Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc diclofenac của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI SINH KTNN HÀ NỘI TRƯỜNGKHOA ĐẠI HỌC SƯ– PHẠM KHOA SINH – KTNN NGÔ DIỆU LINH NGÔ DIỆU LINH NGHIÊN CỨU NĂNGHẤP HẤP THỤ NGHIÊN CỨUKHẢ KHẢ NĂNG THỤ THUỐC DICLOFENAC CỦACELLULOSE MÀNG THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG MƠI TRƯỜNG NƯỚC NƯỚC VO GẠOVO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật TS NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC HÀ NỘI - 2018 HÀ NỘI, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN NGÔ DIỆU LINH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học TS NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC HÀ NỘI, 2018 LỜI CẢM ƠN Trong thực tế khơng có thành cơng mà không gắn liền với hỗ trợ người khác Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp mình, bước đầu nhiều bỡ ngỡ nên em gặp khơng khó khăn Tuy nhiên giúp đỡ tận tình thầy hướng dẫn nên em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2; thầy, cô khoa Sinh-KTNN; thầy, cô Viện NCKH & ƯD Trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Bích Ngọc người theo sát hướng dẫn em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Do lần vào làm nghiên cứu khoa học, mặt kiến thức em nhiều hạn chế Do vậy, thiếu sót điều khơng thể tránh khỏi, em mong nhận góp ý q thầy bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Sinh viên Ngô Diệu Linh LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Thị Bích Ngọc Những số liệu kết khóa luận trung thực, khơng có trùng lặp chép đề tài khác Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, Ngày 18 tháng năm 2018 Sinh viên Ngô Diệu Linh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A xylinum: Acetobacter xylynum CVk: Bacterial cellulose CMN: Cao nấm men ĐHSP: Đại học sư phạm KTNN: Kỹ thuật nông nghiệp PBS: Phosphate buffered saline NCKH&ƯD: Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng Nxb: Nhà xuất mht: Khối lượng thuốc hấp thụ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu NỘI DUNG Chương Tổng quan tài liệu Tổng quan đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 1.1 Tổng quan CVK 1.1.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum 1.1.2 Đặc điểm A Xylinum 1.1.3 Môi trường nuôi cấy A xylinum 1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng CVK tạo A xylinum 1.1.5 Tính chất độc đáo màng CVK 1.1.6 Các phương pháp sản màng CVK từ A xylinum 1.1.7 Ứng dụng màng CVK 1.2 Tổng quan Diclofenac 10 1.2.1 Sơ lược thuốc Diclofenac 10 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 2.1 Tình hình nghiên cứu nước: 11 2.2 Tình hình nghiên cứu nước : 12 Chương Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu 13 Đối tượng nghiên cứu 13 2.Vật liệu nghiên cứu 14 2.2 Thiết bị dụng cụ 14 2.2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 2.2.2 Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 14 Nội dung nghiên cứu 15 Phương pháp nghiên cứu 15 4.2 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK 17 4.3 Đo bề dày màng CVK 17 4.4 Xây dựng đường chuẩn Diclofenac 17 4.5 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thu vào màng CVK 18 4.6 Phương pháp xử lý thống kê 19 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 19 Chương Kết thảo luận 19 3.1 Màng CVk nuôi cấy từ môi trường chuẩn 19 3.2 Phương trình đường chuẩn Diclofenac 23 3.3 Khối lượng Diclofenac hấp thu vào màng CVk 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc hóa học CVk Hình 2.1 Quy trình tinh chế màng CVK 16 Hình 3.1 Màng CVk dày 0,5cm 20 Hình 3.2 Màng CVk ni cấy mơi trường gạo 21 Hình 3.3 Màng CVk dày 1cm 21 Hình 3.4.Màng CVk tinh chế 22 Hình 3.5: Màng gạo tinh khiết 0,5cm, d= 1,5cm 23 Hình 3.6: Đường chuẩn diclofenac 24 Hình 3.7 Rút mẫu đo 25 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng CVK 15 Bảng 3.1 Bảng nồng độ Diclofenac giá trị OD278 nm (n = 3) 23 Bảng 3.2 : Bảng đo giá trị OD sau khoảng thời gian 26 Bảng 3.3: Lượng thuốc hấp thụ vào màng gạo sau 27 Bảng 3.4: Hiệu suất hấp thụ vào màng gạo 27 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Bacterial cellulose (viết tắt CVk) sản phẩm loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum Màng sinh học (CVk) có đặc tính cấu trúc giống với cellulose thực vật (gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β-1,4 glucozit), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật chỗ: cellulose vi khuẩn không chứa hợp chất cao phân tử ligin, hemicellulose, peptin sáp nến chúng có đặc tính vượt trội độ dẻo dai, bền [1] Trên giới, màng CVk ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm môi trường chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc nhiều ứng dụng khác [9] Trong lĩnh vực y học, màng CVk ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da thẩm mĩ [5, 9] Amin et al [8] báo cáo việc sử dụng màng CVk làm màng bọc cho paracetamol cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết cho thấy màng CVk có khả giữ thuốc giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu sử dụng thuốc Ở Việt Nam việc nghiên cứu ứng dụng màng CVk quan tâm gần đạt kết bước đầu Đề tài Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2006 [2] “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum” Theo kết nghiên cứu cho thấy màng CVk tạo nên từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, sản xuất quy mơ cơng nghiệp Về mặt tính chất, CVk có độ tinh lớn nhiều so với loại cellulose khác, phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài - Ngâm NaOH: Trong màng chứa lượng lớn vi khuẩn ngâm màng NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn giải phóng nội độc tố vi khuẩn - Ngâm HCl: Màng sau ngâm NaOH rửa nước ép màng Sau ngâm với HCl 3% khoảng 48 để trung hòa hết NaOH - Ngâm nước: Màng sau ngâm với HCl rửa nước ép màng Ngâm nước đến trung hòa hết acid thời gian khoảng 48 ta thu CVK tinh khiết 4.2 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK Mục đích: Nhằm đảm bảo màng CVK sau xử lý loại tạp chất gây độc hại, kiểm tra diện đường glucose màng CVK Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling pha để phát diện đường D - glucose, có xuất kết tủa nâu đỏ Tiến hành: - Dịch thử màng CVK loại sau xử lý hóa học - Mẫu đối chứng: nước cất dung dịch D - glucose - Cho vào ống nghiệm chứa mẫu thử ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling Đun lửa đèn cồn 10 - 15 phút - Quan sát kết tủa xuất ống nghiệm 4.3 Đo bề dày màng CVK Bề dày màng CVK xác định thước kẹp panme Ta đo nhiều vị trí khác Sau xác định bề dày cách tính tốn lần đo 4.4 Xây dựng đường chuẩn Diclofenac Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ thuốc Diclofenac 17 Chuẩn bị mẫu chuẩn với nồng độ 0.25g/ml Sử dụng dung môi dung dịch nước cất Đo UV bước sóng 278nm (bước sóng hấp thụ cực đại diclofenac) Ghi kết thu dựng đường chuẩn mẫu 4.5 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thu vào màng CVK - Cắt màng CVK có hình tròn, đường kính 0,5cm với độ dày (0,5 cm cm) tương đối + Mẫu 1: Màng CVK có độ dày 0,5 cm khơng sấy + Mẫu 2: Màng CVK có độ dày 0,5 cm ép loại bớt nước + Mẫu 3: Màng CVK có độ dày cm khơng sấy + Mẫu 4: Màng CVK có độ dày cm ép loại bớt nước - Cho mẫu màng CVK vào bình tam giác có chứa sẵn 100 ml dung dịch thuốc CM 25% Sau cho vào máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, sau 30 phút, giờ, 1.5 giờ, lấy mẫu đo quang phổ máy UV - 2450 để xác định lượng thuốc lại dung dịch thời điểm lấy mẫu Thực đo lần, lấy giá trị OD trung bình để tính tốn Lấy giá trị OD (y) trung bình thay vào phương trình đường chuẩn (1), nồng độ CM tương ứng Từ nồng độ CM tính khối lượng CM lại 100 ml dung dịch methanol pha với 25 mg thuốc CM Khối lượng CM hấp thụ vào màng xác định theo công thức: mht = mtr - ms (2) Trong đó: mht: khối lượng