cuối kỳ quang học kỹ thuật

SẮC KÝPhương pháp tách trong đó cấu tử ( thành phần hóa học ) được phân bố giữa 2 phaPha tĩnh : giữ cấu tử ( rắn, lỏng )Pha động : kéo cấu tử ra khỏi cột ( lỏng, khí )Sắc ký phẳng Tấm phẳng ( thường là thủy tinh ) tráng lớp pha tĩnhPha động ( thường là nước ) đựng trong khayNhúng tấm phẳng vào khay ( nơi xảy ra tác dụng của lực mao dẫn, nước dính vào tấm phẳng, trọng lực kéo pha tĩnh đi xuống). Cấu tử có tương tác với mao dẫn sẽ thắng trọng lực và đi lên, tương tác càng mạnh càng đi lên cao Sắc ký cột ( pha tĩnh được giữ trong cột và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hay trọng lực, detector có nhiệm vụ phát hiện cấu tử và được thể hiện trên sắc ký đồ, sắc ký đồ thể hiện các peak, peak tỷ lệ thuận với số lượng cấu tử ) Rửa giải : (bơm 1 lần hết )pha động được chế vào với lưu lượng nhất định. A,B,C là các cấu tử cần tách ,E là dung môi . Trên detector 3 peaks xuất hiện riêng biệt ( độ tinh khiết cao)Tiền lưu : nhỏ theo thời gian ( pha động được bơm liên tục ) => chỉ có A đầu tiên là tinh khiết, về sau không còn tinh khiết do các giọt bị trộn lẫn. Nhưng, tiền lưu có ưu điểm : nếu chỉ lấy độ tinh khiết của A thì sẽ nhanh hơn do đổ liên tục pha động định lượng và định tính đều dựa vào detector một số trường hợp không cần detector để định lượng, có thể dùng tR ( thời gian lưu : biểu thị time từ lúc mẫu đưa vào cột cho đến khi có sự nhận biết được chiều cao của peak lớn nhất trên sắc ký đồ ) tR thường không chính xác trong việc định tính do nhiều chất có tR gần giống nhau, thông thường để định tính, kết hợp với Mass spectrometer hay Infrared spectrometer Cơ chế tách •Hấp thụ•Rây ( phân tử ) : phân tử lớn ở lại, phân tử nhỏ rớt xuống •Trao đổi ion Trạng thái pha động : Sắc ký lỏng, sắc ký khíCác hình thành sắc đồ•Tiền lưu•Rửa giải•ĐẩyThiết bị hình thành sắc đồ : sắc ký cột, sắc ký phẳng tách chất màu trong lá có các pp sau : sắc ký cột , sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy Sắc ký lỏng ( Liquid Chromatography – LC ) : Có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kỳ phức tạp trong hóa học và trong khoa họcSắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC – high performance liquid chromatography) có thể dò tìm được lượng mẫu nhỏ đến 200 pg các loại sắc ký ( tùy thuộc cơ chế lưu) Sắc ký lỏng – rắn ( sắc ký hấp thụ ) : pha tĩnh là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích. Hệ số hóa lý là hệ số hấp thụSắc ký trao đổi ion : pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề mặt gắn những nhóm trao đổi ionSắc ký rây phân tử ( size exclusion chromatography ) : pha tĩnh là vật liệu có lỗ xốp. Các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lỗ sẽ được lưu giữ trong cột lâu hơn. (kích thước lỗ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách)Sắc ký lỏng – lỏng (hiệu suất không cao) : pha tĩnh lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp. Quá trình tách chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha tĩnh và động ( 2 pha đều lỏng). Hệ số đặc trưng của quá trình là hệ số phân bốSơ đồ cấu tạo máy HPLCBình chứa dung môi => máy bơm => cột tách và van tiêm mẫu ( chứa trong lò nhiệt)=> detector => computor cột tách (nhồi) đặt trong lò nhiệt => tạo nhiệt độ ổn định, nhiệt độ không ổn định thì tR và vận tốc đi xuống bị ảnh hưởng1. Bình chứa dung môiBình thủy tinh (trơn) có lỗ trên nắp gắn ống nhựa dẫn dung môi (pha động) từ bình đến bơmCần lọc tạp chất trong dung môi qua giấy lọc 0.45 µm trước khi dùng và nên có đầu lọc gắn vào đầu ống nhựa trong bình chứaCần loại bỏ hoặc đuổi các không khí hòa tan hoặc bọt khí trong dung môi để trách nhiễu đường nền. Loại bỏ bằng siêu âm hoặc sục khí trơ như heli2. Bơm cao áp : vận chuyển pha động (dung môi) đi qua cột tách với tốc độ nhất định. Các loại bơm thông dụng : •Bơm tốc độ dòng hằng định (constant flow pump) : bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, khi hết dung trong ống, bơm dừng lại•Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên3. Hệ thống tiêm mẫuTiêm mẫu bằng tay ( tiêm