Di truyền y học dùng cho đào tạo bác sỹ đa khoa

BỘ Y TÊ' DI TRƯYỂN Y HỌC (DÙNG CHO ĐÀO TẠO BÁC sĩ ĐA KHOA) Mã số: Đ.Ol.X.lO (Tái lần thứ ba) ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI_ TRUNG TẦM THÒNG TIN THƯ VIỀN NHÀ XUẤT BÀN GIÁO b v c VIỆT NAM - Chĩ đạo biên soạn: VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TỂ Chủ biên: GS.TS TRỊNH VĂN BẢO PGS.TS TRẦN THỊ THANH HƯƠNG Những người biên soan: GS.TS TRỊNH VĂN BẢO PGS.TS PHAN THỊ HOAN PGS.TS TRẦN THỊ THANH HƯƠNG TS HOÀNG THỊ NGỌC LAN PGS.TS TRẦN THỊ LIÊN PGS.TS TRẦN ĐỨC PHẤN PGS.TS PHẠM ĐỨC PHÙNG TS NGUYỄN VẢN R ự c TS NGUYỄN THỊ TRANG Thư k ý biên soạn: PGS.TS TRẦN THỊ THANH HƯƠNG Tham gia tơ'chức bẩn thio: ThS PHÍ VĂN THÂM TS NGUYỄN MANH PHA H ò iỹ iớ H Ầ ụ u Thực m ộ t sô'điều Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & Đào tạo Bộ Y tế ílã ban hành chương Mnh khung đào tạo Bác s ĩ đa khoa Bộ Y t ế tổ chức biẽn soạn tài liệu dạy - học môn sở chun m ơn theo chương ù-ình nhằm tùng bước xắỵ dựng hộ sách đạt chuẩn chuyên m ôn công tác đào tạo nhân lực ỵ tế Sách D I TRUYỀN Y H O C biên soạn dựa vào cỉìương trình giáo dục Trường Đại học Y Hà N ội ữên sở chương ti-ình kh u n g dược p h ê duyệt Sách tác giả GS TS Trịnh Văn Bảo , PGS TS Phan Thị Hoan, PGS TS Trần Thị Thanh Hương, TS Hoàng Thị Ngọc Lan, PGS TS Trần Thị Liên, PGS TS Trần Dức Phâh, PGS TS phạm Dức Phùng, TS N guyễn Văn Rực, TS N guyễn Thị Trang biên soạn theo phương châm: kiến thức bản, hệ thơhg; nội dung xác, khoa học, cập nhật tiêh khoa học, k ỹ thuật đại thực tiễn Việt Nam Sách D I TRUYỀN Y H O C đưỢc Hội đồng chun mơn ứìẩm định sách tài liệu dạy - học chuyên ngành Bác s ĩ đa khoa Bộ Y t ế thẩm định năm 2007 Bộ Y tô 'q u y â ị định han hành tài lìộu d ỵ h ọ c d t chuãn chuyên m ô n ngành giai đoạn naỵ Trong thời gian từ đến năm, sách phải chỉnh lý, b ổ sung cập nhật Bộ Y tê'xừì chân thành cảm ơn tác giả H ội đồng chun mơn thẩm định giúp hồn thành ch sách; cảm ơn GS TS Trương Đình Kiệt, TS Nguyễn Trần Chiến đọc phản biện đ ể sách sớm hoàn thành kịp thời phục vụ cho công tác tạo nhân lực ỵ tế Chúng mong nhận đưỢcý kiến đóng góp dồng nghiệp, bạn sinh viên độc g iả đê lần xuâ't sau sách đưỢc hoàn thiện VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ J lờ i nói đau Để đáp ứng yêu cầu Y học, bên cạnh cuốh Các nguyên lý sinh học, Bộ môn Y Sinh học - Di truyền Đại học Y Hà Nội soạn thảo sách Di truyền Y học Nội dung sách Di truyền Y học biên soạn theo khung chương trình đào tạo Bộ Giáo dục - Đào tạo Bộ Y tế Nội dung sách nhằm cung cấp kiến thức cho học viên theo chương trình đào tạo bác sĩ đa khoa Di truyền Y học năm qua phát triển nhanh chiều rộng lẫn chiều sâu; nội dung kiến thức Di truyền Y học thâm nhập vào hầu hết chuyên ngành Y học, sách chúng tơi đề cập đến vấn để có tính chất nguyên lý Di truyền Y học, kèm theo sơ' ví dụ để minh họa Sách biên soạn gồm 12 chương, chương trình bày theo đề mục; chương tương ứng vói đến tiết giảng; có mục tiêu phần tự lượng giá để giúp cho học viên tập trung vào nội dung cần học Cuốn sách Di truyền Y học xuất lần chủ yếu dành cho đào tạo bác sĩ đa khoa tài liệu tham khảo cho đối tượng đào tạo cử nhân: điều dưỡng, kỹ thuật y học, y tế công cộng Sách dùng làm tài liệu ôn tập cho đôi tượng thi tuyển sau đại học: nghiên cứu sinh, cao học, bác sĩ chuyên khoa Các lác giả iViam gia viết bách Iiày giáo aư, phó giáo aư, giảng viên lâu năm chuyên ngành Y Sinh học - Di truyền, đặc biệt cô'| GS.TS Trịnh Vãn Bảo có cơng lớn chủ biên biên soạn c'n sách Trong biên soạn cuốh sách này, cập nhật sử dụng kiến thức mối, thành tựu đạt Di truyền học nói chung Di truyền Y học nói riêng Tuy nhiên, sách chắn chưa đáp ứng yêu cầu nhiều mặt bạn đọc, có chỗ cần sửa, cần bổ sung, rấ t mong góp ý bạn đọc đồng nghiệp Thay mặt ban biên soạn PGS.TS TRẦN THỊ THANH HƯƠNG TRƯỞNG B ộ MÔN Y SINH HỌC - DI TRUYỀN ĐAI HOC Y HÀ NÔI MỤC LỤC LỜI GIỚI THIỆU LỜI NÓI ĐẦU DANH MỤC CHỮ VIỂT TẮT Chương LƯỢC SỬ - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI (I GS.TS Trịnh Văn Bảo I, PGS.TS Phan Thị Hoan) Lược sử di truyền y h ọ c NỘI dung di truyền học người 11 Phương pháp nghiên cứu di truyền y học 16 Tự lượng giá 23 Chương _ NHIỄM SẦC THỂ VÀ BỆNH HỌC NHlỄM SẮC THỂ (I GS.TS Trính Văn Bảo I, PGS.TS Phan Thị Hoan, TS Nguyễn Văn Rực) NHIỄM SẮC THỂ CỦA NGƯỜI 24 Sơ lược lịch sử nghiên cứu Nhiễm sắc thể người .24 Phương pháp xét nghiệm nhiễm sắc thể người 25 Đặc điểm nhiễm sắc thể người 27 Tự lượng giá 34 BỆNH HỌC NHIỄM SẠC THỂ 34 Bệnh rối loạn nhiễm sắc thể thường 34 Bệnh rối loạn nhiễm sắc thể giới tính 45 Tự lượng giá 58 Chương MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC (PGS.TS Trần Thị Thanh Hương TS Hoàng Thị Ngọc Lan) Tách chiết điện di ADN 59 Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase Chain reaction: PCR) 61 Xác định trình tự nucleotid phân tử ADN (Sequencing) 62 Enzym giới hạn chức enzym giới h n 65 Lai acid nucleic 67 Hiện tượng đa hình chiểu dài đoạn ADN enzym giới hạn tạo nên (Restriction íragment length polymorphisms: RFLP) 72 Dấu ấn ADN (DNA Pingerprintin^ 73 Tự lượng glá 74 Chương BỘ GEN CỦA NGƯỜI (I GS.TS Trịnh Văn Bảo Ị, PGS.TS PHạm Đức Phùng, TS Phan Thị Hoan) Bộ gen gì? Ý nghĩa việc dựng đồ gen người 75 Đặc điểm gen người 76 Một số phương pháp xác định đồ di truyền đồ hình thể 79 Cách ghi đồ gen 86 Xác định trình tự nucleotid ADN lập bảnđồ gen người 86 Dự án gen người 87 Tự lượng giá 89 Chương DI TRUYỀN PHẨN TỬ CỦA CÁC BỆNH NGƯỜI ( GS.TS Trịnh Văn Bảo , TS Nguyễn Thị Trang) BỆNH HEMOGLOBIN VÀ RỐI LOẠN CÁC YỂU T ố ĐÔNG M Á U .90 Mơ hình cấu trúc điều chỉnh biểu gen gen tiêu biểu người 90 Bệnh hemoglobin .93 Đột biến gen gây rối loạn yếu tô' đông máu 104 Tự lượng gíá 109 BỆNH RỐI LOẠN CHUYỂN h ó a BẨM s in h 110 Hậu chung thiếu hụt enzym .110 Một sô' bệnh rối loạn chuyển h o 112 Tự lượng gíá 133 Chương DI TRUYỀN ĐƠN GEN / (PGS.TS Trần Thị Liên, PGS.TS Trần Thị Thanh Hương) Phân loại nhóm bệnh rối loạn vật chất di truyền gây nên 134 Các tính trạng rối loạn di truyền kiểu M endel r 135 Tự lượng giá 163 Chương DI TRUYỂN NHÓM MÁU - c s DI TRUYỀN CỦA HỆ THỐNG KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI (PGS.TS Trần Thị Thanh Hương, PGS.TS Trần Thị Liên) Di truyền nhóm máu .165 Cơ sỏ di truyền Hệ thống kháng nguyên bạch cầu người - HLA 175 Tự lượng giá ! 178 Chương X DI TRUYỂN ĐA GEN VÀ DI TRUYỀN ĐA NHÂN T ố NGƯỜI ( GS.TS Trịnh Vãn Bảol, PGS.TS Trần Đức Phấn, PGS.TS Trần Thị Liên) Khái niệm định nghĩa 179 Đặc điểm di truyền đa nhân t ố 184 Một sơ' bệnh, tính trạng di truyền đa gen ngưởi 186 Một sơ' tính trạng, tật, bệnh di truyền đa nhân t ố 188 Bằng chứng vai trò di truyền vai trò mơi trường di truyền đa nhân t ố 196 Dự báo nguy tái bệnh ỏ hệ s a u ; 199 Tự lượng giá 200 Chương BẤT THƯỜNG BẨM SINH (I GS.TS Trinh Văn Bảo Ị PGS.TS Phan Thị Hoan PGS.TS Trần Đức Phấn) Khái niệm bất thường bẩm sin h 201 Phân loại bất thường bẩm sinh 203 Nguyên nhân phát sinh Bất thường bẩm sinh .205 Cơ chế bất thường bẩm sinh 208 Các giai đoạn phát sinh Bất thường bẩm sin h .210 Tự lượng giá 211 Chương 10 DI TRUYỀN UNG THƯ (ỊGS.TS Trinh Vân Bảol, PGS.TS Trần Thị Liên TS Hoàng Thị Ngọc Lan) Ung thư: Nhóm bệnh rối loạn vật chất di tru yề n 212 Nguyên nhân phát sinh ung th .215 Các chế phát sinh ung th 217 Tự lượng giá 227 Chương 11 DI TRUYỀN HỌC QUẦN THỂ NGƯỜI (PGS.TS Phạm Đức Phùng, TS Hoàng Thị Ngọc Lan) Sự đa hình quần thể 228 Các nhân tố ảnh hưỏng lên tần số a le n 232 Tựlượnggiá 235 Chương 12 Tư VẤN DI TRUYỀN (I GS.TS Trinh Văn Bẻol, PGS.TS Trần Thị Thanh Hương) Sàng lọc bệnh, tật di truyền (geneticscreening) 236 Chẩn đoán trước sinh 239 Tư vấn di truyền (genetic counseling) 241 Phòng bệnh, tật di truyền .248 Điều trị