Sinh học phân tử dùng cho đào tạo dược sỹ đại học

BỘ Y TÊ ■ PHAN TU (DÙNG CHO ĐÀO TẠO Dược sĩ ĐẠI HỌC) T T T T -T V * Đ H Q G H N NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC BỘ Y TÊ SINH HỌC PHÂN TỬ pÙ N G CHO ĐÀO TẠO DƯỢC s ĩ ĐẠI HỌC) M ã số: Đ 20.X 06 (Tái hấìì lăn thứ nhất) NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DUC Chỉ đao biên soan: VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ Chủ biên: GS.TS NGUYỄN VĂN THANH Những người biên soạn: GS.TS NGUYỄN VĂN THANH TS TRẦN THU HOA TS TRẦN CÁT ĐƠNG ThS HỒ THỊ N LINH Tham gia tơ chức bẩn thảo: ThS PHÍ VÀN THÂM TS NGUYỄN MẠNH PHA í' Ban q i i yc n t h u ộ c Hộ Y lê ( V ụ K h o a h ọ c \ Đ o l ạo) 04 200 9/C' XB /4 76 2117/Cl l) M ã s ổ : K 1y ‘) DAI Ẩ lờ i ỹiớ i tkiệu Thực m ột sô'điều Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & Đào tạo Bộ Y tế ban hành chương trình khung đảo tạo Dược s ĩ đại học Bộ Y tế tổ chức biên soạn tài liệu dạy - học m ôn sở chuyên m ôn theo chương binh nhằm từnẹ bước xây dụìig hộ sách đạt chuẩn chun m ơn h'ong cơng tác đào tạo nhân lực ỵ tế Sách SIN H H OC P H Á N T Ử đ Ợ c biên soạn dựa chương trìiih giáo dục Trường Đại học Y DưỢc Thầnli p h ô 'H Chí Minh sở chương trìnli khung p h ê d u yệt Sách tác giả GS.TS N guyễn Văn Thanh, TS Trần Thu Hoa, TS Trần Cát Đông, ThS H Thị Yến Linh hiên soạn theo phương châm: Kiến thức bản, hệ thống; nội dung xác, khoa học; cập nhật tiến khoa học, k ỹ tìm ậthiện đại thực tiễn Việt Nam Sách SIN H H ỌC P H Â N TỬ dã dược H ội đồng chuyên m ôn thẩm định sách tài liệu dạy - học chuyên ngành DưỢc s ĩ dại học Bộ Y tê'thẩm định vào năm 2007 Bộ Y tếq u ỵết định han hành tài liệu dạy - học đạt chuẩn chuyên mồn ngành ừong g i a i đoạn Trong thời gian từ dêh năm, sách phải d Ợ c chỉnh ỉý, b ổ sung cập n lĩậ t Bộ Y tếxỉii chân ửìànli cảm Ơ11 tác giả H ội đồng chuyên m ôn thẩm định ẹiúp hoàn thành sách; cảm ơn PGS TS N guyễn Văn Ty, PGS TS Đừũi HŨĨI Dung dọc phản biện, đ ể sách hoàn thằiĩh kịp thời phuc vụ cho công tác đào tạo nliân lực y tê' Lần dầu xuất bẩn, m ong nhận dược ý kiến đóng góp đồng nghiệp, bạn sinh viên độc giả dê lần xuất bẩn sau đưỢc hoàn thiện VU KHOA HOC VÀ ĐÀO TAO - BÔ Y TẾ LỜI NỐI ĐẦU Năm 1909, Johansen w xuất chuyên khảo "Các yếu tố học thuyết đắn biên dị di truyền" (Element de exakten Erblichkeitslehre) lần xuất từ gen Năm 1953, Watson Crick khám phá mơ hình xoắn kép ADN thúc đẩy nhanh chóng phát triển di truyền học mức độ phân tử Năm 1965, J Watson xuất sách "Sinh học phân tử gen" dày 494 trang đến năm 1976, lần tái lần thứ ba dày lên 739 trang Tiếp sau đó, hàng loạt tài liệu Sinh học phân tử đời Cho đến ngày - - 0 , Washington D c, công ty tư nhân Celera Genomics (Anh) Dự án Bộ gen Người (Human Genome Project) Viện nghiên cứu Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ (National Institute of Health) phác thảo đồ gen người Theo đó, gen người có 3,12 tỉ nucleotid 97% tổng nucleotid xác định trình tự, có 85% số trình tự đặt vị trí Khoảng 3% ADN có chứa gen, 97% lại ADN "không chức năng" Trong tổng số 3% ADN có khoảng 30 - 50000 gen Ngày 14 - - 2003, Tổ chức Quốc tế Định trình tự Bộ gen Người (International Hum an Genome Sequencing Consortium) tuyên bố hồn thành cơng đoạn cuối đồ gen ngưòi Kế đồ gen, phương pháp tìm gen có tính chất trị liệu thực quy mô lớn Dược lý gen (Pharmacogenomics) khám phá sâu gen người để ứng dụng ngành Dược Sách "Sinh học phân tử" nhằm giúp cho sinh viên DưỢc khoa hiểu cấu trúc chức gen Sách gồm bài: Nhập môn; Sao chép ADNCác loại ARN; Sự phiên mã mã di truyền; Sinh tổng hỢp protein; Điều hoà hoạt động gen; Bộ gen tế bào nhân thật; Đột biến gen - Các phương pháp phân tích ADN Sách