bằng ống tiêm syringe)Tiêm mẫu tự động Tiêm với liều lượng xác định, nếu mẫu là rắn thì kèm thêm dung môi4. Cột tách ( được nhồi pha tĩnh )Được làm bằng vật liệu thép không rỉ ( thép CrNiMo) với mặt trong cột được làm nhẵnKích thước phổ biến : đường kính ngoài 6.35 mm, đường kính trong 4.6mm và chiều dài nhiều cỡ đến 25cmCột được nhồi các hạt có đường kính cỡ 3, 4, 5, 10 mirco mét. Chất nhồi trong cột thường là silicagen, nhôm oxit, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion5. DetectorDetector UV – VIS (thiên về định lượng) : cho pha động từ cột được chảy qua một ống đo nhỏ có chùm bức xạ đơn sắc UVVIS chiếu qua. Đo phổ hấp thụ UVVISDetector huỳnh quang (tốt cho định tính) : dùng cho các hợp chất có vòng liên hợp như các hợp chất vòng thơm có nhiều nhân. Nhiều hợp chất không có phổ có thể chuyển sang các dẫn xuất có phổ nhờ xử lý thuốc thử hợp lý chất nhuộm phát quang, đo nồng độ chất nhuộm => nồng độ chất không phát quang (do tỉ lệ thuận với nhau)Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive index detector) (đo chiết suất không chính xác do chiết suất dễ bị ảnh hưởng bởi tạp chất) : detector thông dụng nhất do bất kỳ chất hòa tan nào đều dò tìm được miễn chỉ số khúc xạ khác với dòng chảy của pha động nguyên chấtDetector đo độ dẫn điện (Conductivity detector) : xác định ion vô cơ, hữu cơDetector khối phổ ( mass spectrometry) : xác định phần lớn các chất hữu cơ ( hóa hơi trước thích hợp sắc ký khí )6. Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu do phổ hiện thị hẹp nên dùng phân bố Gaussian để xem do nhiễu hay đó là phổ thật sựSắc ký khí ( Gas chromatography – GC)1. Sắc ký khí lỏng ( GLC) Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên trong chất mang của cột. Mẫu phải được hóa hơi và được khí mang đưa đi qua cột, làm tăng khả năng tách các hợp chất từ trong mẫu ban đầu.2. Sắc ký khí – rắn (GSC) ( ưu tiên do dễ xử lý ) Pha tĩnh ở dạng rắn xốp như than hoạt tính, silicagel, bột nhôm. Pha động là khí. Sắc ký loại này ảnh hưởng tới những cấu tử trong hỗn hợp có nhiệt độ sôi thấpCấu tạo hệ thống sắc ký khí ( cột nhồi và detector được đặt trong lò )1. Khí mang( pha động ) trơ về mặt hóa học như N2, H2, He, Ar, CO¬2,… Khí He và Ar thích hợp cho sắc ký nhiệt độ cao Khí N2 rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên được dùng nhiều việc chọn khí dựa vào loại detector được sử dụngHệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), thiết bị đo tốc độ dòng, hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác2. Bộ phận tiêm mẫu ( vào cột nhồi ) Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo thể tích bơm có thể thay đổi từ một vài đến 20 µl. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công (microsyringe) và tiêm mẫu tự động (autosamper)3. Cột phân tích (pha tĩnh)Cột thường được làm bằng thép không rỉ, niken, thủy tinh. Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh (Al2O3, SiO2, cacbon, polymer, zeolite…). đường kính cột nhỏ, uốn cong được Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản.Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 24 mm và chiều dài 23 m. Giá thành thấp, nạp mẫu đơn giản, hiệu quả thấp. Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0,20,5 µm), cột có đường kính trong 0,10,5 mm và chiều dài 30100 m. Hiệu quả cao, nhanh, thích hợp cho hỗn hợp phức tạp.4. Detector Detector dẫn nhiệt ( thermal conductivity detector – TCD) Sự khác nhau về tính dẫn nhiệt của các khí là do tính linh động, nghĩa là tốc độ khí khuếch tán tới và đi khỏi sợi đốt. Tốc độ của phân tử lại là hàm của trọng lượng phân tử, do đó phân tử càng nhỏ tốc độ chuyển động càng cao, dẫn nhiệt càng tốt Heli là khí mang thông dụng được sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt TCD. Bất kỳ chất phân tích nào trộn với dòng khí He cũng làm giảm độ dẫn nhiệt của nó, sợi dây tóc trở nên nóng hơn nên điện trở của nó tăng lên và thế áp vào sợi dây này thay đổi. R3 : chứa khí Heli + khí của chất phân tíchR4 : điện trở mẫu dùng để so sánh độ chính xác không cao về mặt định