bệnh, tật di truyền 249 Tự lượng giấ ! .256 TÀI LIỆU THAM KHẢO .257 DANH MỤC CHỮ VIẾT TĂT NST Nhiễm sắc thể ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic Hb Hemoglobin PCR (Polymerase Chain reaction): phản ứng chuỗi polymerase FISH (Pluorescence in situ hybridi2ation): lai chỗ huỳnh quang PHA Phytohemagglutinin IQ (Intelligence quotient): chì sơ' trí tuệ TDF (Testis determining íactor) yếu tố biệt hóa tinh hồn (gen biệt hóa tinh hồn) HLA (Human leukocyte antigen) kháng nguyên bạch cầu người Nu Nucleotid BTBS Bất thường bẩm sinh CPTTT Chậm phát triển tâm thần Chương LỮỢC s - NỘI DUNG - PHỨƠNG PHÁP N G m Ê N c ứ ữ DI TRUYỀN HỌC NGỦỜI MỤC TIÊU Nêu lược sử phát triển di truyền học người Nêu nội dung di truyền học người Trinh bày phương pháp nghiên cứu di truyền học người LƯỢC SỬ CỦA DI TRUYỀN Y HỌC 1.1 G iai đ o n m đầu Năm 1839, Schleiden Schwan đề xuất học thuyết tế bào với nội dung quan trọng: "Mọi sinh vật đưỢc cấu tạo tế bào", tảng chung cho di tru y ổ n học nói chung, cho di truyền học người nói riêng Năm 1865, Mendel báo cáo vê' quy luật di truyền dựa thực nghiệm đề cập đến nhân tố di truyền Các quy luật di truyền Mendel trở thành quy luật di truyền chung sinh vật, tính trạng di truyền theo quy luật gọi di truyền theo Mendel (Mendelian Inheritance) Năm 1910, Morgan đồng nghiệp xác định: nhân tơ' di truyền mà Mendel đề cập gen xếp dọc thành hàng nhiễm sắc thể (NST) tạo thành nhóm liên kết, gen chi phổi hình thành tính trạng theo quy luật khác 1.2 LưỢc sử di tru yển tê bào Năm 1882, W alther Flemming, nhà di truyền học tê bào người úc đưa hình ảnh minh họa NST người đưa khái niệm phân bào nguyên nhiễm Bước 4: đọc vị trí Nu tương tự phương pháp enzym VỊ trí loại Nu biểu băng, vị trí đọc từ dưối lên đoạn nhỏ điện di chạy nhanh đoạn có kích thưốc lớn Hình ảnh điện di Ống Đọc thứ tự Nu Đoạn ADN cấn xác định trinh tự Nu TGCACTTGAACGCATGCT T 3' c G A T 18 c 17 G 16 T 15 A 14 c 13 G 12 c 11 ”P- TGCACHGA CGCATGCT A 10 — “p- TGCACTTG ACGCATGCT A — G T T c A c G T Cho hóa chất hủy Nu loại A Vị trí A bị hủy “p- TGCACnCAACGC^ TGCT TGC CTTGAACGCATGCT Ị < - ^ - > Đốạn có đánh dấu Đoạn khơng đành dấu — — — — — — — 5’ Hình 3.3 Minh họa quy trình xác định trinh tự Nu phương pháp hóa học ENZYM GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYM GIỚI HẠN 4.1 Enzym giới hạn (R estrictio n enzym e) Enzym giới hạn hay gọi enzym hạn chế có đặc điểm cắt ADN vị trí xác định Cho đến người ta biết khoảng 500 loại enzym giới hạn Các loại enzym giới hạn có đặc điểm sau: 5* DI TRUYỂN Y HỌC 65 - Các loại enzym giối hạn chiết tách từ vi khuẩn Tên enzym giới hạn mang tên viết tắt vi khuẩn (xem bảng 3.1) - Cắt phân tử ADN xoắn kép vị trí xác định cho loại enzym giối hạn - VỊ trí cắt thường có - Nu, đặc trưng quan trọng trình tự nhận biết’ đoạn ADN gồm đến cặp Nu có trình tự giơng đọc theo chiều 5’ - 3’ Vì vị trí cắt enzym giống mạch (xem vị trí cắt bảng 3.1) Bảng 3.1 Vị tr( cắt số enzym giới hạn Tèn enzym Chiết tách từ Đoạn cắt Đầu kết dính Nơi cắt cùa enzym Eco RI Escherichia coli -G -A -A -T -T - c 1 1 1 -C -T -T - Ầ-A -G- A -A -T -T -C G- -G -C -T- -T-A-A Bam HI Bacillus amyloliqueíaciens -G -G -A-T-C - -c 1 1 1 -C -C -T -A -G r -G -c -c -T -A -G -C -C -C -G -G -G 1 1 1 -G -G -G -C -C -C Sma G -A -T -C -C G- G -G -G 1 c-c-c- Serratia marcesciens -c -c -c - -G -G -G - Sau bị cắt ADN có đầu kết dính ỏ sỢi đơn Cùng bị cắt với loại enzym giới hạn, phân tử ADN có đầu kết dính vói Nu bổ sung cho 4.2 Chức năn g enzym giới hạn Enzym giối hạn ỏ vi khuẩn có vai trò phân giải ADN virus virus thâm nhập vào vi khuẩn Trong vi khuẩn có enzym biến đổi để melhyl hóa enzym 66 giỏi hạn làm cho enzym giới hạn hoạt tính, khơng tác động đến ADN vi khuẩn Chức cắt enzym giới hạn làm cho phân tử ADN dài bị cắt đoạn để phân tích Sau bị cắt, đoạn ADN điện di agarose gel để xác định