xuất lần đầu nên khó tránh khỏi thiếu sót Các tác giả mong nhận góp ý độc giả CÁC TÁC GIẢ MỤC LỤC Trang LỜI GIỚI THIỆU LỜI NÓI Đ Ầ U CÁC Từ VIẾT T Ắ T BẢNG ĐỐI CHIỂU THUẬT NGỮ VIỆT - AN H 11 BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT 17 B il NHẬP MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ 23 1.1 Lược s 23 1.2 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 28 1.3 Những đóng góp lớn sinh học phân tử n a y 30 Câu hỏi 38 Bài SAO CHÉP A D N 40 2.1 Khái niệm 40 2.2 Sự chép A D N 41 2.3 Sửa sai chép không chép 57 Câu hỏi 58 Bài CÁC LOẠI ARN 60 3.1 Khái niệm 60 3.2 Các ARN vai trò chúng 61 Câu hỏi 80 Bài Sự PHIÊN MÃ VÀ MÃ DI TRUYỀN 82 4.1 Mở đ ầu 82 4.2 Nguyên tắc chung 83 4.3 Sự phiên mâ tế bào nhân nguyên th u ỷ .84 4.4 Sự phiên mã tế bào nhân thật 91 4.5 Phiên mã ngược retrovirus 97 4.6 Mã di tru yề n 98 Câu hỏi 100 Bài SINH TỔNG HỢP PROTEIN 102 5.1 Mỏ đầ u 102 5.2 Các yếu tố cần thiết cho tổng hợp protein 102 5.3 Diễn biến dịch mã ribosom (chu trình ribosom) 109 5.4 Nhu cầu lượng cho trình sinh tổng hợp protein 118 5.5 Độ xác trình dịch mâ 120 5.6 Các yếu tố ức chế trình dịch mã 121 Câu hỏi 123 Bài ĐIỂU HOÀ HOẠT ĐỘNG GEN 125 6.1 Mở đầ u 125 6.2 Điều hồ q trình chép 126 6.3 Điều hồ q trình phiên mã 127 6.4 Kiểm soát sau dịch m ã 138 Câu hỏi 140 Bài7 BỘ GEN TÊ'BÀO NHÂN THẬT 142 7.1 Mở đ ầu 142 7.2 Tổ chức gen tế bào nhân th ậ t 142 7.3 Các mức độ điều hoà biểu g e n 152 7.4 Điều hồ hoạt tính gen tế bào nhân th ậ t 155 7.5 Sự kiểm soát chất thường gặp nhân 161 Câu hỏi 163 Bài ĐỘT BIỂN G E N 165 8.1 Mở đầ u 165 8.2 Các loại đột biến 167 8.3 Nguyên nhân đột b iến .169 8.4 Các chế chống lại đột biến 178 8.5 Các tính trạng đột biến protein đột b iế n 183 8.6 Đột biến gen ung thư 187 8.7 Các hệ thống chọn lọc đột biến vi sinh vật 189 Câu hỏi 192 Bài CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN 194 9.1 Chiết tách ADN 194 9.2 Các phương pháp phân tích định tính định lượng sơ acid nucleic 195 9.3 Kỹ thuật cắt, nối, lai ADN ứng dụng 197 9.4 Các phương pháp xác định trình tự ADN 200 9.5 P C R ! 202 Câu hỏi .216 ĐÁP ÁN 218 TÀI LIÊU THAM KHẢO 219 CÁC TỪ VIẾT TẮT / Adenine /DN Acid desoxyribonucleic /iDS Acquired immune - deficiency syndrome /p Apurinic or apyrimidinic /RN Acid ribonucleic to Base pair c Cytosine củ.DN Complementary DNA ds Coding sequence CpG c phosphat G (TF CCAAT binding Trascription Pactor [MD Duchenne muscular dystrophy ['Nase Deoxyribonuclease (NTP Desoxyribonucleozid triphosphat (SADN Double - stranded DNA (EF Eukaryote elongation factor EF Elongation íactor »IF Eukaryote initiation factor fRF Eukaryote release tactor EGF Epidermal grovvth tactor ÍRET Pluorescence resonance energy transfer ỉ Guanine 9MO Genetic modiíied organism iír High írequency recombination High írequency transduction iiv Human immunodeficiency virus inARN Heterogenous nuclear RNA or Insensitive to catabolite repression F Initiation factor GS Internal guide sequence íb Kilobase INE Long interspersed repetitive element yiALDI-TOF Mathx - assisted lazer desorption ionization time - of - fligt nARN Messenger RNA slAAAP N - acetoxy - - acetylaminoíluorene 10 NAD Nicotinamide - adenine dinucleotide NER Nucleotide excision repair NF Neuroíibromatosis NF1 Neuroíibromatosis type NMN Nicotinamide mononucleotide NMP Nucleotide monophosphat Ori Origin of replication PCR Polymerase Chain reaction PDGF Platelet - derived grovvth factor PFGE Pulse field gel electrophoresis Pi lnefficient promoter PKU Phenylketonuria PR Photoreactivation Rad Radiation absorbed dose rARN Ribosome RNA RE Restriction enzyme, restriction endonuclease Rem Roentgen equivalent man RF Release