Tổng quan cơ chế phát huỳnh quang, ứng dụng trong phân tích kháng sinh họ fluoroquinolone trong dược phẩm và dịch sinh học

khóa luận tốt nghiệp cao đẳng chuyên ngành dược. Giúp sinh viên có kiên thức cơ bản về phổ huỳnh quang, phương pháp phân tích bằng máy quang phổ huỳnh quang, ứng dụng quang phổ huỳnh quang vào phân tích. Tổng quan một số tài liệu đã nghiên cứu trong và ngoài nước về việc phân tích một số fluroquinolone trong dược phẩm và dịch sinh học và từ đó rút ra một số thành tựu nổi bật.

- -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỔNG QUAN CƠ CHẾ PHÁT HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLON TRONG DƯỢC PHẨM

-NGƯỜI THỰC HIỆN: KIM THỊ THU HÀ

GV HƯƠNG DẪN: ThS NGUYỄN THỊ MINH DIỆP

Việt Trì, ngày 30 tháng 5 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Xuất phát từ một vai trò của một sinh viên ngành dược trường cao đẳng y-dược Phú Thọ cùng với sự ham học hỏi, muốn tìm hiểu về lĩnh vực phân tích dược phẩm bằng phương pháp phổ huỳnh quang, em đã chọn đề tài “Tổng quan cơ chế phát huỳnh quang - ứng dụng để định lượng kháng sinh họ fluoroquinolon trong dược phẩm” để làm khóa luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Minh Diệp bộ môn hóa-lý đã hết lòng hướng dẫn em trong suốt quá trình tìm hiểu và hoàn thành khóa luận Đồng thời em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa lý và các bạn sinh viên khóa CD8 đã giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này Với sự hiểu biết có hạn, khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý kiến của các thầy

cô, các anh chị, các bạn cùng với những người quan tâm để nội dung khóa luận được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Kim Thị Thu Hà

MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU 3

II TỔNG QUAN VỀ PHẢN ỨNG QUANG HÓA VÀ CƠ CHẾ PHÁT QUANG 3 II.1 Các khái niệm cơ bản 3

II.2 Các quá trình xảy ra khi phân tử bị kích thích Giản đồ Jablonski 3

II.2.1 Các bước chuyển điện tử trong phân tử 3

II.2.2 Giản đồ Jablonski 3

II.3 Bản chất của phản ứng quang hóa 3

II.3.1 Điều kiện để xảy ra phản ứng quang hóa 3

II.3.2 Các thông số của phản ứng quang hóa 3

II.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang 3

II.4 Phương pháp phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian .3

II.4.1 Mối quan hệ giữa phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian 3

II.4.2 Phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved fluorescence) 3

II.4.3 Phương pháp định lượng trên cơ sở phản ứng hóa phát quang 3

III ỨNG DỤNG HIỆU ỨNG PHÁT HUỲNH QUANG TRONG PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONES 3

III.1 Tính chất quang của một số chất chất kháng sinh họ fluoroquinolones 3

III.1.1 Tính chất quang của một số kháng sinh họ flouroquinolones thế hệ 2 3

III.1.1.1-Công thức cấu tạo 3

III.1.1.2- Tính chất quang 3

III.1.2 Một nghiên cứu khác về tính chất quang của kháng sinh họ flouroquinolone thế hệ 3 và 4 3

III.2 Phân tích định lượng trên cơ sở phản ứng quang hóa 3

IV KẾT LUẬN 3

TÀI LIỆU THAM KHẢO 3

DANH MỤC H Hình 2- 1 Các bước chuyển điện tử trong phân tử 3

Hình 2- 2 Giản đồ năng lượng Jablonski 3

Hình 2- 3 Hiện tượng huỳnh quang trễ 3

Hình 2- 4 Sự hấp thụ ánh sáng trong lớp mỏng 3

Hình 2- 5 So sánh phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian3 Hình 2- 6 Biểu diễn Stern-Volumer 3

Hình 2- 7 Các bước cơ bản của quá trình định lượng bằng phát quang hóa học 3

Hình 2- 8 Biêu diễn Stern-Volumer, sự phụ thuộc của tỷ lệ cường độ phát quang (hoặc lifetime) và nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang trong hai trường hợp tắt huỳnh quang động và tắt huỳnh quang tĩnh 3

YYHình 3- 1 Cấu trúc chung của quinolone và fluoroquinolone……… 3

Hình 3- 2 Công thức cấu tạo của (a) Norfloxacin; (b) Ciprofloxacin; (c) fleroxacin .3

