Chương TỔNG QUAN Tµi liƯu 1.1 Mét sè vÊn đề tình hình nhiễm HCV 1.1.1 Lịch sử phát virus viêm gan C Năm 1989 nhóm nghiên cứu M.Houghton, Q.L.Choo G.Kou hãng Chiron (California - Mỹ) kết hợp với phòng thí nghiệm viêm gan cđa D.W.Bradley ë CDC (Center for Diseases Control-Trung t©m kiểm soát bệnh tật) Mỹ dùng E.Coli nhân dòng gen virus đợc chứng minh tác nhân hay gặp viêm gan không A-không B sau truyền máu mắc phải cộng đồng phát loại RNA virus gọi virus viêm gan C [17,25] Đồng thời thời gian nghiên cứu M.Houghton lai tạo đợc dòng vô tính virus từ E.coli chủng C100-3 làm tiền đề cho sản xuất kít chẩn đoán kháng thể HCV [47] Tuy nhiên phải đến năm 1995 cấu trúc virus viêm gan C đợc quan sát mô tả đầy đủ dới kính hiển vi điện tử [13] HCV đợc xác nhận tác nhân quan trọng liên quan đến viêm gan không A-không B sau truyền máu nguyên nhân truyền nhiễm viêm gan không A kh«ng B Tuy kh«ng chÐp qua trung gian DNA không hoà nhập với gen tế bào ký chủ, HCV gây nhiễm virus mạn từ 50-85% trờng hợp nhiễm HCV, sau phát triển đến xơ gan ung th tế bào gan khoảng 20% bệnh nhân[62] 1.1.2 Tình hình nhiễm HCV theo phân bố địa lý 1.1.2.1 Trên giới Theo Tổ chøc Y tÕ thÕ giíi, hiƯn cã kho¶ng 210 triệu ngời(3% dân số) giới nhiễm HCV Tỷ lệ nhiễm HCV giới khác nhau, tuỳ theo tõng qc gia vµ phơ thc nhiỊu u tè nh ®iỊu kiƯn kinh tÕ, x· héi, y tÕ, chđng téc… - Viêm gan C vấn đề lớn sức khoẻ cộng đồng, có ba khu vực đợc phân chia dùa vµo anti-HCV + Vïng cã tû lƯ nhiễm thấp dới 0,5% nh nớc Đan Mạch, úc, Thuỵ Sỹ, Canada + Vùng nhiễm vừa với tỷ lệ tõ 0,5 – 1% + Vïng cã tû lƯ nhiƠm cao 1% nh Pháp 1,2%, 80% có dấu hiệu HCV nhân lên (HCV-RNA dơng tính) ngời mang HCV mạn tính 0,1%[22] Mỹ tỷ lệ nhiễm HCV 1,8%, ngời có nhiều bạn tình cao gấp 23 lần ngời cha có bạn tình (9% so với 0,4%) cao ngời nghiện chích ma tuý (13% so với 1%) [51] Các nớc vùng Đông nam Âu châu, Nhật Bản nhiều nớc phát triển khác có châu có tỷ lệ nhiễm cao nhÊt cã thĨ tíi 5% H×nh1.1 T×nh h×nh nhiƠm HCV ngời cho máu giới (ảnh CDC truy cập địa virology-online.com/viruses/Hcv.jpg) 1.1.2.2 Tại Việt Nam - nớc ta việc nghiên cứu dịch tễ học nhiễm HCV hạn chế Tû lƯ nhiƠm HCV cao thêng tËp chung ë ®èi tợng có nguy cao nh ngời mắc bệnh a chảy máu, ngời nghiện chích ma tuý, bệnh nhân lọc máu Những nghiên cứu Việt Nam cho thấy, theo Nguyễn Thu Vân, Hoàng Thuỷ Nguyên, Phạm Song, Đào Đình Đức tỷ lệ nhiễm HCV cộng đồng 0,4 1,35% - Tỷ lệ nhiễm HCV Hà Nội khoảng 4% nhân viên y tế phụ nữ mang thai Tỷ lệ cao nhiều ngời mắc bệnh a chảy máu 6%, đặc biệt rÊt cao ë nh÷ng ngêi nghiƯn chÝch ma t 31% ngời cho máu tỷ lệ thấp 0,8% [3,4] - Tại thành phố Hồ Chí Minh: Nhiễm HCV quần thể bình thờng 3,2 4,2%, tỷ lệ trội bệnh nhân a chảy máu 29%, đặc biệt ngời nghiện chích 87 96,9% tỷ lệ ngời cho máu cao Hà Nội 20,6% [3,8,14] Nghiên cứu Trần Thanh Dơng nhóm đối tợng Hà Nội năm 2004, tỷ lệ anti-HCV(+) nhóm ngời bình thờng 1,34%, nhóm nghiện chích ma tuý 70,17%, nhóm gái mại dâm 20,59%, bệnh nhân chạy TNT truyền máu nhiều lần 63,59%, bệnh nhân viêm gan virus 12,38%, cán y tế 3,57% Tại thành phố Hồ Chí Minh theo Trơng Thị Xuân Liên tỷ lệ anti-HCV(+) số đối tợng nh sau [9]: Bảng1.1 Tỷ lệ anti-HCV(+) số đối tợng thành phố Hồ Chí Minh Nhóm đối tợng Nhóm ngời bình thờng Gái mại dâm Bệnh nhân da Tỷ lệ % 2,53 Nhóm đối tợng Nhóm nghi viêm gan Xơ gan Ung th gan 9,9 6,9 liƠu BƯnh nh©n HIV d- 73,6 Ngêi cho máu ơng tính Nhóm chích 96,2 Nhân viên y tế ma tuý 1.2 Virus viªm gan C (HCV) Tû lệ % 19,3 47,6 23,2 14 3,28 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc HCV 1.2.1.1 Hình dạng cấu trúc cđa HCV - HCV thc hä Flaviviridae, gièng Hepacivirus, h×nh cầu có đờng kính khoảng 45 - 65nm có lớp bao Lipoprotein với mỏm nhô nhỏ (6nm) bao quanh mét nucleocapsid 3050nm cã cÊu tróc ®èi xøng 20 mặt nh thành viên khác họ Flaviviridae [32] - Cấu trúc HCV gồm thành phần [15,37] Lớp bao Virus Các glycoprotein virus Capsid virus RNA virus Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc cđa virus viªm gan C + Acid nucleic: HCV cã cấu trúc RNA mạch đơn, dơng, xoắn có khoảng 9.600 nucleotide, cã enzym chÐp ngỵc HƯ gen cđa HCV mã hoá cho trình tổng hợp Polyprotein tiền chất có khoảng 3010-3033aminoacid, sau Polyprotein đợc cắt thành Protein cấu trúc không cấu tróc [33] + Líp capside: Bao xung quanh acid nucleic đợc cấu tạo protein + Lớp bao ngoài: Cấu tạo glycoprotein lipid nên dễ bị bất hoạt ether chloroform 1.2.1.2 Cấu trúc phân tử HCV - RNA virus bao gåm mét khung ®äc më nhÊt (ORF) bao trïm cÊu tróc gen cđa HCV mã hoá cho chuỗi polypeptide lớn khoảng 3010 - 3033 aminoacid [37,45] gắn kết vào đầu vùng không dịch mã (UTR-Untranslated region) Genome virus chia làm vùng có hai đầu Hình 1.5 Cấu trúc gen HCV - Khởi đầu khung đọc mở vùng không phiên mã (HCV5UTR) gồm 341 nucleotide, vùng b¶o tån nhÊt cÊu tróc gen cđa HCV, cã đến 90% cấu trúc hoàn toàn tơng tự genotype HCV khác Vùng thờng đợc sử dụng chẩn đoán sinh học phân tử - Tiếp theo vùng mã hoá cho protein cấu trúc protein không cấu trúc: + Vùng cấu trúc (Structural region)gåm c¸c gen m· ho¸ cho c¸c protein capside (C- core) vµ vá (E1 vµ E2 - envelope) tham gia cấu tạo tính kháng nguyên phận virus n»m ë phÝa tËn N gåm c¸c gen C, E1, E2, P7: * Vïng C HCV: m· ho¸ cho protein cấu trúc (P19) tạo nên nucleocapsid thành phần capside bao xung quanh acid nucleic virus, vùng tơng đối ổn định * Vùng E1 HCV mã hoá cho glycoprotein lớp bao (envelope) gp33, gp72 glycoprotein có cấu trúc giống với glycoprotein số virus gây bệnh tiêu chảy bò * Vùng E2/NS1 HCV mã hoá cho glycoprotein lớp bao (envelope), thành phần glycosyl hoá cấu trúc protein HCV có vùng đột biÕn RNA rÊt cao khu tró ë hai gen vá E1 E2/NS1 gọi hai vùng siêu biến (Hypervariable region-HVR lµ HVR1, HVR2), ë vïng E1 lµ HVR1 vị trí aa 390 410 HVR2 vị trí aa 474 480 Những vùng hay biến đổi qua lần virus nhân lên, tạo khác biệt gen HCV bệnh nhân, tạo trạng thái nhiễm virus kéo dài 80% bệnh nhân, giúp cho HCV trốn tránh đợc đáp ứng miễn dịch ký chủ làm cho tình trạng nhiễm HCV thờng diễn biến sang mãn tính [12,40,45] * Vùng P7 đợc coi vùng đợc tách từ vùng E2, chức cha rõ, hiểu biết vùng P7 + Vùng không cấu trúc (None Structural region) n»m ë phÝa 3’ cđa vïng cÊu tróc cã gen mã hoá cho protein không cấu trúc mang tính chất enzym, định nhân lên virus gåm c¸c gen: NS2, NS3, NS4, NS5: * Vïng NS2, NS3, NS4, NS5 vùng mã hoá cho protein không cấu trúc đóng vai trò quan trọng nhân lên virus, gồm enzyme Protease, Helicase, RNA polymerase phụ thuộc RNA peptid tham gia vào trình chép virus cắt đoạn polyprotein [33] C100-3 kháng nguyên đợc gen không cÊu tróc NS4, NS5 m· ho¸ - Ci cïng vïng không phiên mã (HCV 3-UTR) có khoảng 27 66 nucleotide, có chức báo hiệu dừng trình phiên mã 1.2.2 Sự xâm nhập nhân lên HCV Thực đến chế nhân lên HCV cha đợc hiểu rõ, nhiên ngời ta cho HCV tuân theo chế nhân lên virus có cấu trúc RNA(+) khác, nghĩa sau xâm nhập vào tế bào gan nhờ chế ẩm bào cởi bỏ phần nucleocapsid bên ngoài, genom HCV hoạt động nh khuôn mẫu để chép phân tử RNA sợi âm, tiếp chuỗi RNA làm khuôn mẫu để tổng hợp nên genom RNA(+) HCV Cả hai giai đoạn đợc thực dới tác dụng men RNA polymerase HCV Quá trình chịu kiểm soát đầu không mã hoá vùng có vị trí gắn kết với ribosome (IPES) để giải mã Hình 1.7 Quá trình nhân lên HCV (1) HCV huyết (2) Virus gắn vào receptor bề mặt tế bào xâm nhập vào tế bào (3) Phá vỡ vỏ bọc giải phóng RNA vào bào tơng tế bào (4) Qua trình dịch mã ribosom, tổng hợp protein từ nguyên liệu tế bào protease cña virus (5) Sao m· RNA (7) Virus trëng thành (6) Hoàn chỉnh lắp ráp (8) Giải phóng virus khỏi tế bào vật chủ 1.2.3 Phân loại HCV - Trong nhiỊu nghiªn cøu ngêi ta thÊy r»ng cÊu tróc hệ gen HCV đa dạng gen, gen HCV lỏng lẻo tạo nên men replicase nhiỊu sai sãt v× NS5B RdRp (polymerase phơ thuộc RNA) chức đọc sửa tích tụ sai lầm RNA gen HCV chép, RNA polymerase khả sửa sai trình tổng hợp RNA thiếu enzyme exonuclease enzyme cần thiết cho trình tự sửa chữa trình tổng hợp RNA virus, mặt khác cấu trúc gen HCV có nhiều vùng siêu biến điển hình vùng siêu biến E1(HVR1) vùng siêu biến E2(HVR2) Cuối với áp lực chọn lọc miễn dịch, HCV dần biến đổi phần cấu trúc gen để né tránh đáp ứng miễn dịch vật chủ [40] Do gen HCV không dù nhiễm HCV lần [35] Dựa tính đa dạng hệ gen, chủng HCV đợc phân thành type hay genotype, type HCV đợc phân thành nhiều phân type(subtype) biến loài (phụ loài) - Genotype cđa virus cã kho¶ng tõ 68,1 – 91,8% trình tự nucleotide chung cho tất type Nếu khác biệt trình tự nucleotide dới 20% ngêi ta xÕp chóng cïng mét genotype vµ genotype khác khác biệt lớn 20% Việc xếp loại kiểu gen dựa so sánh vùng khác gen [53] Các tác giả khác phát triển đa hệ thống phân loại riêng mình, nhiên Hội nghị Quốc tế lần thứ HCV mối liên quan virus, thống đa hệ thống phân loại genotype subtype HCV dựa tơng đồng trật tự nucleotide ë nh÷ng nhãm gen chÝnh (5 ’UTR, C, E1, NS5), có genotype (1,2,3,4,5,6) 50 phân type (subtype) đợc xác định [55] nớc Đông Nam (có Việt Nam Thái Lan) xác định đợc genotype (7,8,9,10,11), nhng phân tÝch chi tiÕt h¬n hiƯn ngêi ta cho r»ng genotype 7,8,9,11 còng thuéc genotype 6, genotype 10 thuéc genotype [59] Mỗi kiểu gen có liên quan đến đặc điểm dịch tễ, độc lực, khả gây bệnh đáp ứng điều trị với IFN với hiệu khác Kiểm tra type gen HCV có ý nghĩa dịch tễ lâm sàng quan trọng: type có liên quan với tiến triển bệnh, với ung th gan Tuy nhiªn type gen cã thĨ chØ yếu tố quan trọng định tiến triển bệnh mà phải kể đến yếu tố khác nh số lợng HCV, biến loài (quasispecies) đáp ứng miễn dịch thể chủ - Phân type (kiĨu phơ-subtype): Khi cïng kiĨu gen nhng cã sù khác biệt 60 Tỉng sè NhËn xét: 3.3 Mô tả kiểu gen HCV bệnh nhân chạy TNT có HCV-RNA(+) 3.3.1 Kiểu gen HCV bệnh nhân chạy TNT có HCVRNA(+) Bảng 3.10: Tỷ lệ kiểu gen HCV bệnh nhân chạy TNT Kiểu gen virus viêm n (số lợng) gan C 39 Tû lÖ (%) 1a 1b 2a 6a … Céng NhËn xÐt: 3.3.2 Ph©n bè kiĨu gen cđa HCV theo nhóm tuổi Bảng 3.11: Phân bố kiểu gen HCV theo nhãm ti KiĨu gen 21-30 HCV 1a 1b 2a 6a … Céng NhËn xÐt: 31- 41- 40 50 51-60 >60 Cén g 3.3.3 Ph©n bè kiĨu gen cđa HCV theo giới Bảng 3.12: Phân bố kiểu gen HCV theo giíi KiĨu gen HCV Nam N÷ n (sè l- Tû lƯ ỵng) (%) n (sè lỵng) Céng Tû lƯ (%) 1a 1b 2a 6a … Céng NhËn xÐt: 3.3.4 Ph©n bè kiĨu gen cđa HCV víi tiỊn sư (trun máu, phẫu thuật, tiêm chích ) Bảng 3.13: Phân bố kiểu gen HCV liên quan đến tiền sử Kiểu gen HCV 1a 1b 2a Trun m¸u PhÉu tht 40 6a Cộng Tiêm chích Tình dục Cộng Nhận xét: 3.3.5 Ph©n bè kiĨu gen cđa HCV víi thêi gian chạy TNT Bảng 3.14: Phân bố kiểu gen HCV liên quan đến thời gian lọc máu Kiểu gen Chạy TNT Chạy TNT Chạy TNT HCV sau tháng từ 1-2năm >2năm Cộng 1a 1b 2a 6a Cộng Nhận xét: 3.4 Đối chiếu thay đổi số số xét nghiệm chức gan với kết xét nghiệm định lợng virus viêm gan C bệnh nhân chạy TNT có HCV-RNA(+) 3.4.1 Sự thay đổi số xét nghiệm nồng độ men ALT, AST với kết định lợng virus viêm gan C Bảng 3.15: Sự thay ®ỉi chØ sè xÐt nghiƯm