factor RFI Replicative form RFLP Restriction íragments length polymorphism RNase Ribonuclease RNP Ribonucieoprotein RRF Ribosome release factor scRNA Small cytoplasmic RNA SINE Short interspersed repetitive element snRNA SmaN nuclear RNA SPR Suríace plasmon resonace SRP Signal recognition particle SSB Single - stranded binding ssADN Single - stranded DNA T Thymine tRNA Transíer RNA THE Transposable human element THR Thyroid Hormon Receptor Tm Melting temperature u Uraciie UTR Untranslated region B-ÌNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT - ANH Tiếig Việt Tiếng Anh AD'1 bổ sung Complementary DNA ADvl sỢi đôi Double - stranded DNA AD*] sỢi đơn Single - stranded DNA AD>J vi vệ tinh Microsatellite DNA Alkipton niệu Alkaptonuria AR'i nhân không đồng nhất, hnARN Heterogenous nuclear RNA ARnI nhân nhỏ, snARN Small nuclear RNA AFN polymerase phụ thuộc ADN DNA - dependent RNA polymerase AFN ribosom Ribosomal RNA AFN tê bào chất nhỏ, scARN Small cytoplasmic RNA ARM thòng tin Messenger RNA AFN vận chuyển Transter RNA Ba^e đồng đẳng Base analogue Bệih hồng ban liipus Systemic lupus erythematosus Bệih loạn dưỡng Duchenne Duchenne muscular dystrophy Bim nạp Transtormation Bệ ba kết thúc stop codon B(' gen Genome B( suy giảm Attenuator Bng bóng chép Replication bubble Clạc ba chép Replicating fork Clất cảm ứng Inducer ctất dị nhiễm sắc Heterochromatin Ciất dị nhiễm sắc cấu Constitutive heterochromatin Ciất hoạt hoá Activator Ciất nguyên nhiễm sắc Euchromatin Ciất nhiễm sắc Chromatin 11 có ]0 n Mg“ ^ cần đưa vào ơng nghiệm có chứa ADN khn Dung tích tổng số thư ng ÕO |.i] 20 i-il H ỗn hỢp p h ả n ứ n g đưỢc cho vào ố n g n h ự a nhỏ chịu nhiệt, có nắp đậy Một phản ứng PCR gồm thành phần hay vật liệu ban đầu: mạch khuôn cho khuêch đại, đoạn mồi oligonucleotide, dNTP ADN polymerase chịu nhiệt với dung dịch đệm phản ứng thích hỢp MgCl;, Nồng độ rủa mơi thành phần tuỳ yêu cầu Trừ ADN khuôn đoạn mồi, thành phần cho PCR có sẵn từ nhà cung cấp, 9.5.4.1 Các p o lym era se c h iu n h iê t Enzym ADN polymerase sử dụng PCR đoạn Kỉenoio ADN polymerase I Đcặc tính đoạn xúc tác tổng hỢp ADN theo chiều õ’- 3’ có hoạt tính exonuclease (thuỷ giải liên kết nucleotide từ đầu phân tử ADN) theo chiều 3’ - 5’ Tuy nhiên enzym không chịu đưỢc nhiệt nên thao tác phức tạp hiệu thàp (phải thêm enzym vào phản ứng sau lần biến tính enzym cũ bị nhiệt phân huỷ, nhiệt độ lai thấp khiến khuếch đại không đặc hiệu vv ) Hiện thường dùng ADN polymerase Taq polymerase chịu nhiệt, tách c h iêt từ m ột lồi vi k h u ẩ n SI nưỏc n óng có tê n Thermiis aquaticus E nzym Hcày k h ôn g bị p h h u ỷ n h iệ t độ b iến tín h xúc tác tổ n g hỢp từ đầu đến cuối trình phản ứng Taq polymerase có sẵn thị trường từ cơng ty cơng nghệ sinh học Các polymerase chịu nhiệt khác có thị trường bao gồm Vent polymerase phân lập từ Thermococcus lừoralis, xúc tác tổng hỢp nhiều xác từ mạch khn Taq polymerase Ngồi có Tth polymerase phân lập từ Thennus thermophilus Các polymerase chịu nhiệt thành phần đắt PCR thường đưỢc sử dụng đơn vị cho phản ứng Hàm lượng đủ đê xúc tác cho khuếch đại khoảng 40 chu kỳ máy PCR Trưỏc đây, việc lựa chọn polymerase chịu nhiệt cho thí nghiệm khơng khó khăn có loại ADN polymerase chịu nhiệt {Taq) Hiện có nhiều loại polymerase có nguồn gốc khác nhau, nhiều polymerase biên đổi di tru 3'^ền chúng ưu việt polymerase gôc phạm vi vài ứng dụng (bảng 9.2) Sự chọn lựa polymerase chịu nhiệt cho thí nghiệm PCR phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm 207 Bảng 9.2 Các loại ADN polymerase thường gặp Enzym Nguồn gốc Nơi ỏ Taq Thermus aquaticus Suối nước nóng AmpliTaq Tag tái tổ hợp AmpliTaq AmpliTag cắt