Hình 3- 3 Phổ hấp thụ của một số FQs tiêu biểu, trong đệm phosphat tại nồng độ 5.10 -3 M, pH 7.4, 20 o C, 3

Hình 3- 4 Phổ hấp thụ của CIP tại các nồng độ khác nhau của HCl 1-10M, C=5.10 -5 M 3

Hình 3- 5 Phổ huỳnh quang ở nhiệt độ phòng của norfloxacin tại pH 1.2 (1); 3.4 (2); 7.4 (3) và 10.8 (4) 3

Hình 3- 6 Hiệu suất huỳnh quang Φ và thời gian sống huỳnh quang τ của Norfloxacin 3

Hình 3- 7 Phổ phân giải theo thời gian của CIP 10 -5 M, HCl 1M 3 Hình 3- 8 Phổ hấp thụ của MOX (a) và LEV (b) trong ─ACN, H 2 O, …PBS 3 Hình 3- 9 Phổ huỳnh quang của MOX (a), LEV (b) trongdung môi ─ACN, H 2 O, PBS 3 Hình 3- 10 Phổ hấp thụ phân giải theo thời gian của (a) MOX và (b) LEV trong đệm PBS 3 Hình 3- 11 Phổ huỳnh quang của 4-FQ trước và sau khi tạo phức với axit Cloranilic 3 Hình 3- 12 Cơ chế dịch chuyển điện tử và sự hình thành phức của axit cloranilic với 4-FQs tương ứng (1)-LOM; (2)-FLE; (3)-CIP; (4)-NOR 3 Hình 3- 13 Phổ kích thích và phát xạ của LEV (1µg/ml) (A) trong dung dịch chưa tạo mixen (B) trong dung dịch tạo mixen với SDS 8mM 3 Hình 3- 14 Phổ phát xạ (a), phổ kích thích (b) của Eu 3+ –MOX–SDBS (1)Eu 3+ ; (2)MOX; (3)Eu 3+ –MOX; (4)Eu 3+ –MOX–SDBS, pH 9.2 3

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3 1 Đặc tính quang của FQ ở dạng trung hòa và dạng proton hóa, C FQ =

5.10 -5 M 3

Bảng 3 2 Tính chất huỳnh quang của MOX và LEV trong các dung môi 3

Bảng 3 3 Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên 3

Bảng 3 4 Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên 3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt

1

fluoroquinolone2

UV-Vis Ultraviolet – visible Tia tử ngoại – khả kiến3

7,7,8,8,-7,7,8,8,- tetracyanoquino

dimetan12

SDS Sodium dodecyl sulfat Sodium (natri)dodecyl

sulfat13

SDBS Sodium dodecyl benzen

sulfat

Sodium (natri) dodecylbenzen sulfat14

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

15 LOQ Lilit of quantitation Giới hạn định lượng

HPLC

High PerformanceLiquidChromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISC Intersystem crossing Kết hợp nội phân tử26

DF delay phosphorescence Huỳnh quang trễ27

32

I MỞ ĐẦU

Fluoroquinolones (FQs) là một trong những loại thuốc kháng sinh phổ rộng,

có hiệu quả điều trị cao, thuốc được dung nạp tốt và tác dụng phụ tương đối hạnchế.FQs có các nhóm thế hoạt động, chứa nguyên tử oxy và ni tơ, chúng được biếtđến là yếu tố cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của thuốc Tuy nhiên, có nhữngcải tiến về mặt cấu trúc chỉ ra rằng quinolone khi bổ sung các nhóm thế sẽ có hoạttính kháng khuẩn và sinh khả dụng tốt hơn[1][2], vì vậy dựa vào cấu trúc và cácnhóm thế mà cho tới thời điểm hiện tại FQs đã được nghiên cứu và phân loại đếnthế hệ thứ 4 với nhiều loại thuốc khác nhau phù hợp cho từng đối tượng Đối vớicác FQs trong dược phẩm,một trong số các yêu cầu nghiêm ngặt đó là cần phảiđúng công thức về hàm lượng như đã ghi trên nhãn của nhà sản xuất, đối với thuốc

đã được sử dụng điều trị thì cần phải biết được quá trình chuyển hóa, thải trừ, sinhkhả dụng…, hoặc cần phải định lượng chính xác trong giai đoạn nghiên cứu điềuchế thuốc mới Do đó việc nghiên cứu phương pháp định lượng FQs trong thuốc vàtrong dịch sinh học (nước tiểu, huyết tương, huyết thanh…) đã được các nhà phântích trong và ngoài nước nghiên cứu từ rất lâu Có rất nhiều phương pháp địnhlượng FQs được nghiên cứu thành công, trong đó có phương pháp phát quang, đó

là phương pháp định lượng chất phân tích dựa trên cường độ ánh sáng phát xạ.Trong đó có thể là phương pháp phổ huỳnh quang, phản ứng hóa phát quang hoặcphản ứng quang hóa… Không chỉ là những nghiên cứu định lượng thông thường

mà các nhà phân tích còn quan tâm tới tính chất quang, cơ chế phản ứng, cơ chếphát quang, để hiểu được bản chất và có những cải tiến cho phương pháp để cóđược kết quả chính xác, dễ thực hiện và giảm chi phí Trong chuyên đề này chúngtôi tìm hiểu cơ bản về cơ chế phát huỳnh quang nói chung trong các phương phápphân tích bằng huỳnh quang Chủ yếu là trong phản ứng quang hóavà ứng dụng cơchế này vào định lượng FQs trong dược phẩm và dịch sinh học, dựa trên cácnghiên cứu đã được công nhận Về cơ bản thì sự phát huỳnh quang phụ thuộc vào

1

cấu trúc của FQs, dung môi và pH của dung dịch.Dựa vào các yếu tố đó có thể khắcphục các sai khác trong quá trình định lượng.

II TỔNG QUAN VỀ PHẢN ỨNG QUANG HÓA VÀ CƠ CHẾ PHÁT

QUANG

II.1 Các khái niệm cơ bản

Quang hóa học(photochemistry)là lĩnh vực nghiên cứu: phản ứng hóa học dưới tác

dụng của tia bức xạ thuộc vùng tử ngoại xa đến hồng ngoại; và hiệu ứng phát xạcủa phản ứng hóa học

Phản ứng quang hóa (photochemical reaction):là phản ứng hóa học xảy ra do hấp

thụ tia bức xạ tử ngoại (UV) hoặc nhìn thấy (VIS) hoặc hồng ngoại (IR)[3][4]

Cơ chế phát quang:hiện tượng phát quangbao gồm

- Phát quang âm cực - Phát quang hóa học

- Phát quang nhiệt - Phát quang sinh học

- Quang phát quang - Phát quang điện và phát quang ma sát

- Nếu phân tử được kích thích bằng tia bức xạ (UV, VIS, IR) mà phát sáng thì sựphát quang đó gọi là quang phát quang (photoluminescence)

- Nếu năng lượng của một phản ứng được phát ra dưới dạng ánh sáng thì sự phátquang đó gọi là hóa phát quang (chemiluminescence)

…

Mọi dạng phát sáng trên đều giống nhau về bản chất được gọi chung là phát quang(luminescence)[5][6]

II.2 Các quá trình xảy ra khi phân tử bị kích thích Giản đồ Jablonski

II.2.1 Các bước chuyển điện tử trong phân tử

Khi nhận năng lượng, một electron ở orbital liên kết hoặc không liên kết có thể chuyển lên các orbital phản liên kết còn trống ở mức năng lượng cao hơn Khi đó xảy ra các bước chuyển điện tử sau:

- Bước chuyển mức N → V

- Bước chuyển mức N →Q

- Bước chuyển mức N →R

Hình 2- 1.Các bước chuyển điện tử trong phân tử

II.2.2 Giản đồ Jablonski

Hình 2- 2.Giản đồ năng lượng Jablonski

So : trạng thái cơ bảnS1 : trạng thái kích thích có độ bội đơn

3

T1 : trạng thái kích thích có độ bội 3A: hấp thu (adsorption)

F: huỳnh quang (fluorescence)P: lân quang (phosphorescence)

→ Quá trình phát xạ

~~–> Quá trình không phát bức xạ SR(VR) Relaxation of vibration – Hồi phục do dao độngKhi phân tử hấp thụ năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang(photon) Ở trạng thái cơ bản So, phân tử hấp thụ năng lượng từ môi trường bênngoài và chuyển thành năng lượng của các electron, nhận năng lượng, các electronnày sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn, gọi là trạng thái kích thích S*, đây làmột trạng thái không bền, do đó electron sẽ mau chóng nhường năng lượng dướidạng nhiệt để về trạng thái kích thích nhưng năng lượng thấp hơn So*, thời gian tồntại của electron giữa mức năng lượng So→So* vào khoảng 10-9 đến 10-12 giây, saukhi về trạng thái kích thích So*, electron lại một lần nữa phát năng lượng dưới dạngphoton để về mức thấp hơn, hiện tượng này gọi là huỳnh quang phân tử Cùng làhiện tượng này còn có hiện tượng lân quang (phosphorescence) và huỳnh quang trễ(delay phosphorescence), hình vẽ 2-4

Hình 2- 3.Hiện tượng huỳnh quang trễ

Các quá trình giải tỏa năng lượng phân tử

Quátrình hấp thụ năng lượng (A): Khi hấp thu sóng điện từ, phân tử bị kích thíchđiện tử chuyển từ trạng thái So → S1 hoặc S2, t= 10-16 - 10-15giây (femo giây)

Trạng thái này không bền, electron có xu hướng giải tỏa năng lượng đã hấpthu để trở về trạng thái có năng lượng thấp, bền vững hơn Sự giải tỏa năng lượng

có thể thực hiện theo nhiều cách tùy thuộc vào cấu trúc phân tử Quá trình làmmất hoạt tính năng lượng ở trạng thái kích thích có thể không kèm theo sự phátproton hν

- IC (chuyển hóa mội phân tử)–năng lượng cho quá trình chuyển vị nội phân tử (S2

→S1)

- VR (sự phục hồi do dao động) – mất năng lượng do dao động và do sự quay (S1

(v’)→ S1(0); T1 (v’) → T1 (0))

- IEC (sự chuyển hóa dưới dạng nhiệt) – chuyển năng lượng cho các phần tử

xung quanh (dung môi) dưới dạng nhiệt

- ISC (kết hợp nội phân tử)– chuyển năng lượng giữa các mức có độ bội khác nhau

(S1 (v’= 0) →T1 (v’=1,2,3…), khi thỏa mãn 2 điều kiện:

- Nếu trong phân tử đường cong thế năng S1 và T1cắt nhau, khi ΔE =ES1 - T1<10kcal

- Mức dao động v’= 0 của S1 bằng với v’cao của T1

- F (phát xạ huỳnh quang) – bức xạ phát ra khi thực hiện bước chuyển S1(v’= 0) →So (v=0,1,2…), thời gian thực hiện bước chuyển 10-9 -10-6 s

- P (phát xạ lân quang) – bức xạ phát ra khi thực hiện bước chuyển T1 (v’= 0) → So

(v=0,1,2,3…); thời gian thực hiện bước chuyển 10-4 -10-2

- DF (huỳnh quang trễ): do trước khi bức xạ photon, phân tử ở trạng thái triplet

một thời gian, sau đó trở về trạng thái So

5

II.3 Bản chất của phản ứng quang hóa

II.3.1 Điều kiện để xảy ra phản ứng quang hóa

Các định luật quang hóa: phản ứng quang hóa chỉ xảy ra theo các định luật sau đây1- Định luật Grotthuss và Draper: Chỉ ánh sáng bị hệ hấp thụ mới có khả nănggây ra phản ứng, nói cách khác, phản ứng quang hóa chỉ có khả năng xảy ranếu phân tử bị hấp thụ ánh sáng

2- Định luật Einstein: Một photon hay lượng tử ánh sáng bị hấp thụ chỉ có khảnăng kích thích một phân tử trong giai đoạn sơ cấp, định luật này còn gọi làđịnh luật đương lượng quang hóa

3- Quy luật do Kashe tổng kết: Khi hấp thụ photon, phân tử có xác xuất nhấtđịnh bị kích thích lên trạng thái singlet thấp nhất S1 hoặc triplet thấp nhất T1.Trong phần lớn phản ứng quang hóa hữu có trong dung dịch phân tử bị kíchthích lên trạng thái S1 hoặc T1 Quy luật này do Kasha tổng kết từ thựcnghiệm chủ yếu đối với các phản ứng quang hóa hữu cơ

4- Đinh luật Lambert – Beer về sự hấp thụ ánh sáng: giả thiết có một luồng ánhsáng đơn sắc có cường độ Io ec/cm2.s đi qua một dung dịch có tiết diện 1cm2

Hình 2- 4.Sự hấp thụ ánh sángtrong lớp mỏng

Giả thiết ở độ sâu l, cường độ ánh sáng là I, khi đi qua lớp mỏng δl cường độ giảm

