tuần 39

Hình 3.7 Ảnh hưởng của của tổ hợp BAP 2,0 mg/l và kinetin 1,5 mg/l đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi tím sau 7 tuần nuôi cấy 40 Hình 3.8 Ảnh hưởng của NAA đến sự ra rễ cây Bình vôi tím sau 7 tuần …… 42 Hình 3.9 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ cây Bình vôi tím sau 7

1 Lí do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đónguồn dược liệu có vị trí quan trọng về thành phần, chủng loại và giá trị sửdụng đối với đời sống con người Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu,tính đến 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm, 52 loài tảo biển,

408 loài động vật và 75 chất khoáng có công dụng làm thuốc ở Việt Nam.Trong số đó, gần 90 % là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trongcác quần xã rừng, chỉ có gần 10% là cây thuốc trồng Tuy nhiên, việc khaithác các cây dược liệu chưa được tiến hành theo kế hoạch, nhiều bài thuốchay, cây thuốc quý đã bị thất truyền, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sựphong phú loài và nguồn gen trong hệ sinh thái

Giấc ngủ là tiêu chuẩn vàng để đánh giá sức khỏe Mất ngủ gây ranhững tác hại không thể lường trước, khi biến chứng có thể gây tử vong Đây

là một chứng bệnh của xã hội hiện đại với nhiều áp lực lớn Một trong cáccây có tác dụng điều hòa giấc ngủ là cây Bình vôi tím Cây Bình vôi tím có

tên khoa học là Stephania rotunada Lour, họ Tiết dê (Menispermaceae), là

một trong những cây thuốc quý mà thiên nhiên ban tặng cho con người CâyBình vôi tím là một loài dây leo, phần gốc phát triển thành củ to, bám vào núi

đá, có củ nặng tới hơn 40kg, vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá, củcòn gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng” Nguồn dược liệu này chứaalkaloid, được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền và hiện đại ở trongnước và trên thế giới Sử dụng cây Bình vôi chữa được các bệnh như mất ngủ,điều hòa hô hấp, hệ tim mạch, sốt nóng, chữa ung thư, lợi tiểu, hen xuyễn, …

Do có tác dụng chữa bệnh tốt, ít gây độc hại, các sản phẩm từ củ Bình vôi đãđược đưa vào chế biến trong công nghiệp dược phẩm Do vậy, nguồn nguyênliệu tự nhiên đã bị khai thác ngày một nhiều và ngày càng cạn kiệt, và đã được

ghi trong Sách đỏ Việt Nam với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danhmục Thực vật rừng, Động vật

rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thươngmại Do vậy, việc chọn lọc giống cây hết sức quan trọng và là nhiệm vụ cấpthiết trong công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen.

Trong tự nhiên với tình trạng chặt phá rừng như hiện nay, cây Bình vôisinh trưởng thường rất chậm Để vừa đáp ứng được nhu cầu sử dụng dượcliệu, vừa bảo tồn và phát triển loài cây thuốc quý ở Việt Nam, kỹ thuật nuôicấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật có triển vọng ứng dụng lớn, tạo ranhững giống cây trồng sạch bệnh chất lượng tốt, đồng đều và hệ số nhân lớntrong thời gian ngắn Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài

“Nghiên cứu môi

trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi (Stephania spp)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được công thức môi trường nuôi cấy in vitro phù hợp của cây

Bình vôi hoa đầu và Bình vôi tím

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu công thức khử trùng mẫu nuôi cấy

- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi hoa đầu: Nghiên

cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đến khả năng phátsinh chồi, ảnh hưởng của auxin (NAA, IBA) đến sự tạo rễ, ảnh hưởng

của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây in vitro.

- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro cây Bình vôi tím: Nghiên cứu

ảnh hưởng của nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đến khả năng phát sinhchồi, ảnh hưởng của auxin (NAA, IBA) đến sự tạo rễ, ảnh hưởng của

chất than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây in vitro.

1.1 Cây Bình vôi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Theo Form, chi Bình vôi đã biết có khoảng trên dưới 49 loài, phân bố ởnhững vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Vùng phân bố kéo dài từNepal, Ấn Độ, Thái Lan, miền nam Trung Quốc, phía nam Nhật Bản, ViệtNam, Lào, … đến phía đông Australia Số lượng loài đa dạng nhất tập trungtại các tỉnh phía bắc của Việt Nam, Lào, Thái Lan, nam Trung Quốc TạiTrung Quốc có khoảng 20 loài, tại Thái Lan có khoảng 11 loài [6] Các loàiBình vôi có sự khác nhau về hình thái, hàm lượng và thành phần của alkaloid.Những loài Bình vôi hiện có ở nước ta rất đa dạng và phong phú Chúngsinh trưởng trong nhiều loại hình thảm thực vật, trên núi đá vôi, trên đất lẫn

đá, và trên cát ven biển ở một số địa phương Năm 1986, Nguyễn Chiều vàNgô Trại ghi nhận có 11 loài ở Việt Nam [6]

Cây Bình vôi được phân loại khoa học trong hệ thống giới Thực vật cụthể như sau:

Chi Bình vôi, hay chi Thiên kim đằng (Stephania spp), là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê),

có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australia Tên gọi dân dãnhất trong tiếng Việt là Bình vôi Tuy nhiên, nhiều loài có các tên gọiđịa phương có thể trùng nhau

Các loài Bình vôi là cây dây leo, thân thảo, sống lâu năm, phần gốcthường hóa gỗ Chồi và thân non thường nhẵn, có màu xanh đậm, xanh nhạthay xanh bóng Vỏ ngoài thân có những rãnh nứt dọc theo thân hay gờ, nhữngmụn cóc xù xì Thân già có màu xám tro, nâu sẫm, nâu nhạt hay nâu đất sáng.

Rễ củ rất đa dạng, củ thường có dạng hình cầu, hình trụ hay hình bấtđịnh Kích thước và trọng lượng củ cũng rất khác nhau, có loài chỉ khoảng 1 -

3 kg, có loài củ rất nặng tới 80 kg Ruột củ màu vàng nhạt, vàng chanh, trắngngà hoặc nâu đỏ [7]

Lá mọc so le, cuống lá dài khoảng 5 - 10 cm, đính vào phiến lá khoảng1/3 - 1/6 chiều dài lá Phiến lá mỏng, thường nhẵn, có hình khiên nhọn, hìnhtròn hoặc hình tam giác tròn, mép lá nguyên hay hơi chia thùy Gân lá dạngchân vịt gồm từ 8 - 11 gân xuất phát từ đỉnh của cuống lá Chóp lá nhọn hoặcgần tròn, gốc lá tròn hoặc có hình tim Phiến lá màu xanh đậm, xanh vàng nhạthoặc xanh sáng, mặt dưới có màu xanh nhạt hay hơi bạc [7], [38]

Cây Bình vôi có hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa có dạng tán kép, tánđơn, sim tán kép, dạng hình đầu và tán ngù [7], có cuống, đơn độc hay xếptheo kiểu chùm ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đềuhoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [9] Hoa đực thường có cấutạo đối xứng tỏa tròn, đài 6 - 8 rời, xếp thành 2 vòng; 3 - 4 cánh hoa, dạng vỏ

sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2 - 6, thường 4, chỉ nhị dính nhau tạothành ống hình trụ, đầu nhụy xoè thành đĩa tròn Hoa cái thường chỉ gồm 1 láđài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3 - 4 lá đài và 3 - 4 cánh hoa), bầu hình trứng

có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [7], [26]

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt Bầu 2noãn, nhưng chỉ có 1 phát triển thành hạt, còn 1 thoái hóa Ở quả chín, vỏngoài thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Hạt hình móngngựa, hình trứng dẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc

không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai [7] Nhìn chung,chi Bình vôi

rất đa dạng về hình thái, sự đa dạng, phong phú này phụ thuộc vào điều kiệnđất đai, khí hậu nơi sinh sống và đặc tính của từng loài.

Các loài thuộc chi Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyênsinh hay rừng thứ sinh Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21 - 23oC,lượng mưa 2000 - 2500mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5 - 7.Một số loài có thể phân bố ở độ cao 2000 - 2800 m so với mực nước biển.Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa sáng, ưa đất có độ ẩm vừa phải [18]

Các loài Bình vôi hiện ở Việt Nam thường có 2 thời vụ chồi chính trongnăm Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi xuất hiện (trên thân và trên đầucủ) ngay từ tháng 11 - 12 Những chồi này ở trạng thái "chồi ngủ" cho đếnmùa xuân (tháng 1 - 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ trong vòng 1

- 2 tháng, chồi đã dài tới hơn 1m Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhấtcủa cây Bình vôi, vì từ chồi này cây sẽ ra lá, hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân

hè (chồi cấp II) Số lá của chồi cấp II nhiều hơn gấp bội so với chồi đông xuân(tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi) Sự tái sinh chồi mạnh mẽ củacây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đemvùi xuống đất Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốthơn những mảnh khác Người ta có thể lợi dụng khả năng này để nhân giốngcây Bình vôi Trong tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờcôn trùng [9], [18]

Hạt Bình vôi hình móng ngựa, rất nhỏ, khối lượng trung bình 1000 hạtkhoảng 10 – 29 g Hạt thường phát tán nhờ nước Các cá thể Bình vôi trồng từhạt thường sinh trưởng, phát triển nhanh hơn [9], [18]

Cây Bình vôi tím được người dân tộc Tày ở tỉnh Bắc Kạn thường gọi là

“Cà tòm đeng” (có nghĩa là Bình vôi đỏ), tên khoa học Stephania

rotunada Lour Cây Bình vôi tím có giá trị về mặt kinh tế (350000đ/kg củtươi) Cây Bình vôi tím được coi là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của

người dân tộc vùng cao nếu được sự quan tâm và phát triển của các cấp lãnhđạo Bình

vôi tím là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta Câykhông đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao Cây Bình vôi sẽ làcây có tiềm năng lớn trong y học Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạnkiệt và có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên trước việc khai thác tàn phárừng của người dân [1], [6].

Hình 1.1 Mặt trước và sau lá cây Bình vôi tím

Hình 1.2 Cây Bình vôi hoa đầu [nguồn website w ww .24h.c o m .vn ]

Cây Bình vôi hoa đầu có tên khoa học là Stephania cephalantha

Hayata, phân bố ở vùng nhiệt đới Các thành viên của họ chủ yếu là các loàithảo mộc hoặc cây bụi nhưng cây hiếm Các loài thực vật của chi này là thânleo mảnh với lá mỏng Trên thế giới cây có ở Trung Quốc (Quảng Tây,Quảng Đông), Đài Loan Đây là loài có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi

đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng; điểm phân bố ở QuảngNinh đang bị tàn phá (khai thác đá) Cây bị đào rễ để làm thuốc, có nguy cơ

tuyệt chủng cao [16] Bình vôi hoa đầu là một nguồn gen quý hiếm Rễ dùnglàm thuốc an thần, gây

ngủ; còn được dùng làm thuốc thanh nhiệt, giải độc, tiêu phù, giảm đau, honhiều đờm, hen suyễn, khó thở, hạ huyết áp, chống co quắp Phối hợp với các

vị thuốc khác để trị ho lao, sốt rét, kiết lỵ, ngừa lở ngoài da, mụn nhọt Ngàydùng 3-6 g dạng bột hoặc rượu thuốc Tuy nhiên, để tránh ngộ độc, chỉ nên sửdụng với liều nhỏ Người lớn ngày uống từ 3-6 g Y học hiện đại dùng toàncây, cao hoặc alkaloid bào chế thành thuốc thích hợp để làm thuốc an thần[17], [36], [37]

1.2 Giá trị dược liệu của cây Bình vôi

1.2.1 Các hợp chất alkaloid ở cây Bình vôi

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ có chứa nitơ đa số có nhân vòng, cóphản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường

có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốcthử gọi là thuốc thử của alkaloid [32]

Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ.Đôi khi trong cùng một cây thì bộ phận này giàu alkaloid bộ phận khác lạikhông có Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thểthay đổi tùy theo mùa thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng.Trong một cây thường chứa các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau.Đặc biệt trong một số cây có chứa vài chục alkaloid như cây thuốc phiện, câycanhkina Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất hữu

cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [32]

Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, thường ở thểrắn ở nhiệt độ thường Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bayhơi, các alkaloid bay hơi thường ở thể lỏng Các alkaloid ở thể rắn thường làcác chất kết dễ kết tinh và có độ chảy xác định Một số alkaloid không đođược độ chảy do nó bị phá hủy ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy Các alkaloid ởdạng lỏng ở nhiệt độ thường thường không có oxy trong phân tử (nicotin,

spartein) Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạo muối vớiacid thì nó có thể

chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưng spartein sulfat ở thể rắn) Tuynhiên có một và trường hợp ngoại lệ một số alkaloid có oxy trong phân tửnhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin [3], [8].

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chấtrất độc Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khácnhau Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏđược các alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng cónhiều thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chấttổng hợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây Do đó người ta vẫndùng phương pháp chiết xuất từ cây ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin,quinin, eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợpvừa bán tổng hợp ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine,atropine, vincamin [3], [8], [13]

Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chấtđường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ màsinh ra Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vịphóng xạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin Quađịnh tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theodõi sự thay đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây người ta thấy nơitạo ra alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid Nhiều alkaloidđược tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thựchiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt

Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng Đỗ Tất Lợi và P.Bonnet đã pháthiện ra hỗn hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là rotundin, đưa Việt Nam trởthành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin Trong củ bình vôi cóchứa nhiều alkaloid Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhânisoquinolin Trong đó, quan trọng nhất là rotudin (0,2- 3,55%) Hàm lượngalkaloid toàn thân cũng như rotudin thay đổi tùy loài và vùng thu hái [25]

1.2.2 Hợp chất rotundin và tình hình nghiên cứu về dược chất ở cây Bình vôi

Mất ngủ, giấc ngủ không sâu là bệnh của thế giới hiện đại khi con ngườiluôn phải đối mặt với các stress Nhiều người phải tìm đến các loại thuốc gâyngủ hoặc các thuốc hướng tâm thần gây ngủ Giải pháp này tuy có hiệu quả tốtnhưng dễ gây lệ thuộc thuốc, thậm chí gây nghiện và ảo giác Một trongnhững thuốc được quan tâm có nguồn gốc dược liệu, an toàn và ít gây tácdụng phụ là rotundin Các nhà khoa học đã tách chiết được thuốc rotudinsulphat từ củ bình vôi làm thuốc tiêm và được lưu hành trên toàn quốc Sảnphẩm đã được Cục Sở hữu trí tuệ cấp bằng độc quyền sáng chế và giải thưởngsáng tạo khoa học

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của một số alkaloid ở cây Bình vôi

Chống sốt rét Dehydroroemerine,tetrahydropalmatine,

Nmethylliriodendronine, cepharanthine, dicentrinone,aloe - emodine, corydine, liriodenine, 2 - O, Ndimethylliriodendronine,

Kháng sinh Glabradine (dịch chiết từ củ loài S glabra (Roxb.)

Mies, dịch chiết từ rễ loài S japonica), cepharanone D,

N formyl - asimilobine, N - formylannonainDiệt giun sán Dịch chiết từ rễ loài S glabra (Roxb.) Miers

Chống virus Dịch chiết từ củ loài S cepharantha Hayata

Chống ung thư Dl - tetrandrine, fangchinoline, d - tetrandrine,

d - isochondrodendrine, dịch chiết từ củ loài S venosa

(Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine,cepharanoline, isotetrandrine

Cây Bình vôi chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu Trong củBình vôi chứa một lượng chất alkaloid L - tetrahydropalmatin (rotundin),stepharin, roemerin, cycleanin Những hợp chất này được sử dụng phổ biến đểđiều chế các loại thuốc, đặc biệt là thuốc an thần [8] Theo y học cổ truyền, củBình vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu để chữa các bệnhmất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng Các hoạt chất chiết từ các loài Bìnhvôi đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu Các hợpchất alkaloid có trong các loài Bình vôi rất đa dạng cả về hàm lượng và thànhphần cấu tạo Một trong những hoạt chất được nghiên cứu nhiều nhất làrotundin (Bảng 1.1) [9], [18], [37].

Tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở Việt Nam, Liên

Xô cũ và Trung Quốc rotundin có tác dụng dược lý: (1) Rotundin rất ít độc[3]; (2) Tác dụng thần kinh rõ rệt trên nhu động vị tràng, có thể dùng chữanhững trường hợp tăng nhu động và ống tiêu hoá bị giật; (3) Tác dụng điềuhoà đối với tim và bổ tim nhẹ; (4) Tác dụng điều hoà hô hấp, có thể dùngchữa hen hay chữa nấc; (5) Rotundin có tác dụng an thần, gây ngủ và chống

co quắp, hạ huyết áp [4], [26]

Chu Hongyuan và cộng sự, Mantsch John và Li Shi - Jian nghiên cứu

cơ chế giảm đau của L - tetrahydropalmatin cho thấy thuốc có tác dụng ứcchế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cainghiện [28], [33]

Đối với những alkaloid của củ bình vôi chỉ có alkaloid A (tức làroemerin) do Ngô Vân Thu tách chiết được Dương Hữu Lợi thí nghiệm dược

lý và đã đi tới những kết luận: Dung dịch có tác dụng gây tê niêm mạc vàphong bế Tính theo công thức G Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây têniêm mạc tương đương với dung dịch 1,8% clohydrat cocain Theo thínghiệm của Mak và Nelson, dung dịch có tác dụng gây tê phong bế mạnh hơn

dung dịch clohydrat cocain 1% và dung dịch novocain 3% Dung dịchalkaloid A có tác

dụng đối lập với tác dụng gây tăng trương lực và nhu động co bóp ruột củadung dịch axetylcholin Dung dịch alkaloid A có tác dụng an thần gây ngủ vớiliều lượng nhẹ nhưng với liều cao kích thích thần kinh hệ trung ương, gây cogiật và chết Ngoài ra, alkaloid A có tác dụng giãn mạch hạ huyết áp, giảm cảhuyết áp tối đa và tối thiểu [8].

Những cây thuộc chi Stephania (họ Menispermaceae) phân bố rộng

Hơn

150 hợp chất alkaloid cùng với flavonoids, lignans, steroids, terpenoids vàcoumarins đã được tách chiết và xác định cấu trúc có hoạt tính sinh học cao[18] Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi mọc ở Việt Nam cácchất tinh bột, đường khử oxy, malic acid, men oxydaza và một alkaloid với tỷ

lệ 1,2 đến 1,5% (tính trên củ tươi) được đặt tên là rotundin [38] Rotundin làtinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màuvàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Rotundin tan trong cloroform, hơitan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong sulfuric acidloãng Điểm nóng chảy của rotundin ở 141oC đến 144oC Tiến hành đo độ hấpthụ (A) của dung dịch chế phẩm có nồng độ 30 g/ml trong dung dịch axitsulfuric 0,5 % ở bước sóng 281 nm từ 150 đến 160 [18], [38]

Rotundin có tên khoa học là L - tetrahydropalmatin

(5,8,13,13a-

tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy - 6H dibenzo quinolizine, C21H25NO4) Đây là mộtalkaloid, thu được lần đầu tiên vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóapalmatin [18] Do được phân lập từ các chi họ khác nhau, mà trước đây hợpchất này còn mang một số tên gọi khác như: caseanin, rotundin và hyndarin.Rotundin có tính kiềm yếu, được giải phóng bằng kiềm trung bình và mạnhnhư NH4OH, cacbonat kiềm, NaOH… Người ta sử dụng tính chất này để địnhlượng L - tetrahydropalmatin trong nguyên liệu thực vật, hay để tủa trong quátrình chiết alkaloid toàn phần Chất này thường được người ta sử dụng dạngmuối clorat hoặc sulfat và bảo quản trong lọ màu hổ phách [38]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của L – tetrahydropalmatine [9]

Hàm lượng rotundin rất khác nhau tùy thuộc vào từng loài Theo Bùi

Thị Bằng (2006), hàm lượng rotundin đạt tới 3,55% ở loài S.brachyandra Diels (thu ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài S.sinica Diels (thu ở Hà Nam), 1,3% ở loài S.kwangsinesis H.S.Lo (thu ở Quảng Ninh), 0,72% ở loài

S.hainanesis H.S.Lo et Y.TSoong (thu ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài S.cambodia Gagnep (thu ở Lâm Đồng) [2], [35].