tính chất, dùng để tạo nên phân tử ADN lai LAI ACID N U C LEIC 5.1 ADN dò (DNA probes) Trước thực kỹ thuật lai acid nucleic người ta phải tạo ADN dò ADN dò đoạn ADN sỢi đơn mà trình tự Nu, tính chất chúng biết Một sơ loại ADN dò bán thị trưồng Có tên ADN dò có chức dò tìm đoạn ADN sỢi đơn tương ứng phân tử ADN cần phân tích, ví dụ đoạn ADN bất thường số" bệnh cần chẩn đoán Phương pháp tạo ADN dò: - Phương pháp mã ngược: P ro te in > mARN > cADN Ví dụ; - Phe - Trp - Met - Asp - Cys - Arg ADN sợi đơn TTT - TCC - TAC -.CTA - TCT - GCT - Hoặc(TTG) (CTG) (TCG) (GCC) - Phương pháp tổng hỢp từ Nu theo trình tự biết - Phương pháp tách chiết từ ADN gen Trong phưđng pháp lai acid nucleic có phương pháp sử dụng phương pháp lai alen với mẫu dò đặc hiệu (allele speciĩic oligonucleotide), phương pháp thường dùng vói kỹ thuật sau 5.2 Các phương pháp lai acid n u cleic 5.2.1 Phương p h p Southern blotting Kỹ thuật Southern phát vào năm 1975 Mục đích kỹ thuật: dò tìm phân tử ADN sơ" rấ t nhiều phân tử ADN Đây phương pháp dùng để phát bệnh ỏ mức độ phân tử Southern blotting dùng nhiều kỹ thuật lai ADN khác 67 Các bưốc kỹ thuật: Tách chiết ADN từ mẫu vật bạch cầu, từ tế bào nước ô'i, tế bào tua rau thai - Phân tử ADN cắt enzym giối hạn tạo nên đoạn ADN có kích thước khác nhau, số có đoạn mang gen cần tìm - Điện di đoạn ADN agarose gel; tùy theo kích thưốc đoạn ADN mà có bàng điện di vị trí khác - Để gel tiếp xúc vói NaOH, NaOH làm biến tính ADN th n h sỢi đơn(cắt cầu nối hydro Có thể dùng nhiệt độ cao làm biến tính ADN - Sau trán g gel đưỢc đặt lên giấy thấm , giấy thấm có tiếp xúc với dung dịch điện di, giấy nitrocellulose phủ lên gel Dùng vật nặng ép lên giấy thấm, ADN thấm từ gel lên giấy nitrocellulose Enzym cắt Hình 3.4 Các bước kỹ thuật Southern blotting ['B - Sau cùng, giấy nitrocellulose thấm ADN cho vào bình lai có ADN dò Nếu phân tử ADN sỢi đơn mang gen tương ứng vối ADN dò có kết hỢp ADN sỢi đơn vói sỢi đơn ADN dò tạo nên phân tử lai theo nguyên tắc bổ sung cặp Nu Trên giấy nitrocellulose băng kết hỢp ADN dò vói ADN đích Băng nhìn thấy dùng tự chụp hình phóng xạ dùng hóa chất 5.2.2 P hương p h p N o rth ern b lo ttin g Khác với phương pháp Southern blotting, acid nucleic đích ARN ADN Phát ARN cách lai với cADN đánh dấu kỹ thuật gọi Northern blotting 5.2.3 Phương p h p Dot blotting - Slot blotting Lai theo phương pháp dot-blot phương pháp sàng lọc nhanh thường thực với mẫu dò ASO (allele-specific oligonucleotide) để phân biệt khác alen vị trí Nu Phương pháp không cần điện di thạch mà thấm trực tiếp từ để xác định đoạn Nu khác Quy trình thực kỹ thuật qua bước sau: - Bước 1: dung dịch ADN đích biến tính nhiệt độ hay dung dịch kali để tách ADN sỢi kép thành ADN sỢi đơn - Bước 2: gắn ADN đích biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose màng nylon) - Bước 3: đưa màng lai chứa ADN đích vào dung dịch chứa ADN dò - Bước 4; sau khoảng 20 - 24 giò ADN dò gắn vào ADN đích tạo thành chuỗi kép - Bước 5: rửa màng lai, để khơ tự nhiên sau phân tích tự chụp hình phóng xạ Ngồi gắn ADN dò lên màng lai, ADN đích để dung dịch bưóc tương tự Phương pháp áp dụng để phân biệt alen khác chí vài Nu Với mục đích người ta tạo đầu dò ASO từ chuỗi Nu có kích thưốc khác Những đầu dò ASO thường có từ 15 - 20 Nu bình thưòng hoạt động dưối điều kiện lai, ỏ ADN kép đưỢc tạo kết hỢp dò đích base bổ sung dò đích tương hợp Nếu có khơng tương hợp (chỉ cần nối lệch) ADN dò đích tạo nên chuỗi xoắn kép khơng bền vững Bằng cách tăng nhiệt độ tốì đa 69 phát chỗ lệch Mặc dù ASO sử dụng phương pháp lai Southern blot, ASO đưỢc sử dụng thuận lợi hdn thực nghiệm dot-blot Nhìn chung kỹ thuật dot-blot bao gồm lấy dung dịch ADN đích (có thể tồn gen ngưồi), đơn giản thu đưỢc vết ADN ỏ màng nitrocellulose màng nylon Cần phân biệt kỹ thuật slot-blot dot-blot Hai kỹ thuật khác vết ADN thu Đơi