đi δI Gọi n là số phân tử chất hấp thụ ánh sáng trong 1cm3 Như vậy số phân tửtrong lớp mỏng δl là δn và δn = nδl Vì số photon bị hấp thụ tỉ lệ với số phân tử hấpthụ ánh sáng nên có thể viết = kδn = knδl (2.1)

Trong đó k là hệ số tỉ lệ.phương trình (II.1) là biểu thức toán học của định luậtlambert Beer Lấy tích phân (2.1) và chú ý đến điều kiện đầu I = Io, khi Io = 0

ta được ln= -knl (2.2) hoặc = e-knl (2.3) Tỉ số T = gọi là độ truyền quang,

-logT = A gọi là độ hấp thụ (trước đây gọi là mật độ quang)

Trong các biểu thức trên, n là nồng độ tính bằng phân tử/cm3 Nống độ tính bằngmol/l và ký hiệu C, ta có: kn = ɛC (2.4)

Phản ứng quang hóa bao gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn hấp thụ photon: trong đó phân tử chuyển từ trạng thái cơ bảnsang trạng thái kích thích electron

+ Giai đoạn quang hóa sơ cấp: trong đó các phân tử bị kích thích tham giatrực tiếp vào phản ứng

+ Giai đoạn quang hóa thứ cấp: còn gọi là giai đoạn phản ứng tối hoặc phảnứng nhiệt, trong đó có các sản phẩm của giai đoạn sơ cấp tham gia phản ứng

II.3.2 Các thông số của phản ứng quang hóa

1-Cường độ huỳnh quang: Khi chiếu một chùm tia tử ngoại (bức xạ kích thích) vào

một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy có bước sóng xác định tùy thuộctừng chất và có cường độ phụ thuộc vào hàm lượng của chúng[6]

2- Hiệu suất phát quang: đánh giá sự biến đổi hiệu dụng giữa Eex sang Eem Có 2

loại hiệu suất phát quang:

7

Hiệu suất năng lượng (ΦNL: là tỉ số năng lượng huỳnh quang của chất khảo

sát Eem và năng lượng ánh sáng kích thích Eex

ФNL = ≤1 (2.6)

Hiệu suất lượng tử (ΦLT ): là tỉ số giữa số lượng tử huỳnh quang Nem và số

lượng tử ánh sáng kích thích (hấp thu)

ФLT = ≤1 (2.7)

3- Thời gian sống huỳnh quang (lifetime)τ0 hay thời gian của trạng thái kích thích là

thời gian cần thiết để số phân tử kích thích ban đầu giảm e lần[7]

0

i i

1

τ =

k

�

Trong đó ki là hằng số tốc độ của quá trình giải hoạt i ( bức xạ hoặc phi bức xạ)

4- Nồng độ mol/l các chấtở các trạng thái tương ứng [S1], [T1]…

II.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang

1-Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang

Cấu tạo phân tử:

- Các chất có dây nối đôi liên hợp thì có khả năng phát quang Càng nhiều dây nốiđôi liên hợp thì khả năng phát quang càng cao Ví dụ: Các chất vô cơ hay các chấthydrocacbon no hầu như không phát quang Các hợp chất thơm có khả năng phátquang và càng nhiều vòng thơm ngưng tụ thì hiệu suất huỳnh quang càng lớn

- Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang

Ví dụ: -OH, -OCH3

- Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang

Ví dụ: -NO2, -COOH, -CHO,

- Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc làm giảm hiệu suấthuỳnh quang Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trên

nhân thơm, cũng làm tăng hiệu suất huỳnh quang Ngược lại vị trí meta thì làmgiảm hiệu suất huỳnh quang.

- Đồng phân cis làm tăng khả năng phát quang và đồng phân trans làm giảm khảnăng phát quang của hợp chất

 Độ cứng nhắc của phân tử.Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát

quang

cao và ngược lại Ví dụ: Flourene, Flourescein: Phát quang mạnh

Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang

 Chất tạo dẫn: Có những hợp chất bình thường phát quang yếu nhưng khi tạo

dẫn

chất thì phát quang mạnh

Ví dụ:Không phát quang Phát quang mạnh

Tetracyclin Tetracyclin + Ca2++ Barbiturat

Hydrocortison Hydrocortison + H2SO4+ ethanol

Vitamin B1 Thiocrom

Adrenalin Adrenochrom

2-Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang

Sự có mặt của các chất tan khác nhau: Có thể gây ra hiện tượng sau:

- Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác nhau có thể không phát quang nhưng lại hấp thụánh sáng của chất phát quang làm giảm cường độ huỳnh quang

- Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt một phần hay toàn bộ cường độ phátquang do va chạm hay làm biến đổi cấu trúc hóa học của chất phát quang

Cơ chế: F + hνF*

F* →F + hν

9

Trong đó F là chất phân tích có khả năng phát huỳnh quang ( F*) Do va chạmnên:

F* + Q  F + Q*

Khi đó Q đóng vai trò là chất làm tắt huỳnh quang (quencher)

Ví dụ: Cl- là Q của Quinin cho nên trong môi trường HCl thì Quinin không phátquang ADN là Q của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụngAcridin trong định lượng

Nồng độ ion H + , vai trò của pH:

pH có ảnh hưởng lớn đến cường độ phát quang Một số chất có tính axit yếuhay bazơ yếu thì cường độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH Ví dụ: Ta có axit

AH, trong nước AH phân ly theo phương trình: AH  A- +H+

Nếu dạng phát quang là AH thì khi H+ tăng, phản ứng xảy ra theo chiều nghịch, khi

tăng Nếu dạng phát quang là A- thì F sẽ giảm trong môi trường axit và tăng trongmôi

trường kiềm

 Ảnh hưởng của dung môi:

Cường độ phát quang và bước sóng cực đại thay đổi theo dung môi và những tácđộng

- Độ tinh khiết của dung môi: Dung môi có tạp huỳnh quang làm sai lệch kết quảcủa phép đo

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ tăng làm giảm cường độ phát quang do

làm tăng tần số va chạm của phân tử làm cho hiện tượng bất hoạt tăng lên Do vậytrong máy quang phổ huỳnh quang, đèn nguồn có công suất lớn nên phải có kínhcách nhiệt hoặc có bộ phận làm mát đèn

 Ánh sáng kích thích: Khi λex ngắn (ánh sáng kích thích có năng lượng lớn)

phân tử chất huỳnh quang có thể bị phân li, điển hình như:

- Liên kết C – C có thể đứt khi sử dụng λex ~ 200nm;

- Liên kết C – N có thể đứt khi sử dụng λex ~ 250nm

Trong phổ huỳnh quang thường λex ≥ 250nm

 Ảnh hưởng của oxi: do sự che phủ của vân phổ huỳnh quang và vân phổ hấp

lại như hình vẽ 2-5bằng thang đo thời gian ns ở trạng thái dừng, khi mẫu đầu tiên

được chiếu sáng, trạng thái dừng gần như đạt được tức thì Thứ 2 là đo huỳnhquang phân giải theo thời gian, sử dụng phép đo cường độ phân giải hoặc dị hướngphân giải Mẫu được đặt vào xung ánh sáng, độ rộng của xung ngắn hơn thời gianphân giải mẫu, hình vẽ 2-5, cường độ phân giải được ghi bằng hệ thống phát hiệntốc độ cao, cho phép đo cường độ bằng thang thời gian ns Mối quan hệ giữa trạngdừng và thời gian phân giải được biểu thị bằng biểu thức:

11

I = I0.e-t/τ(2.8)Giá trị I0 là thông số phụ thuộc vào nồng độ của chất phát huỳnh quang và một sốthông số của thiết bị đo Do đó huỳnh quang trạng thái dừng tỷ lệ với thời giansống huỳnh quang Điều này chứng tỏ được hiệu suất huỳnh quang Φ tỷ lệ với τ.

Đo huỳnh quang ở trạng thái tĩnh có thể hiểu rằng đó là thời gian trung bình củaphép đo huỳnh quang phân giải theo thời gian[8]

HÌnh 2- 5.So sánh phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian

Phương pháp huỳnh quang tĩnh (steady - state luminescence) là phương pháp đocường độ phát xạ tương ứng ở λex/λem thích hợp, khi phân tử đã trở về trạng thái

cơ bản Do cường độ huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ chất phát huỳnh quang trong dung dịch, đó là cơ sở để định lượng

II.4.2 Phươngpháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved

fluorescence)

1) Phức ở trạng thái kích thích phân hủy theo phương trình động học bậc 1:

[P*]t = [P*]oe-t/τ (2.9)Hay It = Ioe-t/τ(2.10)Trong đó:

[P*]o.và [P*]t là nồng độ của phức chất ở trạng thái kích thích thời điểm t = 0 vàsau thời gian t

I0 và It là cường độ phát xạ huỳnh quang của phức chất ở trạng thái kích thích thờiđiểm