Việc xác định các hợp chất hóa học đã được thực hiện ở các đối tượng

S tetrandra S Moore, S cepharantha Hayata, S glabra (Roxb.) Miers, S japonica (Thunb.), Miers and S venosa (Blume) Spreng,và hơn 70 alkaloid

cùng đã được báo cáo Nhiều đối tượng trong số các loài cây này được biếtđến với tầm quan trọng sinh học đặc biệt của chúng bao gồm kháng u và kiểuhoạt động emetine Bình vôi hoa đầu đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnhcấp tính và mãn tính, bao gồm cả trường hợp rắn cắn có nọc độc Các alkaloid

đã được phân lập từ cây Bình vôi hoa đầu: Stephaoxocanine,stephaoxocanidine, romorphinane, cepharanthine, cepharanoline, steponine,isotetrandrine, berbamine, stecepharine, dehydroreticuline (11), magnoflorine,menisperine, oblongine, cyclanoline, cis-N-methylcapaurine, sinomenine,cephamerphinanine, D-glucopyranoside, 2 -N-methylisotetrandrine, N-methylstesakine chloride (12), stesakine 9-O Dglucoside (13), N-methylasimilobine-

2-O D-glucopyranoside (14), cephamonine, aromoline, zippelianine,cepharamine, aknadinine (15), aknadicine (16), cephatonine, (−)-cycleanine(28), obamegine, berbamine, isocorydine, anolobine, cotypalline, stepharine

(9), (+)-reticuline (17), obaberine, homoaromoline, fangchinoline, tetrandrine(18), cephamuline [29].

Cepharanthin được chiết tách từ S cepharanthu và S pierrei Trên súc

vật bị chiếu xạ tia X, cepharanthin với liều 1 mg/kg làm giảm nhẹ hiện tượnggiảm bạch cầu máu ngoại vi và rút ngắn thời gian hồi phục về mức bìnhthường số lượng bạch cầu sau khi bị giảm Cepharanthin cũng được chứngminh là một chất có tác dụng kích thích miễn dịch, giảm nhẹ hiện tượng giảmbạch cầu do sử dụng các thuốc chống ung thư, ức chế kết tập tiểu cầu máu docollagen, ngăn ngừa sự phát triển của bệnh bụi phổi thực nghiệm Thí nghiệm

in vitro cho thấy cepharanthin ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư Hela

và Hela S3 Cepharanthin ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao và ức chếmạnh quá trình sao chép của HIV-1 [29], [32]

1.3 Một số phương pháp nhân cây giống cây Bình vôi

1.3.1 Nhân giống cây Bình vôi trong tự nhiên

1.3.1.1 Nhân giống cây Bình vôi bằng biện pháp giâm cành và mảnh củ

Sử dụng đoạn thân, cành (ở thời kỳ sắp già hoặc bánh tẻ, mỗi đoạn có 2đến 3 mắt) và các mảnh củ (cắt từ phần gốc, mỗi mảnh có kích thước dài rộng

4 – 5 cm, dày 2 – 2,5 cm) trồng vào mùa xuân Nhưng tốc độ sinh trưởng, pháttriển rất chậm, tốc độ lớn của củ cũng rất chậm, tỷ lệ sống sót thấp chỉ đạtkhoảng 33% [21], [22]

1.3.1.2 Nhân giống cây Bình vôi bằng củ nguyên vẹn

Để gây trồng, theo dõi sự phát triển của các loài Bình vôi, PGS.TS LãĐình Mỡi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thu hái củ Bình vôi từ các vùngnúi khác nhau (Sa Pa, Ninh Bình, Hà Tây, Quảng Ninh, Hòa Bình), đem trồngtại vườn thí nghiệm và nhận thấy tất cả các củ Bình vôi đều sống, nảy chồi,sinh trưởng Sau

2 năm theo dõi thì thấy tỷ lệ sống sót đạt 99% Tuy nhiên, quá trình sinhtrưởng phát triển rất khác nhau Chỉ khoảng 30% số cá thể gây trồng ra hoa kếtquả, số còn lại vẫn sinh trưởng xanh tốt nhưng không ra hoa [22].