lượngb) Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ioniation Detetor FID): Dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa được tạo bởi hỗn hợp khí H2 và O2 trong không khí (nguồn ion hóa) và được đặt trong buồng điện cực. Khi khí mang đem theo các phân tử mẫu, các phân tử này bị bắn phá bởi các chùm hạt electron tạo thành các hạt tích điện tạo thành dòng điện giữa hai điện cực. Các tín hiệu được ghi lại dưới dạng các pic. Độ nhạy của detector FID cao hơn độ nhạy của detector TCD khoảng 100 1000 lần. Thích hợp nhất với hợp chất hữu cơ chứa cacbon. Một số hợp chất không thể phát hiện bằng detector này như: CO, CO2, axit formic, formaldehit, H2S, H2O … Columm : đầu ra cột nhồi Detector cộng kết điện tử (ECDElectron Capture Detector) Detector quang hóa ngọn lửa (FPDFlame Photometric Detector) Detector NPD (Nitrogen Phospho Detector) Detector khối phổ (MSMass Spectrometry): được sử dụng rộng rãi nhất nhưng đắt tiền.Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải, các detector khối phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt. Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở.5. Bộ ghi nhận tín hiệu : ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện và hiển thị lên màn hình các thông số liên quan, sắc ký đồ, các peak, …

SẮC KÝ Phương pháp tách cấu tử ( thành phần hóa học ) phân bố pha Pha tĩnh : giữ cấu tử ( rắn, lỏng ) Pha động : kéo cấu tử khỏi cột ( lỏng, khí ) Sắc ký phẳng Tấm phẳng ( thường thủy tinh ) tráng lớp pha tĩnh Pha động ( thường nước ) đựng khay Nhúng phẳng vào khay ( nơi xảy tác dụng lực mao dẫn, nước dính vào phẳng, trọng lực kéo pha tĩnh xuống) Cấu tử có tương tác với mao dẫn thắng trọng lực lên, tương tác mạnh lên cao Sắc ký cột ( pha tĩnh động cho chuyển trọng lực, detector có thể sắc ký peak, peak tỷ lệ thuận với giữ cột pha động qua cột áp suất hay nhiệm vụ phát cấu tử đồ, sắc ký đồ thể số lượng cấu tử ) Rửa giải : (bơm lần hết )pha động chế vào với lưu lượng định A,B,C cấu tử cần tách ,E dung môi Trên detector peaks xuất riêng biệt ( độ tinh khiết cao) Tiền lưu : nhỏ theo thời gian ( pha động bơm liên tục ) => có A tinh khiết, sau khơng tinh khiết giọt bị trộn lẫn Nhưng, tiền lưu có ưu điểm : lấy độ tinh khiết A nhanh đổ liên tục pha động * định lượng định tính dựa vào detector * số trường hợp không cần detector để định lượng, dùng t R ( thời gian lưu : biểu thị time từ lúc mẫu đưa vào cột có nhận biết chiều cao peak lớn sắc ký đồ ) * tR thường khơng xác việc định tính nhiều chất có t R gần giống nhau, thơng thường để định tính, kết hợp với Mass spectrometer hay Infrared spectrometer Cơ chế tách  Hấp thụ  Rây ( phân tử ) : phân tử lớn lại, phân tử nhỏ rớt xuống  Trao đổi ion Trạng thái pha động : Sắc ký lỏng, sắc ký khí Các hình thành sắc đồ  Tiền lưu  Rửa giải  Đẩy Thiết bị hình thành sắc đồ : sắc ký cột, sắc ký phẳng * tách chất màu có pp sau : sắc ký cột , sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy Sắc ký lỏng ( Liquid Chromatography – LC ) : Có khả phân tích hỗn hợp mẫu phức tạp hóa học khoa học Sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC – high performance liquid chromatography) dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200 pg * loại sắc ký ( tùy thuộc chế lưu) Sắc ký lỏng – rắn ( sắc ký hấp thụ ) : pha tĩnh chất rắn trơ chất cần phân tích Hệ số hóa lý hệ số hấp thụ Sắc ký trao đổi ion : pha động dung dịch đệm, pha tĩnh rắn có cấu tạo bề mặt gắn nhóm trao đổi ion Sắc ký rây phân tử ( size exclusion chromatography ) : pha tĩnh vật liệu có lỗ xốp Các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lỗ lưu giữ cột lâu (kích thước lỗ yếu tố đặc trưng cho trình tách) Sắc ký lỏng – lỏng (hiệu suất không cao) : pha tĩnh lỏng phủ lên vật liệu trơ hay xốp Quá trình tách chất dựa phân bố chất tan hai pha tĩnh động ( pha lỏng) Hệ số đặc trưng trình hệ số phân bố Sơ đồ cấu tạo máy HPLC Bình chứa dung môi => máy bơm => cột tách van tiêm mẫu ( chứa lò nhiệt)=> detector => computor * cột tách (nhồi) đặt lò nhiệt => tạo nhiệt độ ổn định, nhiệt độ khơng ổn định t R vận tốc