vối dot-blot ADN thu đưỢc nằm ỏ màng nitrocellulose màng nylon dạng vết tròn, slot-blot ADN thu nằm ỏ rãnh mà khía trưốc màng nitrocellulose màng nylon 5.2,4 Kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang (Fluorescen.ce in situ hybridization: FISH) Cuối năm 1980, kỹ thuật FISH ứng dụng rộng rãi để phát bất thường NST Đây kỹ thuật đặc biệt có ý nghĩa chẩn đốn trước sinh thực nhân tế bào gian kỳ không cần qua thòi gian ni cấy Vì vậy, sau 24 - 48 có kết Mẫu tế bào lấy sóm từ tuần 12 (số lượng mẫu dịch ối - ml) Kỹ thuật FISH kỹ thuật di truyền tế bào - phân tử sử dụng trình tự chuỗi ngắn ADN sỢi đơn (ADN dò), ADN dò lai vởi ADN đích tiêu NST ỏ kỳ gian kỳ Dưới kính hiển vi huỳnh quang ta phát hiện, định vỊ chỗ ADN dò lai vối ADN đích Nhò vậy, phát rơi loạn số lượng cấu trúc NST Có loại ADN dò sau: - ADN dò phần tâm: loại ADN dò chủ yếu sử dụng để phát bất thường số lượng NST phát NST nhiều tâm, mảnh khơng tâm - ADN ậò đặc hiệu locus lai vùng NST: loại ADN dò chủ yếu phát đột biến gen - rôl loạn cấu trúc NST như; nhân đoạn nhỏ, đoạn nhỏ v.v mà phương pháp nhuộm băng không phát - ADN dò tồn NST: dùng ADN dò lai dọc theo chiều dài NST Điều cho phép phân biệt NST khác dựa vào màu sắc chúng Phương pháp chủ yếu phát rổì loạn sơ”lượng, cấu trúc NST ví dụ phát phần NST gắn thêm phần NST khác trường hỢp chuyển đoạn - Ngồi ra, có kỹ thuật mBand FISH (multicolor íluorescence in situ hybridization) để phát bất thường vị trí băng NST 70 - ứng dụng kỹ thuật FISH chẩn đoán trước sinh hội chứng Down: sử dụng ADN dò NST 21; nhân tế bào gian kỳ có tín hiệu lai -> NST 21; có tín hiệu lai -> NST 21 5.2.5 Lai AĐN công nghệ sinh học - tao gen đơn dòng Mục đích kỹ thuật: đưa đoạn ADN (gen) cần thiết vào, loại bỏ đoạn ADN bất lợi để tạo nên phân tử ADN lai quy định tổng hỢp nên sản phẩm (chê phẩm) có chất lượng cao, vói sơ" lượng nhiều hơn, thòi gian sản xuất ngắn Để thực kỹ thuật cần: phân tử ADN cho (có chất lượng tơ"t), phân tử ADN nhận (có khả nhân lên nhanh) Các bước kỹ th u ật bao gồm: - Chọn ADN cho ADN nhận hay gọi vector (thể truyền) Vector thưòng dùng plasmid vi khuẩn, phage, đơi người ta dùng cosmid Gen tái Mảng ADN lạ Gen kháng Kanamycin / Enzym cắt Gen kháng Tetracyclin Nơi tác dụng enzym cắt - Dùiíg eiizym giúi liạii để cắt ADN cho ADN vector - Dùng enzym nổì (ligase) để nổì đoạn ADN cho phân tử ADN vector để tạo phân tử lai Khàng Kanamycin Cảm ứng tetracyclin Khảng Kanamycin Kháng tetracyclin - Trong trường hỢp muôn đưa phân tử ADN lai Hình 3.5 Các bước để tạo phản tử ADN lai cống nghệ gen vào vi khuẩn, ví dụ vào E coli, người ta dùng CaClx để tạo điều kiện cho phân tử lai xâm nhập vào vi khuẩn dễ dàng hờn Các phân tử ADN đưa vào vi khuẩn nhân lên, có phân tử lai, có phân tử chưa nhận ADN cho cần phân 71 lập riêng phân tử lai, ví dụ trường hỢp vi k h u ẩn khán g kháng sinh, có vi khuẩn mọc môi trường kháng sinh (chưa nhận phân tử cho mang tính cảm ứng vối kháng sinh), có vi khuẩn khơng mọc đựơc mơi trường đoạn ADN mang tính chất kháng kháng sinh thay đoạn ADN cảm ứng với kháng sinh - Bằng phương pháp vi sinh vật học, người ta cấy truyền khuẩn lạc mang tính chất cần nghiên cứu - Người ta dùng phương pháp chuyến khuẩn lạc từ đĩa cấy petri sang giấy thấm, sau cho lai với ADN dò sau làm biến tính ADN đích, kết lai đưỢc đánh giá tự chụp hìn h phóng xạ để p h t k h u ẩn lạc cần tìm - Sự nhân lên nhiều lần loại khuẩn lạc mang phân tử ADN đích vi khuẩn gọi tạo dòng invivo HIỆN TƯỢNG ĐA HỈNH VỂ C H lỂ DÀI CỦA CÁC ĐOẠN ADN DO ENZYM GIỚI HẠN TẠO NÊN (R estriction fragm ent length polymorphisms: RFLP) Khi có ADN dò cho bệnh việc chẩn đốn bệnh thực phương pháp Southern blotting nêu ỏ Nhưng thực tế, số ADN dò biết rấ t Trong trường hỢp chưa biết ADN dò, để chẩn đốn bệnh ngưòi ta dùng phương pháp gián tiếp, phương pháp dùng thay đổi tự nhiên ADN hay gọi RFLP