1.3.1.3 Nhân giống cây Bình vôi bằng hạt

Cây Bình vôi trong tự nhiên chủ yếu sinh sản bằng hạt Khi quả chínrụng xuống đất và hạt nảy mầm vào vụ xuân Cây Bình vôi mọc từ hạt sinhtrưởng, phát triển nhanh Sau khi nảy mầm, nếu ở điều kiện bình thường câysinh trưởng khoảng hơn 5 tháng đã hình thành nụ và tháng sau ra hoa kết quả.Khoảng 4 tháng tuổi ở gốc thân, củ cũng dần dần được hình thành

Nhân giống cây Bình vôi bằng hạt là vấn đề gặp nhiều khó khăn, đòihỏi phải có thời gian nhất định; cần chú ý quan tâm nghiên cứu về kỹ thuật thuhái, bảo quản hạt giống Sự nảy mầm của hạt Bình vôi cũng rất khác nhau ởcác điều kiện bảo quản khác nhau Tỷ lệ nảy mầm của hạt Bình vôi cao nhấtđạt

85% và nảy mầm nhanh nhất là gieo hạt khi còn tươi [21], [22]

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật trong nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cây Bình vôi

1.3.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loạinguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh

dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi

nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô đểnhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của thực vật với kíchthước nhỏ

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tínhtoàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra năm 1902 Theo quan niệm sinhhọc hiện đại, tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đềumang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó.Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thểhoàn chỉnh [5], [11]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kếtquả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Trong đó: Sự phânhóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa,

đảm nhận các chức năng khác nhau Ở điều kiện thích hợp, các tế bào có chứcnăng riêng biệt có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quátrình đó gọi là phản phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phảnphân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Điều này xảy ra theo mộtchương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào,khiến quá trình sinh trưởng của cơ thể thực vật luôn được hài hòa [5], [11],[30], [31].

1.3.2.2 Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹthuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kích thíchsinh trưởng ở nồng độ thích hợp, chúng ta có thể điều khiển được chiều hướngphát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Cùng vớicytokinin, các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào Các hormone củanhóm này có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng(sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn Tác độngcủa các auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ Đốivới nuôi cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích thích phân chia

tế bào và phân hóa rễ Những auxin thường dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và

tế bào thực vật: IBA, IAA (Indoly acetic acid), NAA, 2,4 - D (Dichlorphenoxyacetic acid) [23], [24]

Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sựphân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP,kinetin, zeatin Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1- 0,2mg/l Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hìnhthành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy [24]

Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tếbào thực vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tếbào, qua đó làm tăng kích thước chồi nuôi cấy Trong nuôi cấy mô và tế bàothực

vật có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỷ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn.

1.3.2.3 Các phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân

giống vô tính cổ điển như giâm cành, chiết cành, ghép cành Có ba phương

thức tạo cây in vitro:

a Hoạt hóa chồi nách

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôicấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ bằng cách: (1) Cây phát triểntrực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầmnhư cây thuốc lá, hoa cúc, ); (2) Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách(xảy ra khi nuôi cấy cây một lá mầm như lúa, mía ) Các chồi được tách vànuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung cytokinin với nồng độ cao.Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn để chồi bên phát triển Cácchồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thìcác chồi mới tiếp tục được tạo ra Sau đó, các chồi này được chuyển sang môitrường tạo rễ và được đưa ra vườn ươm khi có rễ hoàn chỉnh [15]

Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: (1) Nhucầu về loại và nồng độ cytokinin; (2) Trong trường hợp chồi bên không tăngtrưởng được thì cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồibên mới có thể hoạt động; (3) Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bịthay đổi [3] Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được ápdụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật Quá trình nhân chồi thường được thực hiệntheo các bước:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Các cây mẹ cần phải sạch bệnh,đặc biệt là sạch vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