xuống bị ảnh hưởng Bình chứa dung mơi Bình thủy tinh (trơn) có lỗ nắp gắn ống nhựa dẫn dung môi (pha động) từ bình đến bơm Cần lọc tạp chất dung mơi qua giấy lọc 0.45 µm trước dùng nên có đầu lọc gắn vào đầu ống nhựa bình chứa Cần loại bỏ đuổi khơng khí hòa tan bọt khí dung mơi để trách nhiễu đường Loại bỏ siêu âm sục khí trơ heli Bơm cao áp : vận chuyển pha động (dung môi) qua cột tách với tốc độ định Các loại bơm thông dụng :  Bơm tốc độ dòng định (constant flow pump) : bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, hết dung ống, bơm dừng lại  Bơm kiểu piston đẩy hút luân phiên Hệ thống tiêm mẫu Tiêm mẫu tay ( tiêm ống tiêm syringe) Tiêm mẫu tự động * Tiêm với liều lượng xác định, mẫu rắn kèm thêm dung môi Cột tách ( nhồi pha tĩnh ) Được làm vật liệu thép không rỉ ( thép Cr-Ni-Mo) với mặt cột làm nhẵn Kích thước phổ biến : đường kính ngồi 6.35 mm, đường kính 4.6mm chiều dài nhiều cỡ đến 25cm Cột nhồi hạt có đường kính cỡ 3, 4, 5, 10 mirco mét Chất nhồi cột thường silicagen, nhôm oxit, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion Detector Detector UV – VIS (thiên định lượng) : cho pha động từ cột chảy qua ống đo nhỏ có chùm xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua Đo phổ hấp thụ UV-VIS Detector huỳnh quang (tốt cho định tính) : dùng cho hợp chất có vòng liên hợp hợp chất vòng thơm có nhiều nhân Nhiều hợp chất khơng có phổ chuyển sang dẫn xuất có phổ nhờ xử lý thuốc thử hợp lý * chất nhuộm phát quang, đo nồng độ chất nhuộm => nồng độ chất không phát quang (do tỉ lệ thuận với nhau) Detector đo số khúc xạ (Refractive index detector) (đo chiết suất khơng xác chiết suất dễ bị ảnh hưởng tạp chất) : detector thông dụng chất hòa tan dò tìm miễn số khúc xạ khác với dòng chảy pha động nguyên chất Detector đo độ dẫn điện (Conductivity detector) : xác định ion vô cơ, hữu Detector khối phổ ( mass spectrometry) : xác định phần lớn chất hữu ( hóa trước thích hợp sắc ký khí ) Hệ thống ghi nhận xử lý tín hiệu * phổ thị hẹp nên dùng phân bố Gaussian để xem nhiễu phổ thật Sắc ký khí ( Gas chromatography – GC) Sắc ký khí - lỏng ( GLC) - Pha tĩnh lỏng phủ lên bề mặt rắn chất mang hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên chất mang cột - Mẫu phải hóa khí mang đưa qua cột, làm tăng khả tách hợp chất từ mẫu ban đầu Sắc ký khí – rắn (GSC) ( ưu tiên dễ xử lý ) - Pha tĩnh dạng rắn xốp than hoạt tính, silicagel, bột nhơm Pha động khí - Sắc ký loại ảnh hưởng tới cấu tử hỗn hợp có nhiệt độ sơi thấp Cấu tạo hệ thống sắc ký khí ( cột nhồi detector đặt lò ) Khí mang( pha động ) - trơ mặt hóa học N2, H2, He, Ar, CO2,… - Khí He Ar thích hợp cho sắc ký nhiệt độ cao - Khí N2 rẻ dễ dàng làm tinh khiết nên dùng nhiều - việc chọn khí dựa vào loại detector sử dụng Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm điều chỉnh áp suất (pressure regulators), thiết bị đo áp suất (gauges), thiết bị đo tốc độ dòng, hệ thống lọc phân tử để tách nước chất nhiễm bẩn khác Bộ phận tiêm mẫu ( vào cột nhồi ) - Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo thể tích bơm thay đổi từ vài đến 20 µl - Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công (microsyringe) tiêm mẫu tự động (autosamper) Cột phân tích (pha tĩnh) -Cột thường làm thép không rỉ, niken, thủy tinh - Cột nhồi chứa hạt chất mang rắn phủ lớp pha tĩnh lỏng thân hạt rắn pha tĩnh (Al2O3, SiO2, cacbon, polymer, zeolite…) * đường kính cột nhỏ, uốn cong - Có loại cột: cột nhồi cột mao quản Cột nhồi (packed column): pha tĩnh nhồi vào cột, cột có đường kính 2-4 mm chiều dài 2-3 m Giá thành thấp, nạp mẫu đơn giản, hiệu thấp Cột mao quản (capillary): pha tĩnh phủ mặt (bề dày 0,2-0,5 µm), cột có đường kính 0,1-0,5 mm chiều dài 30-100 m Hiệu cao, nhanh, thích hợp cho hỗn hợp phức tạp Detector Detector dẫn nhiệt ( thermal conductivity detector – TCD) - Sự khác tính dẫn nhiệt khí tính linh động, nghĩa tốc độ khí khuếch tán tới khỏi sợi đốt - Tốc độ phân tử lại hàm trọng lượng phân tử, phân tử nhỏ tốc độ chuyển động cao, dẫn nhiệt tốt - Heli khí mang thơng dụng sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt TCD Bất kỳ chất phân tích trộn với dòng khí He làm giảm độ dẫn nhiệt nó, sợi dây tóc trở nên nóng nên điện trở tăng lên áp vào sợi dây thay đổi R3 : chứa khí Heli + khí chất phân tích R4 : điện trở mẫu dùng để so sánh * độ xác khơng cao mặt định lượng b) Detector ion hóa lửa (Flame Ioniation Detetor - FID): - Dựa biến đổi độ dẫn điện lửa tạo hỗn hợp khí H2 O2 khơng khí (nguồn ion hóa) đặt buồng điện cực - Khi khí mang đem theo phân tử mẫu, phân tử bị bắn phá chùm hạt electron tạo thành hạt tích điện tạo thành dòng điện hai điện cực Các tín hiệu ghi lại dạng pic - Độ nhạy detector FID cao độ nhạy detector TCD khoảng 100 - 1000 lần - Thích hợp với hợp chất hữu chứa cacbon Một số hợp chất phát detector như: CO, CO2, axit formic, formaldehit, H2S, H2O … Columm : đầu cột nhồi Detector cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector) Detector quang hóa lửa (FPD-Flame Photometric Detector) Detector NPD (Nitrogen Phospho Detector) Detector khối phổ (MS-Mass Spectrometry): sử dụng rộng rãi đắt tiền Nếu cần biết thơng tin định tính để nhận diện chất rửa giải, detector khối phổ hồng ngoại chọn lựa tốt Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn nhiệt thường không đủ nhạy cho cột mao quản mở Bộ ghi nhận tín hiệu : ghi tín hiệu đầu dò phát hiển thị lên hình thơng số liên quan, sắc ký đồ, peak, … Ứng dụng : SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ĐỂ PHÂN TÍCH CHẤT TRONG THỰC PHẨM Cấu tạo máy Trong đó: 1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý liệu điều khiển hệ thống 8: In liệu Chuẩn bị máy Máy HPLC phải kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung mơi, tốc dòng, lượng đèn theo yêu cầu thông số máy nhà sản xuất đặt Đặc biệt, cột sắc ký phải kiểm tra số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay có nghi ngờ khả tách, rửa qui định sau lần chạy sắc ký Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: Rửa MeOH không rửa nước Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có loại muối phải rửa nước trước Trước mở máy phải kiểm tra bình chứa dung mơi pha động, mực dung dịch bình q cần thêm dung mơi Đồng thời kiểm tra bình nước thải, đầy phải đem đổ Chuẩn bị pha động Pha động HPLC đưa liên tục vào hệ thống Dung môi sử dụng cho pha động cần phải sạch, có độ tinh khiết định Trước gắn vào máy HPLC, dung môi phải khử bọt khí, lẫn bọt khí vào luồng dung môi vào máy làm cho máy bơm đầu dò hoạt động hiệu Có thể khử khí cách cho luồng khí helium xục mạnh vào bình với vận tốc 300ml/phút vài phút, bong bóng khí helium đuổi bọt khí khỏi bình Dung mơi bão hòa helium khơng ảnh hưởng đến q trình sắc kí Cũng khử khí cách đặt bình mở nắp vào bồn siêu âm cho máy hoạt động – 10 phút Dung môi đệm cần lọc thật kỹ (dưới lỗ lọc 0,45 µm) đuổi khí pha động; hạn chế dùng đệm, có dùng dùng đệm acetate tốt đệm phosphate Nếu sử dụng dung mơi nước cần phải cẩn thận mơi trường nước vi khuẩn sinh sản, cần thường xuyên thay nước (phòng tránh hạt gây hỏng máy hay tắc đầu cột), dùng sodium azid 0,04 làm chất diệt khuẩn nước Dung môi Merck có ưu điểm sau: sử dụng không cần phải lọc, không dùng chất ổn định dung mơi (vì chất ổn định thường tạo tạp), khơng chứa clo dung mơi (vì có clo tác dụng ánh sáng xảy phản ứng làm hỏng cột) Nếu sử dụng dung mơi có chất lượng thấp chạy máy xuất peak lạ làm nghẹt cột hỏng máy, pha động phải sử dụng dung mơi thật có độ tinh khiết cao Chuẩn bị mẫu Xử lí mẫu q tình hòa tan phân hủy, phá hủy cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ đối tượng cần phân tích, để giải phóng chuyển hóa chất cần xác định dạng đồng thể phù hợp cho phép đo chọn để xác định hàm lượng chất mà mong muốn Xử lí mẫu có hai q trình xảy đồng thời là: - Phá hủy cấu trúc ban đầu mẫu - Hòa tan giải phóng chất cần xác định Lý phải xử lý mẫu: Để đưa chất cần xác định trạng thái thích hợp cho phép đo, theo phương pháp phân tích chọn -Các kết phân tích phải phản ánh đại diện cho đối tượng cần nghiên cứu, theo dõi -Với phương pháp xác định, chất cần phân tích xác định xác tồn trạng thái định đồng phù