bỏ 289 aa N - tận Stoffel Tth Thermus thermophilus Suối nước nóng Ultima Thermotoga maritima Dòng chảy nóng Vent Thermococcus litoralis Vent (Exo ) Vent tái tổ hợp Deep Vent Pyrococcus sp Pfu Pyrococcus turiosus Strain GB - D Mức ổn đinh Hoạt động 95°c (t;,,) tối ưu Cation cần thiết 3'->5’ Exonuclease 40 phút 50- 75 MgCI^ - 40 phút 50- 75 MgCl2 _ 80 phút 75- 80 MgCI^ 20 phút 55- 75 MnCl2 (RT), MgCl2 (PCR) + biển sâu Dòng chảy nóng biển sâu Dòng chảy nóng biển sâu Dòng chảy nóng biển sâu ỉ >95% hoạt động sau h 80 MgSO, + MgS0 - >95% hoạt động sau h 72- 80 MgSO, + >95% hoạt động sau h 75 MgClị + Phản ứng chuỗi cực nhạy, cần dùng phân tử ADN làm khuôn thu sản phẩm Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm cao nguyên nhân gây dương tính giả ADN ngoại nhiễm Phan ưng khuêch đại ưu xảy ADN th ật tinh khiết nhiều kỹ th u ậ t c h ẩ n đ oán b ằ n g PCR v ẫ n đ t k ế t tố t VỚI ADN th u n h ậ n trực tiế p từ dịch chiêt mâu thử (vêt máu, vật liệu lưu trữ, ADN cũ vi khuẩn tiệt trù n g) T u y n h iê n , tr o n g n h iề u trư ng hỢp kh ác, q u tr ìn h c h u ẩ n bị m ẫu p h ải th ự c h iệ n đ ể đ ả m bảo cho v iệc k h u ếch đại, c h ấ t úc c h ế n h h ep a rin EDTA, hay acid diện mẫu Mạch ADN khn mẫu ảnh hưởng đến phản ứng chuỗi Nếu ADN có chứa nhiều GC khó khăn cho việc tách rời chuỗi ADN nhiệt độ 208 cao Trong trường hỢp này, việc thêm formamide hay dimethyl sulfoxide (DMSO) vào hỗn hỢp phản ứng giải vấn đề Nồng độ ADN khuôn mẫu PCR ảnh hưởng đến mức độ khuếch đại Với việc sử dụng polymerase cho hiệu cao, lượng ADN mẫu sử dụng có khuynh hưỏng giảm (1 microgram 100 nanogram) Mặc dù khn mẫu đơn đưỢc khuếch đại khơng phải thí nghiệm đạt đưỢc nhạy cảm Do đó, nên thiết lập PCR với lượng ADN khn m ẫu thích hợp Lượng khn mẫu ADN dư thừa ảnh hưởng xấu đến q trìn h khuếch đại Nếu lượng ADN khn mẫu q cao có khuynh hướng tạo lượng lớn sản phâm kéo dài từ đoạn mồi sản phẩm nằm đoạn mồi Việc lựa chọn mồi, trình ủ lặp lại khơng thích hỢp có m ặt chất ức c h ế c ũ n g có thế’ làm g iảm k h u ếch đại ADN khn có thê gen tách từ tê bào, ADN từ ngân hàng genome cADN (chỉ cần nồng độ ng), ADN bất kỳ, ARN toàn ARNm 9.S.4.3 Các đ o a n m ồi Cac đoạn môi thành phân quyêt đinh khuêch đại đặc trưng có hiệu cao PCR Việc chọn đoạn mồi phải tuân thủ sơ' ngun tắc: - Trình tự mồi đưỢc chọn cho khơng thể có bắt cặp bổ sung cac môi tạo câu trúc bậc hai hay tạo dimer nucleotid đoạn mồi làm cho phản ứng giảm hiệu ngăn cản tạo th àn h đoạn mong muôn - Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại gen - Kích thưốc đoạn mơi tơi ưu từ 18 —25 nucleotid Đoạn mồi với kích thước đảm bảo cho việc gắn đặc hiệu nhiệt độ tối Ifii p-ịá thành cho môt đoạn mồi giảm thiểu - Khoảng cách hai mồi không dài kb Phản ứng PCR tối ưu trình tự nho kb Tuy nhiên có sơ enzym polymerase chịu nhiệt tổng hỢp đoạn ADN có kích thước kầoảng 30kb - Tỷ lệ GC mồi thường chiếm khoảng 40 - 75% Trong thành phần đoạn mồi tránh có nhiều cặp GC loạt nucleotid G c Vì liên kết G; c mạnh liên kết A: T (G nối vối c liên kết hydro A vối T có 2) Do vậy, việc bẻ gãy liên kết G: c cần nhiều nàng lượng liên kết A: T Người ta tính đưỢc nhiệt độ tối ưu cho việc ủ đoạn mồi PCR 209 nhiệt độ gọi Tm -5"C nhiệt độ "chảy" đoạn mồi trừ Kết có từ phép tính đơn giản; Tm = 2(A + T) + 4(G + C) Nhiệt độ ủ = Tm -Õ“C Các đoạn mồi tổng hỢp hoá học chất tải rán máy tống hợp oligonucleotide Các máy tự động hoá cao, dễ dàng tổng hỢp đoạn mồi Có nhiều quy tắc để thiêt kế đoạn mồi có sơ phần mềm cho chọn lựa cặp đoạn mồi tối ưu cho khuếch đại ADN khn mẫu có trình tự biết Nồng độ mồi khoảng 0,1 |iM đến I^M, Nồng độ thường xác định dựa vào giá trị OD (opticaỉ density) đo 260 nm 9.5.4.4 M a g n esiu m chlo rid e Nồng độ MgCL; ảnh hưởng đến thành công phản ứng, khơng có mặt Mg^“ khuếch đại không xảy MgCL> cần thiết cho hoạt động ADN polymerase ủ ADN vối đoạn mồi có mối tương quan với nucleolid tnphosphat Nồng độ MgCL; ưu cho PCR phải đưỢc xác định cho phàn ứng bàng thực nghiệm Có thể dùng phương pháp định phân bàng cách thiết lập loạt phản ứng với nồng độ MgCL; khác từ mM đến mM xác định nồng độ MgCL) ưu cho mẫu mong muô^n 9.5.4.