Vậy RFLP gì? RFLP tưỢng đa hình chiều dài đoạn ADN enzym giới hạn tạo nên Người ta ước tính khoảng 10% ADN người tham gia vào tổng hợp protein, phần lại có chức chưa đưỢc rõ đoạn ADN không tham gia tổng hỢp protein, có th ể có th a y đổi base không ảnh hưỏng đến kiểu hình Tuy nhiên thay đổi xác định chúng làm thay đổi đoạn enzym giới hạn tạo nên, làm thay đổi số lượng, chiều dài đoạn cắt Ví dụ: phân tử ADN có vị trí cắt, đoạn ADN tạo thành, có vị trí cắt có đoạn cắt tạo thành Những thay đổi đoạn nhận diện phương pháp điện di Sự nhận diện đoạn phụ thuộc vào ADN dò dùng, phụ thuộc vào vị trí ADN dò dùng Nếu gen đích (ví dụ gen bệnh) liên kết với vị trí RFLP, có nghĩa gen vị trí RFLP ỏ NST gần tạo nên tái tổ hợp di truyền trình giảm phân Sự 72 nghiên cứu ADN tái tổ hỢp gia đình cho phép chẩn đoán kiểu gen Như RFLP dùng dấu ấn (marker) chẩn đoán bệnh trước sinh sau sinh tử chưa có biểu bệnh RFLP đưỢc dùng để phân biệt th ể đồng hỢp hay th ể dị hỢp Kan Dozy ngưòi dùng RFLP để chẩn đoán Các tác giả chứng minh gia đình có bệnh hồng cầu liềm (HbS) enzym cắt Hpa I cắt ADN tạo nên đoạn có kích thước khác nhau, đoạn phân ly với gen lành, đoạn khác phân ly với gen HbS Kiến thức đưỢc dùng cho chẩn đoán trước sinh Hiện tượng da hình chiều dài đoạn enzym giới hạn di truyền theo quy luật Mendel RFLP phương pháp dùng để lập đồ gen DẤU ẤN ADN (DNA F in gerp rin tin g) “ Mục đích kỹ thuật: kỹ thuật nhằm phân biệt người với người khác, cá thể lồi dựa vào có mặt phân bô" vạch ADN giốhg dùng dấu vân da bàn tay - Nguyên lý kỹ thuật: dấu ấn ADN có tên VNTR (variable number of tandem repeats) hay gọi microsatellite, có 11 tói 60 đơi base, dấu ấn có mặt nhắc nhắc lại nhiều lần gen Sự có mặt đoạn ADN dấu ấn đặc trưng cho cá thể - Số lần nhắc lại dấu ấn khác locus dấu ấn ADN giơVig gặp vị trí khác een Nếu locus gen nằm phạm vi đoạn bị cắt enzym giỏi hạn chiều dài đoạn cắt thay đổi tùy theo sô' lần nhắc lại VNTR - Tính đa hình VNTR đặc trưng kỹ thuật sử dụng việc xác định phụ hệ y pháp - Kỹ thuật để phát VNTR: bao gồm bước tiến hành Southern blotting đến bước chuyển VNTR sang giấy nitrocellulose sau lai ADN đích với ADN dò để phát phân tử lai Ngày nay, sau phát kỹ thuật PCR người ta phát trực tiếp VNTR với đôi mồi đặc hiệu Một s ố tra n g thiết bị cho ph òn g thí nghiệm p h â n tử Để ứng dụng số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng y học tách chiết ADN - P c Ìr 73 T rang th iế t bị - Máy ly tâm thơng thường phòng thí nghiệm vdi ống ly tâm (5 - lOOml) ly tâm ống nhỏ (0,5 - Ịil) Máy ly tâm lạnh - Tủ ấm, bình cách thủy (tơ"t bình có lắc) - Tủ lạnh từ 4°c đến -20°c -80°C: tùy mức độ bảo quản mẫu, bảo quản ADN nitơ lỏng với thời gian dài hàng chục năm - Tủ ấm 37“C, máy đo pH, máy lắc, máy sấy khô, máy hấp ẩm (tiệt trùng), tủ sấy với nhiệt độ cao, cân (có thể cân đưỢc g, mg) - Micropipet loại: 0,5 - 100fil; 20 - IOOịaI; 200 - 1000f.ll, loại đầu týp cho micropipet - Ống Eppendort, loại ông đong, loại dụng cụ thơng thường phòng xét nghiệm sinh hóa chai, cơc , giấy thiê^, giấy thị màu Hóa chất - Hóa chất dùng để tách ADN - AKN - Hóa chất pha dung dịch đệm Tham khảo thực tập Di truyền Y học Bài “Một sô' kỹ th u ật sinh học phân tử thông dụng ứng dụng Y học” Những máy thông dụng - Thiết bị soi tử ngoại - Máy điện di - Máy PCR T ự LƯỢNG GIÁ Trình bày phương pháp tách chiết ADN phương pháp điện di ADN Trình bày đặc điểm chức củaenzym giới hạn (enzym hạn T rình bày nguyên lý phương pháp xác định chế) trìn h tự nucleotid phân tử ADN Nêu đặc điểm ADN dò, phương pháp tạo ADN dò Trình bày kỹ thuật Southern Blotting Trình bày kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction): phản ứng chuỗi polymerase Nêu tưỢng đa hình chiều dài đoạn ADN enzym giối hạn tạo nên (RFLP) 74 Chương BỘ GEN CỦA NGỮỜI MỤC TIEU N khái niệm gen người, mục tiêu ý nghĩa dự án đồ gen người