hợp với kĩ thuật phân tích -Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, đa dạng, có thành phần đơn giản đến loại có thành phần phức tạp Chúng tồn dạng khác rắn cục, mảnh, hay lỏng, khí, huyền phù Khơng thể cho ngun mẫu vào máy để đo xác định Phải xử lí để đưa chất phân tích trạng thái phù hợp cho phưong pháp chon để xác định -Các chất cần xác định tồn trạng thái liên kết hóa học khác nhau, hợp chất vô cơ, hữu khác nhau, có bền vững, lượng chất vị trí mẫu khơng đồng đều, nên khơng thể xác định hàm lượng tổ hợp phức tạp, bền vững bị nguyên tố, chất liên kết khác cản trở, cần phải xử lí mẫu để phá vỡ hợp chất mà chất phân tích tồn tại, đưa chúng sang dạng phù hợp để định lượng tốt theo phương pháp chọn *1 số kĩ thuật xử lý mẫu: Kĩ thuật vơ hóa khơ (xử lí khơ) -Kĩ thuật vơ hóa ướt (xử lí ướt) -Kĩ thuật vơ hóa khơ – ướt kết hợp -Các kĩ thuật chiết (lỏng-lỏng, chiết rắn – lỏng, chiết rắn – khí, ) -Các kĩ thuật sắc kí, Quy trình xử lý: Dung mơi hòa tan hoạt chất phải hòa tan pha động, nhiều trường hợp dung mơi pha động dùng để hòa tan hoạt chất mẫu -Phải loại bỏ chất không tan pha động họăc không rửa giải cách chiết, lọc Phải lọc li tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45µm -Nồng độ mẫu mức vừa phải, không vượt khả tách cột Có thể gây ngẽn cột -Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống mẫu thử dung môi, riêng nồng độ thành phần giống mẫu thử tốt nhất, ngồi dùng nồng độ khác phải nằm khoảng tuyến tính khảo sát thành phần 5 Nguyên tắc hoạt động -Hệ thống dung mơi (1) đóng vai trò dung môi động trộn với theo tỉ lệ thích hợp (điều kiển máy tính) thay đổi thành phần hệ thống xử khí (2) -Pha động bơm liên tục qua cột tách hệ thống bơm cao áp (3) -Mẫu phân tích đưa vào cột tách phận tiêm mẫu (4), sau pha động đẩy vào cột tách (5), trình tách xảy -Các chất sau khỏi cột tách thời điểm khác vào detector (6) thích hợp chuyển thành hiệu điện khuếch đại chuyển đến phận tự ghi xử lí kết (7) *Cần lưu ý: -Đưa mẫu vào: bước phức tạp áp suất đầu vào cao -Thời gian lưu mẫu: Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến đỉnh (pic) hiển thị rõ nét Khoảng thời gian bị chi phối yếu tố: + Áp suất đầu vào + Tính chất pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt) + Thành phần dung môi + Nhiệt độ cột Qúa trình dịch kết quả: Kết thường gồm dãy pic, pic đại diện cho hợp chất hỗn hợp qua cột hấp phụ hấp thụ tia UV Ta điều khiển điều kiện cột hấp phụ thời gian lưu để xác định có mặt hợp chất Những tham số điều khiển đo trước với mẫu thử Tuy nhiên, từ peak ta định lượng hợp chất Giả sử có hợp chất X Chúng ta đưa dung dịch có lượng hợp chất X biết trước vào máy Từ đó, xác định thời gian lưu tương ứng khối lượng chất X hình ảnh peak Diện tích bên peak ứng với số lượng chất X qua máy dò diện tích tính nhờ máy tính nối với hình Kết hợp với máy ghi phổ khối: Một máy ghi phổ khối biến đổi peak thành vạch Từ so sánh với liệu có sẵn, biết có mặt nhiều hợp chất mà không cần quan tâm đến thời gian lưu chất qua cột hấp phụ PHÂN CỰC ÁNH SÁNG Sự phân cực (Polarization): tượng vector cường độ điện trường E dao động bị giới hạn phương dao động Ánh sáng không phân cực (ánh sáng tự nhiên): Vector E dao động theo phương * phương dao động không cố định độ dài vector không cố định ( E,B pha) Ánh sáng phân cực toàn phần (phân cực thẳng): vector E dao động theo phương xác định Ánh sáng phân cực phần: vector E dao động theo phương vng góc với tia sáng, có phương dao động mạnh, có phương dao động yếu (phân cực tròn, elip) * tròn : E, B lệch pha ¼ T or lệch ± pi/2 * elip : lệch tùy ý Nguyên nhân : phản xạ, tán xạm khúc xạ, truyền qua * phân cực phụ thuộc vào góc tới sóng ánh sáng Khi góc tới 900: sóng ánh sáng khơng bị phân cực Khi tổng góc tới góc khúc xạ 900: sóng phản xạ phân cực tồn phần, sóng khúc xạ phân cực phần Các trường hợp khác: hai sóng khúc xạ phản xạ phân cực phần Sóng khúc xạ khơng bị phân cực tồn phần Định luật MALUS ( tỷ lệ ánh sáng lọt qua) Khi ánh sáng truyền qua phân cực phân cực hoàn toàn, cường độ I ánh sáng truyền qua phân cực tỉ lệ thuận với bình phương góc trục truyền hai phân cực: I = I0cos2θ Ứng dụng Phương pháp dùng hệ thống phân cực ánh sáng chẩn đoán theo dõi bệnh tiểu đường Cơ sở lý thuyết - Kỹ thuật phân tích dựa phương pháp đo phân cực Stokes phương pháp phân tách ma trận Mueller sử dụng cho việc đo tính chất quang học ánh sáng huyết tương người - Hệ thống phân cực quang học thiết lập nhằm đo đạc phân tích thơng số quang học người có pha D-glucose huyết tương Tính chất phân cực ánh sáng tán xạ từ môi trường mờ đục Phương pháp đo + Phân tích để xác định đặc tính quang học mẫu sinh học : lưỡng chiết phẳng, lưỡng sắc phẳng, lưỡng chiết tròn, lưỡng sắc tròn, khử cực thẳng, khử cực tròn + Ánh sáng đầu vào cung cấp laser He – Ne kính phân cực kính ¼ bước sóng để tạo chùm sáng phân cực thẳng 100 450 900 1350 chùm tia sáng phân cực tròn ( phải trái ) + Cuối lọ cường độ trung lập để đảm bảo ánh sáng phân cực đầu vào có cường độ đồng + Thơng số đầu Stokes tính từ phép đo - Hiệu chỉnh máy gồm việc điều chỉnh trạng thái phân cực ánh sáng đầu vào góc quay ánh sáng Hiệu chỉnh đảm bảo hệ đo quang học đồng xác, hệ đo thẳng hàng => mối tương quan nồng độ đường nước, thể mờ đục góc quay quang học Kết Sự biến thiên góc quay quang học lưỡng chiết tròn với nồng độ D-glucose huyết tương người => tuyến tính xuất đại lượng PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TẾ BÀO DÒNG CHẢY (FLOW CYTOMETRY) Phân tích tế bào theo dòng chảy (FCM) sử dụng để đếm phân loại tế bào cách đưa tế bào vào dòng chất lỏng, sau cho qua thiết bị dò điện tử FCM cho phép đồng thời phân tích đa thơng số đặc tính hóa lý tế bào với tốc độ lên đến hàng ngàn tế bào giây Hệ thống tạo dòng chất lỏng * hệ thống dòng Dòng dịch bên ngồi (sheath fluid) - dòng bao, có tác dụng nắn chỉnh dòng dịch chứa mẫu bên Dòng dịch bên (core fluid) - dòng lõi, dòng hẹp tới mức tế bào mẫu qua khe hẹp theo hạt tạo thành dòng tế bào đơn với tốc độ cao lên đến hàng ngàn hạt giây Tiết diện dòng lõi điều chỉnh độ chênh lệch áp suất dòng để phù hợp với u cầu phân tích Dịch dùng dòng bao phải khơng làm tan tế bào, không ảnh hưởng độ chiết quang huỳnh quang hệ thống Một số dòng máy sử dụng ống vi mao thay cho dòng bao * Tạo dòng chảy ( ultrasonic transducer) Tạo sóng âm ( siêu âm( sóng học) ), áp suất dòng bao tỉ lệ thuận cường độ sóng siêu âm ( sóng siêu âm làm phân tử chuyển động gây va chạm sinh áp suất ) Hệ thống quang học + Nguồn sáng: thường đèn laser 488 nm, 635 nm + Kính lọc: loại kính lọc khác    Band pass optical filter Long pass optical filter Dichroic Long pass optical filter + Hệ thu tín hiệu quang học: Forward Scatter Chanel: thu nhận ánh sáng tán xạ thẳng  phản ánh kích thước tế bào, tế bào lớn số FSC lớn Side Scatter Chanel: thu nhận ánh sáng tán xạ góc bên  phản ánh độ phức tạp nhân bào tương tế bào: SSC quần thể tế bào lympho thấp nhất, bạch cầu hạt đa nhân cao Fluoressen Light: thu nhận ánh sáng huỳnh quang, tín hiệu huỳnh quang yếu cho qua ống nhân quang Photo Multiplier Tube giúp khuếch đại tín hiệu quang * signal FS : kích thước => hồng or bạch cầu SS : có hay khơng nhân, đa hay đơn bào FL : nhuộm màu trước => chế độ ánh sáng phát quang Hệ thống điện tử Các tín hiệu ánh sáng tán xạ huỳnh quang sau khuếch đại hệ thống điện tử chuyển thành tín hiệu số biểu diễn dạng biểu đồ, đồ thị khác Nguyên lý hoạt động - Khi tế bào hay vật thể qua nguồn sáng tương tác với laser tế bào/vật thể tạo ánh sáng tán xạ (tán xạ thẳng tán xạ bên) : + Ánh sáng tán xạ góc thẳng thu nhận qua kênh FSC (Forward Scatter Chanel) Do thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc thẳng phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích + Ánh sáng tán xạ góc bên thu nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel) Do thu nhận góc bên (90 độ) theo trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ phức tạp nhân bào tương tế bào + Nếu tế bào/vật thể nhuộm huỳnh quang, kích thích nguồn sáng, chất phát huỳnh quang, tín hiệu huỳnh quang (FL-Fluoressen Light) từ phức hợp kháng thể kháng nguyên bề mặt tế bào đích thu nhận theo kênh