Õ N u c le o tid trip h o sp h a t (dNTP) Bốn loại nucleotide thưòng đưỢc sử dụng nồng dộ 20 - 200 |aM/ loại nucleotid Nồng độ cao dễ dẫn đến khuếch đại "ký sinh" Sự cân thành phần nucleotid làm tăng lỗi chép polymerase 9.5.5 Chu kỳ n h iệ t PCR Phản ứng chuỗi khuếch đại ADN đạt chu kỳ ỉặp lặp lại Mỗi chu kỳ gồm biến tính cách nâng nhiệt độ, ủ cách hạ nhiệt độ kéo dài Một chu kỳ điển hình cho việc khuếch đại đoạn ADN gồm 500 cặp base biến tính ỏ 94‘’C 60 giây, ủ 50“C 60 giây 72‘’C 60 giây Mỗi PCR thiết kế tơ'i ưu hố khác tuỳ thuộc số yếu tố: Kích thước đoạn khuếch đại Các sản phẩm khuếch đại lớn cần giai đoạn biến tính kéo dài lâu Các đoạn ngắn cần thòi gian giai đoạn kéo dài 210 - Trình tự đoạn mồi diều kiện lon định nhiệt độ u tơt nhãt cho chu kỳ Vì vậy, clựa vào phản ứng đưỢc thực hiộn, nhiệt độ ủ thay đồi từ 37‘*c đến 65"C 9.5.6 u điếm nhưỢc đ iểm củ a phương pháp PCR Viộc ứng dụng I'ộng rãi kỹ thuật PCR có nhiều lý do: - Rất nhanh chóng Chỉ tơn khoảng khuếch đại trình tự mong mn biêt so với kỹ thuật công nghệ di truyền "cô điên" phải tuần hay - Đơn giản: PCR đưỢc thực ô'ng nhỏ với thành phần tối thiểu việc trộn chúng lại vối Các phương pháp tạo dòng gen điển hình khác cần có vật liệu mắc tiền màng nucleotid triphosphate đánh dấu phóng xạ kỹ thuật đặc biệt PCR thực mẫu có chứa ADN tương đối thơ, ví dụ vêt máu chưa đưỢc xử lý cho việc phân tích pháp y Điều ngưỢc với phương pháp thao tác gen cần phái có ADN cá khuôn mẫu lẫn vector tương đối tinh khiết Các yếu tố cho thấy PCR thay đổi đáng kế so với cac phương pháp cổ điển cho việc khuếch đại trình tự đặc biệt - Nhạy: Phản ứng PCR cực nhạy cần dùng phân tử ADN làm khuôn thu dược sán phẩm Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh ứng dụng rộng rãi kỹ thuật PCR đòi hỏi phái biết rõ trình tự ADN khn mẫu Đây điểm giới hạn kỹ thuật này, nghĩa phải dựa vào tảng kỹ th u ật công nghệ di truyền không thay kỹ thuật Do người ta không sử dụng kỹ th uật kỹ thuật tạo dòng gen thiết kế Trong vài trường hỢp phương phá]) PCR không áp dụng vối đoạn ADN kích thước lốn kb (thường kb tơ't nhất) Ngồi khả ngoại nhiễm phương pháp lớn 9.5.7 Các phư ơng pháp PCR cải tiến Phản ứng PCR cìược áp dụng rộng rãi có biến đổi phù hỢp với mục đích nghiên cứu riêng Vì gặp nhiều phương pháp khác nhví PRC tổ (Nested - PCR), ADN nhánh (Branch - ADN), PCR đa thành phần (multiplex - PCR), PCR ngược (Reverse - PCRj, RAPD - PCR tất dựa nguyên tắc phản ứng PCR 211 9.5.7.1 PCR "tổ” Để đạt độ nhạy cao PCR, người ta thực PCR liên tiếp Trên điện di đồ đoạn thu sau PCR thứ nhất, ngưòi ta quan sát thấy ngồi vệt có vệt nhỏ khác Điều mồi bắt cặp với vùng khác ADN đích lai hố khơng đặc hiệu PCR thứ thực với mồi giống PCR 1, khuếch đại sản phẩm thu từ PCR thứ PCR "tơ" có độ đặc hiệu cao sử dụng cặp mồi khác Cặp mồi ngoại: Cặp mồi tạo đoạn ADN khuếch đại giống với PCR cổ điển Chúng đặc hiệu cho trình tự m út ADN cần khuếch đại Các đoạn ADN thu đưỢc làm khuôn mẫu cho PCR thứ Cặp mồi nội: Cặp mồi bổ sung với vùng nằm bên chuỗi nucleotid thu vối cặp mồi thứ Thuật ngữ "PCR tổ" đoạn mồi tổ đóng hộp lần PCR đầu Kỹ thuật có độ nhạy độ chuyên biệt cao Người A D N đích 5’ 3’ ta dùng kỹ thuật để phát virus gây bệnh viêm gan 3’ 5’ c, loại virus có vật liệu di - Đ o n A O N thu đưỢc sau P CR t h ứ nhâ'l truyền AEN ARN virus đưỢc phát lai hoá trực tiếp, nên - Đ o n A D N thu đưỢc s au P C R t h ứ hai, phải thực phản ứng chuỗi khuếch đại vật liệu di truyền e -của virus PCR thứ chuyến tấ t AKN virus i|25 thành cADN, bước mã ngược nhờ enzym phiên mã ngược tạo cADN Ĩ ĩbằng kỹ th u ật PCR "tổ" Avidin Trong PCR thứ 2, mồi Hinh 9.7 PCR "tổ" phát HCV biotin hoá, mồi gắn với iod 125 Các đoạn thu gắn giá mang avidin (avidin chất có lực m ạnh đơi với biotin), ci người ta đo hoạt tính phóng xạ để kết luận mẫu dương tính hay âm tính (hình 9.7) 212 PCR "tổ" có độ nhạy cao PCR tiêu chuẩn lặp lại khuếch đại sản phẩm từ PCR thứ với PCR thứ Tuy nhiên vấn đề ngoại nhiễm vấn đê hạn chê 9.5.1.2 A D N " n h n h ” ADN đích khuếch đại PCR, sau cho lai với đoạn dò (là phần đặc hiệu ADN này) Tín hiệu lai hố đặc hiệu với đoạn dò theo cách thức ADN đích có gắn (chất huỳnh quang, chất quang hay chất màu), tín hiệu tạo nhò chất đánh dấu diện sau máy khuếch đại PCR "nhánh" có độ đặc hiệu cao Kỹ th u ật ADN "nhánh" đưỢc dùng để phát ADN virus gây bệnh viêm gan B Trong kỹ th u ật sử dụng đoạn dò Một đoạn dò thành phần trình tự cho phép lai hố lúc đoạn đích khác Hình 9.8 Kỹ thuật ADN "nhánh" sử dụng đoạn dò 9.5.7.3 P C R đ a th n h p h ầ n Trong kỹ th u ật này, hay nhiều ADN đích khuếch đại đồng thòi PCR đa thành phần sử dụng thường xuyên xét nghiệm chẩn đoán, sử dụng mồi khác nhau: thứ n h ất để xác định đồng PCR thứ hai nhắm vào trình tự ADN dư thừa PCR đa thành phần sử dụng phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng với đoạn dò cho mẫu xét nghiệm cho vài sinh vật khác ông PCR Khi tiên hành PCR đa th àn h phần cần phải xem xét sô" yếu tơ\trong thiết kê đoạn mồi Các mồi phải có nhiệt độ lai tương tự Sự khác biệt 10°c nhiệt độ lai mồi làm cho sản phẩm khuếch đại khác 213 h ay tạo k h u ếch đại k h ô n g th ê p h át h iện đưỢc sả n p h ẩm n y hay sá n pham khác Các đoạn mồi sử dụng đưỢc thiết kế cho sảníphẩm khác n h au đủ kích thước để m ỗi sả n phẩm có th ể đưỢc xác đ ịn h n h n g k h ôn g khác n h a u k h u ếc h đại m ột A D N đích đưỢc ưu tiê n so VỚI khuếch đại ADN đích khác PCR đa thành phần có ADN đích khác nhiều kích thước thường ưu tiên khuếch đại ADN đích ngắn trước ADN đích dài, kết có khác số lượng sản phẩm khuêch đại Tuy nhiên, khác đáng kể nhiệt độ lai hay chiều dài ADN đích khơng thể tránh khỏi Ngưòi ta có thê điều chỉnh quy trình thực để ỉàm cân ph ản ứ n g đạt sơ híỢng sả n phâm tư ơn g đương n h a u đ iều c h ỉn h n ồn g độ mồi cân với phản ứng đa thành phần 9.S.7.4 PCR A R N ARN retrovirưs ly trích dưỢc chuyển đổi thành cADN bỏi enzym mã ngưỢc e n zv m p h iên m ã ngưỢc, cA D N đưỢc d ù n g làm k h u ô n m ẫu cho PCR Tuy nhiên, phản ứng nhờ enzym phiên mã ngưỢc khó thực việc sử dụng enzym khơng chịu nhiệt 42”C bất lợi xảy lai khơng nghiêm ngặt Vì vậy, phiên mã ngưỢc hiệu trở ngại làm cho phát ARN đích nhạy đặc hiệu Người ta tìm ADN polymerase chịu nhiệt có hoạt tính enzym phiên mã ngược ADN polymerase tái tổ hỢp trích từ vi khuẩn chịu nhiệt Thcrmus thermophilus (Tth pol) ADN polymerase chịu nhiệt hoạt động hữu hiệu có diện ion Mn“ Hỗn hỢp phản ứng PCR ARN bao gồm: Tth pol, loại mồi oligonucleotide (một sử dụng cho tổng hỢp cADN, sử dụng cho PCR), ion mangan dạng MnCl.;, tất thành phần khác cần cho phiên mã ngược PCR Máy chu kỳ nhiệt đun nóng trưốc đên 70'’C, thành phần phiên mã ngược ủ 15 phút Sau phản ứng nhờ en zym p h iên m ã ngưỢc, h ỗn hỢp p h ản ứ ng đưỢc n â n g n h iệ t độ lên ‘’C đê làin biến tính phức hỢp ARN - ADN PCR sau đưỢc bát đầu với chu kỳ 95'’C 15 phút 60'’C 20 giây, 