Trinh bày đưỢc đặc điểm gen người Trinh bày sô'phương pháp xác định đồ di truyền đồ hỉnh thể BỘ• GEN LÀ GÌ? Ý NGHĨA CỦA VIỆC DựN G BẢN Đ GEN NGƯỜI • • Bộ gen (genome) tồn đơn vị di truyền chứa đdn bội (n) NST lồi Mỗi giao tử bình thường chứa gen, tê bào soma chứa gcn Bộ gen người phân bơ' vỊ trí xác định gen chuỗi ADN tren 24 NST ngưồi (22 NST thường NST X, Y) Ngày ngưòi ta quan tâm đến gen nhân, gen nằm ADN ty thể Trong tê bào sinh dưỡng bình thường, gen nhân có hai gen ty thể phải có hàng ngàn bản, tế bào có nhân có tối ngàn ty thể Bản đồ gen người kết mô tả định vị gen NST người Theo truyền thống đồ đưỢc phân chia theo vùng tương ứng với băng 24 NST (22 NST thường + X + Y) Trước di truyền học phân tử đòi, việc xây dựng đồ gen tiến hành chậm chạp Sự đòi di truyền học phân tử gỡ mối bê tắc nghiêr cứu xây dựng đồ gen người, vạch đường nét cho nghiên cứu 75 Tháng 10 năm 1990, nước Mỹ lần thức công bô' Dự án gen người (Human genome project) Một loạt quổc gia khác Anh, Pháp, Nhật, Canada Đức có đầu tư đáng kể cho Dự án gen người Ba mục tiêu dự án là: - Dựng đồ di truyền (Genetic map) - Dựng đồ hình thể (Physical map) - Xác định trình tự ba tỷ đôi base gen người Nhiễm sắc thể illli liill Bản đổ di truyén Bản đổ hình thể Giải trình tự ADN V .ACQTTACCQTACTTAACQCCrA Hình 4.1 Sơ đố tóm lắt mục lièu khoa học chinh cùa dự án bơ gon người Xây dựng gen ngưòi với việc hoàn thành ba mục tiêu nêu cung cấp kiến thức, sỏ khoa học để: - Giải thích rõ nguyên nhân, chế nhiều tính trạng bình thường bệnh lý từ có chẩn đốn, điều trị xác hơn, hiệu - Tách dòng gen để nghiên cứu, để sửa chữa gen phục vụ điều trị gen (Gene therapy) - Sản xuất sản phẩm gen (các loại protein) phục vụ đòi sốhg, chẩn đoán, điều trị ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI Khoa học ước tính gen đơn bội người gồm ba tỷ đôi base ADN người ADN Eukaryota khác bao gồm trình tự mã hóa 76 (các exon) xen kẽ vối trình tự khơng mã hóa (intron) Tùy mức độ có mặt chúng nhân mà trình tự ADN chia làm ba loại: - ADN có trình tự nhất; gen mã hóa cho protein, chiếm khoảng 10% gen Thuật ngữ gen có gần th ế kỷ (Johansen, 1909) khái niệm gen, thực thể thê thật bí ẩn, khám phá tiếp tục Theo nghĩa truyền thống, gen vật chất di truyền định tính trạng xác định, hay nói tương đốì xác hđn, sau Mendel, gen đoạn ADN mã hóa protein xác định Nhưng sau người ta thấy không thiết gen định tính trạng mà có nhiều gen định tính trạng biểu gen phụ thuộc nhiều nhân tố nên hình thành loại tính trạng di truyền đa nhân tơ” Thế biểu gen qua tính trạng, qua kiểu hình, thân gen, chân dung nay, di truyền học phân tử phát triển cao độ khái niệm gen chưa thực hiểu biết hết Các gen dịch protein ARN polymerase II gen gọi gen nhóm II Các gen mã hóa loại protein Gen sinh vật bậc cao bị gián đoạn bỏi vùng không mã hóa Thường gen phía 5’ vùng chứa yếu tố điều chỉnh, kế vùng khởi động, hai vùng gộp lại thành vùng điều chỉnh Tiếp theo vùng mã hóa Các vùng mã hóa gọi exon bị gián cách vùng khơng mã hóa gọi intron Exon có thêm vùng gọi vùng khởi đầu dịch mã, exon cuối có thêm phía sau vùng kết thúc dịch mã Hai vùng thuộc exon Sô" lượng exon gen khác khơng giống Ví dụ gen fetoprotein huyết chuột nhắt gồm 15 exon; exon ngắn gồm 53 đôi base, exon dài gồm 280 đôi base, tổng chiều dài exon 2229 đôi base Gen cấu trúc người (đoạn ADN) gồm đoạn exon xen kẽ intron Toàn đoạn intron exon phiên mã thành phân tử mARN tiền thân Phân tử mARN tiền thân cắt loại đoạn mRAN phiên mã từ intron nối đoạn mARN phiên mã từ exon để tạo thành phân tử mARN thục Số lượng intron gen giốhg số lượng exon nó, khơng giốhg gen Kích thước gen nói chung biến thiên, có gen lớn triệu đơi base (gen Dystrophin) Khơng có mồì tương quan trực tiếp kích thước protein vối chiều dài gen mã hóa nó, người ta thấy chuỗi peptid lớn tương ứng với gen lớn - ADN có trình tự lặp lại nhiều lần (ADN vệ tinh): chiếm khoảng 10 - 15% gen, trình tự khơng mã hóa Phần lốn ADN vệ tinh khu trú vùng 77 tâm NST, tương ứng vối Dăng c tức phần dị nhiễm sắc cấu trúc Các chuỗi Nu không phân tán NST mà khu trú tập trung, chức chưa rõ ADN lặp lại nhiều lần chia thành hai loại: loại thứ có chuỗi nucleotid ngắn (5 - 10 đơi base) xếp nối nhau, sơ lượng tới hàng trăm triệu Các chuỗi tăng methyl hóa ỗ tê bào soma giảm methyl hóa tế bào tạo giao tử, NST Y Loại thứ hai có chuỗi Nu dài hơn, từ 100 đến 200 đơi base, xếp nơi Ngồi hai loại có tính khu trú trên, có loại có tính phân tán gọi vệ tinh nhỏ (minisatellite) không nằm vùng dị nhiễm sắc cấu trúc, loại có ích cho việc lập đồ gen ADN có trình tự lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% gen ngưòi, chúng có cấu trúc gồm đoạn chuỗi Nu lặp lại đoạn chuỗi dài hơn, từ 100 đến 1000 đôi base, đồng nhiều so vói loại lặp lại nhiều lần Loại ADN phân tán toàn gen, phần lốn chúng không thấy hoạt động phiên mã Chúng khơng mã hóa có chức phiên mã: chúng gen rARN, tARN số gen khác Ngoài ba loại trình tự kể trên, gen người có.các gen nhẩy (transposon), đoạn ADN có khả tích hỢp vào đâu gen Như vậy, dựng đồ gen bao gồm xác định vị trí gen mã hóa protein (coding genes) đồng thời xác định vị trí đoạn ADN khơng mã hóa, có tính đa hình Hình 4.2 giới thiệu sơ lượng gen mã hóa đưỢc phát theo thòi gian N g h ln Hình 4.2 Số lượng nhữtig gen mã hóa đưực phát theo thời gian 78 Với tiêu chuẩn lập đồ gen ngưòi, ngưòi ta lập hai loại đồ: đồ di truyền đồ hình thể Bản đồ di truyền dựa vào kết phân tích tổ hỢp lại phương pháp thổhg kê gián tiếp Bản đồ hình thể dựa vào đo đạc trực tiếp chiều dài ADN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH BẢN Đ DI TRƯYỂN v BẢN ĐỒ HÌNH THỂ 3.1 Bản đồ di tru yền Phương pháp phân tích gen liên kết Phương pháp phân tích gen liên kết phương pháp phân tích cốt yếu để lập đồ di truyền Các gen NST tạo thành nhóm liên kết Các gen liên kết thường phân ly với Mức độ liên kết gen xác định qua phân tích gia hệ Khoảng cách di truyền biểu thị centimorgan (cM) Centimorgan gọi đơn vị tổ hỢp lại, khoảng cách hai locus đơn vị tổ hỢp lại tần số tổ hỢp lại hai locus 1% qua phân bào giảm nhiễm Locus gen quy định tính trạng bệnh xác định (nhóm máu, dạng protein, ADN - RFLP ) coi cột tiêu Khi phân tích gia hệ, tính trạng cột tiêu gen bệnh cần xác định vỊ trí (gen đích) phân ly độc lập, kết luận gen NST khác NST xa (liên kết khơng hồn tồn) Nếu di truyền hai tính trạng ln cho hai locus gần NST Sự trao đổi chéo xẩy troug giảm phâỉi cU sở tái tổ hợp lại người trung bình có khoảng từ 30 - 35 trao đổi chéo qua lần phân bào ỏ nam giới, số nữ giới gần gấp đơi Khi dùng enzym giới hạn để cắt ADN, người ta phát thấy tính đa hình chiều dài đoạn ADN đưỢc cắt enzym (Restriction Pragm ent Length Polymorphism = RFLP) cá thể khác đa hình di truyền theo Mendel Việc phát đa hình ADN khâc (vệ tinh nhỏ, minisatellite) vệ tinh siêu nhỏ (microsatellite) đóng vai trò cột tiêu gen Bằng sử dụng enzym giới hạn ADN dò (DNA probe) thích hỢp thúc đẩy nhanh việc xây dựng đồ gen liên kết Hình 4.3 minh họa di truyền nhóm máu ABO MN gia đình bị dị tật giảm sản xương bánh chè, loạn sản móng viêm thận người trưỏng thành (Nail - Patella syndrome) 79 ... thai T y theo đối tượng nghiên cứu, phục vụ mà hình thành phân mơn di truyền học người như: di truyền sản khoa, di truyền nhi khoa, di truyền huyết học, di truyền tâm thần 2.7 Di tru y n u n... ứ ữ DI TRUYỀN HỌC NGỦỜI MỤC TIÊU Nêu lược sử phát triển di truyền học người Nêu nội dung di truyền học người Trinh b y phương pháp nghiên cứu di truyền học người LƯỢC SỬ CỦA DI TRUYỀN Y HỌC 1.1... nói đau Để đáp ứng y u cầu Y học, bên cạnh cuốh Các nguyên lý sinh học, Bộ môn Y Sinh học - Di truyền Đại học Y Hà Nội soạn thảo sách Di truyền Y học Nội dung sách Di truyền Y học biên soạn theo