Bước 2: Nuôi cấy khởi động Đây là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu

cấy in vitro Các giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm

thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọnđúng loại

mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó

là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá

Bước 3: Nhân nhanh thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạochồi bất định và tạo phôi vô tính Chúng ta cần phải xác định được môi trường

và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắcchung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Nhiệt độ nuôi cấythường là 25- 27 oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng

2000 - 4000lux

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh bằng cách chuyển chồi từ môi

trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Một số chồi có thể phát sinh rễngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môitrường không chứa chất kích thích sinh trưởng

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Cây từ ống

nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảonhững yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái

nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích

hợp Giá thể phải sạch đủ dinh dưỡng và độ ẩm, tơi xốp, thoát nước [5]

b Tạo chồi bất định

Chồi bất định là chồi mọc ra từ các cơ quan, bộ phận khác của cây,không phải là phôi, ví dụ chồi hình thành từ mô sẹo (callus) Để tạo chồi bấtđịnh ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình phânhóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạnphát triển mô sẹo

c Tạo phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào

soma gọi là phôi vô tính Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnhhoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo Để tạo

phôi vô tính cần thực hiện hai quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa

để tách các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giaiđoạn mô sẹo Sự hình thành phôi trải qua hai bước: (1) Sự phân hóa các tế bào

có khả năng phát sinh phôi; (2) Sự phát triển của phôi mới hình thành [15]

Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Văn Vinh về

cây Stephania rotunda Lour cho thấy: Sau 1 tuần nuôi cấy mô sẹo từ khúc cắt

thân, ở hầu hết các nghiệm thức, mẫu nuôi cấy đều xuất hiện mô sẹo tạinhững vết cắt ngang lóng thân Trên các môi trường có NAA, mô sẹo hìnhthành ở dạng xốp có màu trắng đục rồi chuyển sang màu nâu sau 10 ngày.Trên môi trường có 2,4D, khối mô sẹo hình thành có trọng lượng tươi lớn, cómàu xanh nhạt, không hoá nâu Sự hình thành mô sẹo xảy ra rõ nhất trênnghiệm thức với nồng độ BAP 0,2 mg/l và 2,4-D 5 mg/l Sau 1 tuần nuôi cấy,hầu hết các mẫu cấy đều có phản ứng tạo sẹo Ở nghiệm thức NK1 (môitrường MS + 2,4-D 5 mg/l, BAP 0,2 mg/l) sau 3 tuần cấy, các mẫu tạo mô sẹotrắng, chắc có thể do hàm lượng khoáng thích hợp cho quá trình trao đổi chất

ở tế bào, mô Ở nghiệm thức NK2 (môi trường MS1/2 + 2,4-D 5 mg/l, BAP0,2 mg/l) sẹo bị hóa nâu sau 2 tuần nuôi cấy, có thể do nồng độ khoáng củamôi trường thấp dẫn đến ức chế quá trình trao đổi chất Ở công thức NK3 chỉ

có 39% mẫu tạo sẹo, sẹo tạo ít, xốp, có thể là do hàm lượng khoáng quá thấp,không thích hợp cho quá trình tạo sẹo Sau 3 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức C6(BAP 1 mg/l + NAA 0,2 mg/l) cho thấy chồi tạo thành nhiều nhất trong cácnghiệm thức (3,3 chồi), có thể là do nồng độ auxin, cytokinin và tỉ lệauxin/cytokinin thích hợp giúp kích thích sự tăng chồi non, tạo mới mô phânsinh chồi ngọn Ở các nghiệm thức khác như C4 và C8 (BAP 3 mg/l) các chồihình thành có hiện tượng hóa vàng và rụng lá sau 4 tuần Điều này có thể donồng độ hormon cao dẫn đến sự ức chế quá trình trao đổi chất của mô, tế bàolàm mô chết Từ đó có kết luận, khả năng tạo mô sẹo từ khúc cắt thân đạt hiệu

quả cao trên môi trường MS bổ sung 2,4- Dx5 mg/l, BAP 0,2 mg/l Môitrường có hàm lượng khoáng cao thích hợp cho