38 chu kỳ 90‘’C 15 giây 60"C khoảng 20 giây Sự phiên mã rigược thực 70"C độ đặo hiệu độ nhạy việc phát ARN đích cao 9.5.8 Các lĩn h vực ứ n g d ụ n g PCR Trong nghiên cứu khoa học, PCR giúp cho việc xác định trình tự nucleotid đoạn ADN đưỢc nhân lên; sử dụng PCR để tách dòng đoạn ADN đặc hiệu, nhiều trường hỢp tách dòng khơng cần đến PCR; giúp 214 ])hát đột biến, nghiên cuu mARN tạo đột biến gen, cho phép phân lích liên kết gen từ tế bào nêng lẻ; giúp nghiên cứu q trình tiên hố mức phân tử Thậm chí giúp phục hồi gen cổ vật tồn cách đáy hàng chục triệu năm Trong chọn giỏng vạt nuôi trồng, đặc biệt đôi với động vật thực vật bậc cao, vôn trưốc việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống rấ t khó khăn, cần nhiều năm, na}’ PCR cho phép thực vài ngày, chí vài giò VĨI hiệu r ấ t cao Trig y học, PCR chẩn đốn xác bệnh nhiễm trùng từ vimt đến VI khuẩn bệnh nấm, kể HIV - AIDS, chẩn đoán sớm theo dõi điều trị ung thư Trong tư vấn di truyền y học, PCR cho phép chẩn đốn nhanh, xác bệnh di truyền kể chẩn đoán trứớc sinh giới tính dị tật bẩm sinh có thê có từ thai mối đưỢc tuần tuổi điều quan trọng không cần chọc ô'i, cần lấy giọt máu ngoại vi mẹ để làm mẫu thí nghiệm Trong khoa học hinh sự, PCR khơng thể thiếu, giúp chẩn đốn nhanh, xác thủ phạm từ vết máu khơ, sỢi tóc sinh phẩm mà thủ phạm để lại trường Ngồi kỹ thuật cho phép xác định xác quan hệ huyết thống cha - con, ông - cháu v.v vài giò Trong bảo vệ mơi trưòng, việc xác định mức độ nhiễm sinh học thực hiệu nhanh chóng phản ứng PCR Những ứng dụng thực tiễn đa dạng phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật vô tận Nếu năm 1985 có cơng trình đưỢc cơng bố PCR năm sau kỹ thuật sử dụng hàng nghìn phòng thí nghiệm khắp giới Ngay nước ta, PCR dùng nhiều trường đại học, viện nghiên cứu ngày trở nên phổ biến Phản ứng chuỗi tổng hỢp ADN thật đưa lại cách mạng lĩnh vực ứng dụng thực tê sinh học phân tử Ngày nói lĩnh vực nghiên cứu sinh học sử dụng PCR Tóm tắ t Chiết tách tinh chế ADN đóng vai trò quan trọng nghiên cứu sinh học phân tử Các bước để chiết tách ADN phá vỡ tế bào, loại bỏ protein, tủa acid nucleic Tinh chế ADN áp dụng kỹ th u ật siêu ly tâm sắc ký Nồng độ ADN đo quang kê bưốc sóng 260 nm, kích thưốc tương đơi 215 ADN xác định kỹ thuật điện di gel đối chiếu với thang kích thước biết Các thao tác cắt, nối lai ADN thao tác kỹ thuật di truyền phân tử Trình tự ADN xác định phương pháp hoá học (Maxam Gilbert) phương pháp enzym (Sanger cộng sự) Phương pháp Sanger cải tiên đơn giản tự động hố Phương pháp PCR sử dụng enzym ADN polymerase máy luân nhiệt cho phép khuếch đại in vitro acid nucleic lên gấp tỉ lần sau 30 - 40 chu kỳ vài Kỹ thuật có nhiều ưu điểm đơn giản, nhanh nhạy nên ứng dụng rộng rãi nghiên cứu khoa học, chẩn đoán, khoa học hình chọn giống CÂU HỎI Cách k h ô n g dùng để tinh chế and? a) Sắc ký lực b) Sắc ký lọc gel c) Sắc ký trao đổi ion vi cột d) Sắc ký lỏng hiệu cao e) Sắc ký khí Tốc độ điện di k h n g phụ thuộc: a) Kích thước phân tử ADN b) Cấu dạng ADN c) Nồng độ ADN d) Nồng độ gel e) Điện thê sử dụng Enzym cắt giới hạn loại ứng dụng nhiều kỹ thuật tái tổ hỢp di truyền a) I c) III e) II III Yếu tô' ảnh hưỏng đến lai hoá: a) Nồng độ ADN c) Độ dài trình tự e) Tất 216 b) II d) I III b) Nhiệt độ thòi gian phản ứng d) Lực ion Đặc điểm k h ô n g thuộc phương pháp định trình tự Sanger: a) Xử lý hoá học chuyên biệt làm biến đổi đặc trưng loại nucleotid b) Sử dụng ADN polymerase c) Nucleotid đánh dấu d) Phản ứng tiến hành bơn phân đoạn e) Có sử dụng dideoxynucleotid Chất làm giảm nhiệt độ biến tính ADN PCR a) Pormamid b) MgCl2 c) DMSO d) EDTA e) a c Mồi phản ứng PCR a) Đoạn ADN ngắn, mạch đơn b) Có trình tự bổ sung với ADN khuôn điểm đầu chép c) Dài từ - 30 nưcleotid d) Là oligonucleotid e) Tất Tính nhiệt độ "chảy" đoạn mồi nhằm xác định nhiệt độ thích hỢp để a) Biến tính mồi b) Mồi gắn vào khn c) T ổn g hỢp từ k h u ô n gen d) Mồi không gắn bổ sung vào e) Mồi gắn vào đoạn khác Chọn chu kỳ nhiệt PCR dựa vào yếu tơ kích thước khuôn a) Độ tinh khiết khuôn b) Năng độ khn c) Kích thưốc mồi d) Trình tự mồi e) c d 10 PCRtổ: a) Dựa nguyên tắc phản ứng PCR b) Là hai PCR liên tiếp, sử dụng hai cặp mồi "ngoại" "nội" c) Có độ nhạy chuyên biệt cao PCR thưòng d) ứ n g dụng chẩn đoán e) Tất 217 ĐÁP ÁN Bài N hập m ôn sin h h ọ c ph ân tử l b e c e a b a d b e e 10 b e a 3, a d b e c d Bài Sao chép ADN d e b Bài Các loại ARN b 10 e Bài Sự p h iên m ã m ã di tru y ền e e e c õ e 10 a b c c e d 3, a a e e d d b e b a 10 b Bài S in h tổ n g hỢp p ro tein e d b 10 c Bài Đ iểu h oà h o t đ ộn g gen e e d Bài Bộ gen t ế b n h ân th ậ t b d e e e e e 8, e e 10 e c e e d d e e d c 10 a Bài Đ ột b iến gen Bài Các phư ơng ph áp p h ân tích ADN 218 e c b e a e e b e 10, e TÀI LIỆU THAM KHẢO Benjamin Lewin, Genes VIII Prentice -H alỉ, 2004 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Sinh học phản tử NXB Giáo Dục, 1997 Jam es Swarbrick, Pharmaceutical Gene Deỉivery Systems Marcel Dekker Inc New York, 2003 Lê Đình Lương Nguyên lý kỹ thuật di truyền NXB Khoa học Kỹ thuật, 2001 õ Phạm Thành Hổ Di truyền học NXB Giáo Dục, 1998 Richarcl A Harvey, Pamela c Champe Biochemistry 3"' ed Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, 2005 Richter, J D in Translational Control of Gene Expression (Ilershey, J w B , Mathews, M B , and Sonenberg, N., eds), Cold Spnng Harbor Laboratory Press, Cokl Spring Harbor, NY, 2000 Sambrook, J., Pritsch, E., Maniatis, T Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed., Vol 3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 Smith c A and Wood E J Molecular biology and Biotechnologv Chapman & Hall, 1991 10 Tom Strachan and Andrevv p Read Human Molecular Genetics Bios Scientific Publishers Ltd, 1996 219 Chịu trách nbiệnì xuât bản: C liủ tịch H Đ Q T kiêm Tổng G iám đốc N G Ồ T R Â N A I Phó Tổnj" Gicím đốc kiòm Tổng biên tập N G U Y Ê N Q U Ỷ T H A O ỈU i liiH h i i i i l l u i d \ íì í l i Ịi i U a c í ì n l i i i } ! n o i í l ii i iị ỉ C'hu ú c h I l ỉ ) Ụ ' r k i é m ( l i m d ó c c o n g ly C’l ' S c h Đ I 1)N IK ,\\\IIÁ lÃN Biòn tập Vcì su'd hcìiì úi: TRẦN NGỌC O A N H Trình bày bìa: BÙI Q U A N G T U Ấ N Chếbản: T H Á I SƠ N SINH HỌC PHÀN TỬ Mã số; 7K721y9-l)A l In 1.000 (QĐ ; 04), khổ 19 X 27 cm In Cồng ty c ổ phần In Phúc Yên Đia : Đường Trần Phu, th| xã Phúc Yèn, Vĩnh Phuc SỐ DKKH xuất : 04 2009/CXB/476 2117/GD, In xong nòp lưu chiểu tháng năm 2009 fĩ' t ^ -| V■ •; ỉ^ ■■,;,J^J > ĩố w ?y- 'ị -xÁ'^ -Ể:~ịỉM-ầ ỵ?ủM Ễ ^ í r ả ;, :, j| :, í* n > *s : „ ':r !ị : V ; ■■= r:^:‘ " ĩ :ạ =■■V» i í ,■ „" !t aU it ,’ s ? s? » 'W ''fc^•^\» ■ ’ ,i^ , .n ,\ £ ( ' í ■' n ... nhiên thiên chức sinh học gen hay sản phẩm gen phân tử (hình 1.1) Sinh học phân tử Hình 1.1 Quan hệ sinh học phân tử với khoa học sinh học khác 1.2.2 H ọc th u y ế t tru n g tâm Học thuyết trung... Zygote Hơp tử 22 Bàil NHẬP MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ MỤC TIÊU - Trinh hàỵ lịch sử phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử - Nêu mục tiêu đối tượng mơn học - Trình bày thành tựu đại sinh học phân tử đem...BỘ Y TÊ SINH HỌC PHÂN TỬ pÙ N G CHO ĐÀO TẠO DƯỢC s ĩ ĐẠI HỌC) M ã số: Đ 20.X 06 (Tái hấìì lăn thứ nhất) NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DUC Chỉ đao biên soan: VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ Chủ