thuốc CM hấp thụ vào màng (mg) mtr: khối lượng thuốc CM ban đầu dung dịch (20 mg) ms: khối lượng thuốc CM lại 100 ml dung dịch HCl 0,1N pha với 20 mg thuốc CM (mg) 18 Hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng CVK tính theo cơng thức [17] EE (%) = Qt-Qd/ Qt*100% (3) Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng (%) 𝑄t: Là lượng thuốc lí thuyết (mg) 𝑄𝑑: Là lượng thuốc lại (mg) 4.6 Phương pháp xử lý thống kê Các số liệu phân tích xử lý thơng qua phần mềm Excel 2010 biểu diễn dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn [24] Kiểm định giả thiết giá trị trung bình hai mẫu cách sử dụng hàm: t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variences, t - Test: Two Sample Assuming Equal Variences với ý nghĩa α = 0,05 khác biệt coi ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 Địa điểm tiến hành nghiên cứu - Phòng thí nghiệm Sinh lý người động vật Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - Viện nghiên cứu khoa học ứng dụng-Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Màng CVk nuôi cấy từ môi trường chuẩn 19 Màng CVk nuối cấy môi trường chuẩn sau ngày thu màng có độ dày 0,5cm (hình 3.1) Sau 14 ngày thu màng có độ dày 1cm Tại thời gian khác ta thu màng có độ dày mỏng khác môi trường chứa chất dinh dưỡng vi khuẩn A xylinum tiếp tục phát triển tạo lớp màng dày Dưới số hình ảnh chụp lại trình làm thực nghiệm: Hình 3.1 Màng CVk dày 0,5cm 20 Hình 3.2 Màng CVk ni cấy mơi trường gạo Hình 3.3 Màng CVk dày 1cm Màng CVk nuôi cấy từ môi trường gạo sau tinh chế đáp ứng yêu cầu thể chất mềm mại, linh hoạt, dễ gấp mà không cần thêm vật liệu dẻo nào, độ bền kéo độ đàn hồi tốt, khơng bị khơ để ngồi khơng khí Hình ảnh màng CVk tinh chế trình bày hình 3.4 21 Hình 3.4.Màng CVk tinh chế Để dễ dàng việc nghiên cứu hấp thụ thuốc ta dùng khuôn đục màng thành màng nhỏ có đường kính 1,5cm hình 3.5 đây: 22 Hình 3.5: Màng gạo tinh khiết 0,5cm, d= 1,5cm 3.2 Phương trình đường chuẩn Diclofenac Kết trung bình quang diclofenac bước sóng 278nm trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Bảng nồng độ Diclofenac giá trị OD278 nm (n = 3) Nồng 10% 20% 40% 60% 80% 100% Lần 0,102 0,292 0,536 0,785 1,058 1,315 Lần 0,103 0,294 0,537 0,784 1,059 1,316 Lần 0,101 0,295 0,534 0,787 1,056 1,314 0,294 ± 0,536 ± 0,785 ± 1,058 ± 1,315 ± 0,002 0,001 0,002 0,001 0,001 độ OD 278nm Giá trị 0,102 ± trung 0,001 bình 23 Hình 3.6: Đường chuẩn diclofenac Trong : y giá trị OD tương ứng với nồng độ x X nồng độ %(g/ml) R2: Hệ số tương quan Đo mật độ quang nồng độ Diclofenac khác máy quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) phòng thí nghiệm Viện NCKH&ƯD trường ĐHSP Hà Nội 2, sau xử lí phần mềm Excel cho kết phương trình đường chuẩn Diclofenac là: y = 0,1932x + 0,1921 ( R2 = 0,9996) Sau đo nồng độ OD ban đầu ta cho màng vào tiến hành hấp thụ rút mẫu để tiến hành đo sau khoảng thời gian 0,5 giờ, giờ, 1,5 giờ, Ta sử dụng lọ thủy tinh nhỏ để rút mẫu hình 3.7 đây: 24 Hình 3.7 Rút mẫu đo 25 Giá trị OD sau lần rút mẫu đo được trình bày bảng 3.2 đây: Bảng 3.2 : Bảng đo giá trị OD sau khoảng thời gian Độ dày Đặc điểm màng màng 0.5cm 0.5cm 1cm 1cm Thời gian hấp thụ 0,5 giờ 1,5 giờ Màng giữ 1,103 ± 1,004 ± 0,918 ± 0,507 nguyên 0,0022 0,0017 0,0012 ±0,0015 Màng ép 1,096 ± 0,981 ± 0,088 ± 0,499 ± loại nước 0,0028 0,0025 0,0026 0,0027 Màng giữ 1,085 ±0, 0,528 ± 0,927 ± 0,596 ± nguyên 0016 0,0025 0,0027 0,0026 Màng ép 1,051 ± 0,486 ± 0,895 ± 0,584 ± loại nước 0,0015 0,0017 0,0028 0,0029 50% 50% 26 3.3 Khối lượng Diclofenac hấp thu vào màng CVk Từ kết đo mà ta thu được, nhận thấy kết đo sau tối ưu nhất, từ ta tiến hành tính khối lượng thuốc hấp thụ vào màng sau Bảng 3.3 cho thấy khối lượng diclofenac hấp thụ vào màng sau Bảng 3.3: Lượng thuốc hấp thụ vào màng gạo sau mht Màng giữ nguyên 0,5cm 22,21 ± 0,0018 Màng ép loại nước 50% cm 0,5cm 1cm 21,85 ± 0,0017 22,24 ± 0,0019 21,9 ± 0,0022 Bảng 3.3 