nång ®é men ALT, AST với kết định lợng virus viêm gan C Kết định lợng Nồng độ ALT Nồng độ AST HCV-RNA (sè lỵng (U/l/370C) (U/l/370C) copy/ml) ( X 41 + (X + SE) SE) < 104/ml 104/ml– 106/ml >106/ml NhËn xÐt: 3.4.2 Sự thay đổi tỷ lệ Prothrombin với kết định lợng virus viêm gan C Bảng 3.16 Sự thay đổi tỷ lệ Prothrombin với kết định lợng virus viêm gan C Kết định lợng HCV-RNA (số copy/ml) b¶n Tû lƯ Prothrombin 60% n Tû lÖ % < 10 /ml 104/ml– 106/ml >106/ml Tỉng céng NhËn xÐt: Ch¬ng Dù kiến bàn luận, kết luận 4.1 Dự kiến bàn lụân: 42 % P - Bàn luận theo mục tiêu kết nghiên cứu 4.2 Dự kiến kết luận Tỷ lệ nhiễm HCV, liên quan thời gian chạy TNT với tỷ lệ nhiễm HCV bệnh nhân ch¹y TNT chu kú t¹i bƯnh viƯn B¹ch Mai Kiểu gen virus viêm gan C bệnh nhân chạy TNT chu kỳ Đối chiếu thay đổi kết xét nghiệm chức gan với kết xét nghiệm định lợng virus viêm gan C bệnh nhân chạy TNT Kế hoạch nghiên cứu Thời gian 43 ST T Nội dung Xây dựng đề cơng nghiên cứu Thống đề cơng, nội dung công việc phận liên quan Kết phải đạt Đề cơng chi 12/2007 tiết Hoàn chỉnh 1/2008 đề cơng chi tiết kế hoạch thực Hoàn thành mẫu Mẫu điều điều tra bệnh tra bệnh nhân nhân chạy TNT Thu thập mÉu MÉu hut hut thanh, b¶o cđa qu¶n theo thờng bệnh nhân quy chạy TNT Xác định anti-HCV Kết mẫu huyết phản ứng kỹ ELISA thuật ELISA Xét nghiệm AST, Kết ALT, Protein, xét nghiệm Albumin, Prothrombin xác định HCV-RNA kiểu gen HCV kỹ thuật PCR, định lợng HCV-RNA Phân tích kết Kết xử nghiên cứu, sử dụng lý số liệu phần mềm máy tính, thống kê toán học xử lý số liệu Viết báo cáo Luận văn Báo cáo kết nghiên cứu bắt đầu, kết thúc Nơi thực Bệnh viện Bạch Mai Bệnh viƯn B¹ch Mai 1/2008 BƯnh viƯn B¹ch Mai 1/20087/2008 BƯnh viƯn B¹ch Mai 1/20087/2008 1/20087/2008 Khoa Vi sinh BƯnh viƯn Bạch Mai Khoa vi sinh, khoa Sinh hoá, khoa Huyết häc bƯnh viƯn B¹ch Mai 7/20088/2008 BƯnh viƯn B¹ch Mai 8-9/2008 Bệnh viện Bạch Mai Báo cáo luận 10/2008 văn Dự trù kinh phí STT Nội dung Thành tiền 44 VËt t, vËt liƯu sư dơng nghiªn cứu 15.000.000đồng Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 50.000.000đồng Chi khác 5.000.000đồng 45 ... Thận nhân tạo, Khoa Hoá sinh, Khoa Huyết h c Bệnh viện Bạch Mai 2.4 Phơng pháp nghiên c u: - Nghiên c u c t ngang: x c định tỷ lệ nhiễm HCV bệnh nhân chạy TNT Bệnh viện Bạch Mai + X c định HCV-RNA... tợng nghiên c u - Bệnh nhân chạy TNT chu kỳ Khoa Thận nhân tạo bệnh viện Bạch Mai từ 2006 - 2008 - Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Bệnh nhân suy thận mạn đ c chạy TNT chu kỳ 3lần/tuần - Tiêu chuẩn... n c ta vi c nghiên c u dịch tễ h c nhiễm HCV hạn chế Tỷ lệ nhiễm HCV cao thờng tập chung đối tợng c nguy cao nh ngời m c bệnh a chảy máu, ngời nghiện chích ma tuý, bệnh nhân l c máu Những nghiên