màu huỳnh quang khuếch đại ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube) - Sau tia sáng qua hệ thống kính lọc Với hệ thống kính lọc tia sáng tán xạ ánh sáng huỳnh quang phân chia đến hệ thống thu nhận tín hiệu cách xác - Các tín hiệu ánh sáng tán xạ tín hiệu huỳnh quang sau khuếch đại PMT hệ thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm biểu dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm máy tính thơng qua phần mềm chuyển đổi chun dụng theo máy CƠ CHẾ NHUỘM KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT - Trên bề mặt tế bào đích có kháng nguyên đặc trưng cho quần thể VD: tế bào T-CD4 có kháng nguyên đặc trưng CD3 CD4 - Sử dụng kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có khả gắn đặc hiệu với kháng nguyên bề mặt tế bào - Các tế bào có kháng nguyên bề mặt gắn đặc hiệu với kháng thể có gắn chất phát huỳnh quang qua chùm laser phát quang  nhận diện tế bào gián tiếp qua việc phân tích mật độ huỳnh quang ỨNG DỤNG CỦA FLOW CYTOMETRY  Xác định có mặt thụ thể bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lympho T-CD4, xác định dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầu lưới, định danh vi khuẩn…  Phân tách tế bào: thu nhận quần thể tế bào lai cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng, quần thể tế bào miễn dịch, thu nhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X Y…  Phân tích chu kỳ DNA/tế bào: xác định giai đoạn chu trình phân bào, khảo sát bất thường NST, tổn thưởng DNA, nghiên cứu tác dụng thuốc kháng ung thư tế bào đích Bài K16 : Thiết bị soi tia hồng ngoại Cấu tạo - Khối nguồn : khối hiển thị lưu trữ hình ảnh - Khối LED : chọn LED phù hợp với phương pháp + Phương pháp tán xạ LED bước sóng 850nm, cơng suất 1W, góc mở 120 0, dòng 500mA, áp 1.5 – 1.8V + Phương pháp truyền qua : LED tăng công suất 0.7W/ cụm, áp 12/6 pcs - Khối điều khiển : Tùy vào hình ảnh muốn nhận chọn mức điện trở tương ứng Led : mức 1-5 : 0.1Ω, 100Ω, 300Ω, 500Ω, 1000Ω - Khối camera : chọn camera có thuộc tính sau Kích thước : 17cm x 2cm x 1cm Cảm biến : CMOS Tiêu cự : auto focus 20 – 30 mm Độ phân giải : 2M pixels - Tùy vào phương pháp ta chọn thiết kế Nguyên lý - Tương tác ánh sáng IR Men : nước, độ khống cao => hấp thụ ánh sáng hồng ngoại => gần suốt Ngà : nhiều thành phần hữu nước nhiều men => hấp thụ ánh sáng hồng ngoại nhiều men => màu đục ảnh Khi bị tổn thương : + Mảng bám men đổi màu => chất khỏe => ảnh không tối màu + Khi bị khoáng => mật độ khoáng giảm, nước len vào => nước hấp thụ ánh sáng hồng ngoại => tạo thành vùng tối màu Phương pháp chẩn đoán + Phương pháp truyền qua : chụp mặt bên Tia hồng ngoại xuyên qua => phần bị hư tổn có nhiều nước hấp thụ IR => màu tối Chọn bước sóng 750 -850 nm ảnh hưởng tới tia IR + Phương pháp tán xạ : chụp mặt nhai Men khoáng, chiếu tia IR vào => nơi mật độ khoáng giảm => ánh sáng bị tán xạ nhiều lần => màu bị tối Chọn λ = 750 -850 nm + Phương pháp phản xạ : chụp mặt nhai Nước men hấp thụ mạnh => bước sóng 1400 – 1500 nm Đánh giá Ưu điểm : phát tổn thương rốn, độ phân giải cao phương pháp chụp Xquang để nhìn thấy tổn thương nhỏ, khơng có hại với sức khỏe, hạn chế người chụp, phân biệt vài tổn thương chung biểu mặt ngoài, độ xuyên sâu cao nên tia X- quang không chụp mặt nhai IR Hạn chế : Bộ phận linh kiện khó tìm kiếm phương pháp lâm sàng X- Quang thấy rõ tổn thương bên Vì phương pháp chưa áp dụng phổ biến => ngân hàng liệu => cần đào tạo nguồn nhân lực chẩn đốn hình ảnh ... Sắc ký lỏng, sắc ký khí Các hình thành sắc đồ  Tiền lưu  Rửa giải  Đẩy Thiết bị hình thành sắc đồ : sắc ký cột, sắc ký phẳng * tách chất màu có pp sau : sắc ký cột , sắc ký lớp mỏng, sắc ký. .. sáng Hiệu chỉnh đảm bảo hệ đo quang học đồng xác, hệ đo thẳng hàng => mối tương quan nồng độ đường nước, thể mờ đục góc quay quang học Kết Sự biến thiên góc quay quang học lưỡng chiết tròn với nồng... tốt theo phương pháp chọn *1 số kĩ thuật xử lý mẫu: Kĩ thuật vơ hóa khơ (xử lí khơ) -Kĩ thuật vơ hóa ướt (xử lí ướt) -Kĩ thuật vơ hóa khơ – ướt kết hợp -Các kĩ thuật chiết (lỏng-lỏng, chiết rắn