cho thấy màng ép loại nước 50% loại 0,5cm hấp thụ 22,24±0,0019 nhiều nhất, sau đến màng 0,5cm giữ nguyên hấp thụ 22,21 ± 0,0018 Tiếp theo đền màng ép loại nước 50% 1cm hấp thụ 21,9 ± 0,0022 cuối màng giữ nguyên loại 1cm hấp thụ cụ thể 21,85 ± 0,0017 Màng ép 0,5cm hấp thụ nhiều màng giữ nguyên 0.05mg Màng ép 1cm hấp thụ nhiều màng giữ nguyên 1cm 0,05mg Tiếp theo ta tính hiệu suất hấp thụ thuốc loại màng trình bày bảng Bảng 3.4: Hiệu suất hấp thụ vào màng gạo EE% Màng giữ nguyên Màng ép loại nước 50% 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm 88,84 ± 0,0032 87,40 ± 0,0046 88,96 ± 0,0081 87,6 ± 0,0022 - 27 Màng ép loại nước 50% loại 0,5cm có hiệu suất hấp thụ cao 88,96% sau đến màng giữ nguyên loại 0,5cm Màng ép loại nước 50% có hiệu suất hấp thụ cao màng 0,5 giữ nguyên 0,12% Màng ép loại nước 1cm có hiệu suất hấp thụ cao màng loại 1cm giữ nguyên Màng ép loại nước 1cm có hiệu suất hấp thụ cao màng 1cm giữ nguyên 0,2%.Từ kết ta có nhận xét sau: - Hiệu suất hấp thụ tỉ lệ thuận với khối lượng hấp thụ thuốc - Xét loại màng, có độ dày khác nhau, hấp thụ thuốc thời gian màng có độ dày 0,5cm hấp thu thuốc Diclofenac cao so với màng có độ dày 1cm màng dày đường thuốc vào màng dài khoảng thời gian hấp thu 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Khả hấp thụ thuốc diclofenac màng CVK lên men từ môi trường gạo Màng mỏng khả hấp thụ thuốc cao Màng ép loại bớt nước hấp thụ nhiều thuốc màng chưa ép Cụ thể: màng 0,5cm ép nước 50% hấp thụ nhiều thuốc sau đến màng 0,5cm giữ nguyên Tiếp theo đến màng 1cm ép loại nước 50% cuối màng 1cm giữ nguyên - Định hướng sử dụng thuốc mơi trường thích hợp để tăng hiệu điều trị thuốc 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Hà Nguyên Phương Anh, Trần Hậu Khang, Nguyễn Duy Hưng (2014), “Đánh giá hiệu Cimetidin phòng tái phát bệnh sùi mào gà Bệnh viện Da liễu Trung ương”, Tạp chí Da liễu học Việt Nam, số 16(7/2014), trang - 10 [2].Đặng Thị Hồng “ Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạp màng sinh học (CVK)”.Luận án thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội, 2007 [3] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”, Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18-20 [4] Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lí học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội [5] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (1996), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial Cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí khoa học công nghệ, 50 (4), trang 453 - 462 [6] Đinh Thị Kim Nhung (1996), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men axetic theo phương pháp chìm” Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học [7] Thuốc kháng thụ thể histamin H2 (2012) - Bộ y tế viện kiểm Tài liệu tiếng anh Walker, SR (2012) Xu hướng thay đổi nghiên cứu phát triển thuốc Springer Khoa học & Kinh doanh Truyền thông p 109 30 Ondetti, M ; Rubin, B; Cushman, D (1977) "Thiết kế chất ức chế đặc hiệu enzym chuyển đổi angiotensin: Loại thuốc chống cao huyết áp hoạt động đường uống" Khoa học 196 (4288) Nam, Doo H; Lee, Choon S; Ryu, Dewey DY (1984) "Tổng hợp cải tiến captopril" Tạp chí Khoa học Dược 73 (12) 31 ... phẩm màng CVK từ chủng Acetobacter xylium - Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc diclofenac màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo Phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: khả hấp thụ. .. khả hấp thụ thuốc diclofenac màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo - Vật liệu nghiên cứu: Màng CVK làm từ môi trường nước vo gạo - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực quy... sinh học CVK vi c điều trị bệnh Đó lý chọn đề tài: Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc diclofenac màng cellulose vi khuẩn lên men từ mơi trường nước vo gạo Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình