Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU SO SÁNH KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC CAPTOPRIL CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MỘT SỐ MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Nguời hướng dẫn ThS HÀ THỊ MINH TÂM HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Hà Thị Minh Tâm, thầy Nguyễn Xuân Thành thầy cô Viện nghiên cứu khoa học ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình dạy, giúp đỡ em để em hồn thiện thành cơng khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô giáo giảng dạy em suốt năm qua, trang bị cho em kiến thức bổ ích giúp em tự tin bước sống Mặc dù cố gắng để hoàn thiện đề tài cách hồn chỉnh Do nhiều thiếu sót kiến thức kinh nghiệm lần em tiến hành làm nghiên cứu khoa học nên tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đóng góp q thầy bạn để khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Anh LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đề tài nghiên cứu em suốt thời gian qua, kết số liệu khóa luận em thực “Viện nghiên cứu khoa học ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2” Những số liệu đạt không chép hay trùng lặp với tài liệu chưa cơng bố phương tiện truyền thơng Nếu có sai sót, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Anh BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên Tiếng Việt A xylinum Axetobacter xylinum CVK Cellulose vi khuẩn MT1 Môi trường MT2 Môi trường MT3 Môi trường TS Tiến sĩ ThS Thạc sĩ OD Mật độ quang phổ PC Cenllulose thực vật Nxb Nhà xuất DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ Hình 1: Cấu trúc hóa học CVK Hình : Sơ đồ qui trình ni cấy thu nhận CVK 20 Hình 3: Màng sau hấp 21 Hình 4: Màng xả vòi nước để làm 21 Hình 5: Đồ thị đường chuẩn Captopril OD 200nm 23 Hình 6: Hình ảnh màng CVK lên men từ mơi trường nước cất lần 27 Hình 7: Hình ảnh màng CVK lên men từ mơi trường nước vo gạo 27 Hình 8: Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già 27 Hình 9: Màng CVK với thời gian ni cấy khác nhauError! Bookmark not defined Hình 10: Màng CVK sau tinh chế 30 Hình11: Thí nghiệm kiể tra độ tinh khiết màng 30 Hình12: Biểu đồ so sánh khối lượng Captopril hấp thụ vào màng CVK 32 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng nước vo gạo Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng nước dừa già Bảng 3: Ứng dụng màng CVK 10 Bảng 4: Thành phần môi trường lên men tạo màng CVK 18 Bảng 5: Bảng nồng độ Captopril giá trị OD 200nm (n=3) 23 Bảng 6: Kết thu màng VCK độ dày khác 28 Bảng 7: Giá trị OD hấp thụ thuốc Captopril màng CVK (n = 3) 31 Bảng 8: Kết lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK (Kích thước d=1,5cm) (n=3) 32 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan đối tương, lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1.Vị trí phân loại A.Xylinum 1.1.2.Đặc điểm vi khuẩn A.Xylinum 1.1.3.Đặc điểm cấu trúc 1.1.4 Tính chất độc đáo màng CVK 1.1.5.Chức sinh lý CVK 1.1.6.Môi trường nuôi cấy 1.1.7.Phương pháp sản xuất màng CVK 1.1.8.Ứng dụng màng CVK 10 1.2 Giới thiệu thuốc Captoril 11 1.2.1 Công thức 11 2.2 Nguồn gốc tính chất 11 1.2.3.Cơ chế tác dụng 11 1.2.4.Công dụng thuốc 12 1.2.5.Tác dụng không mong muốn thuốc 13 1.3.Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 14 1.31.Trên giới 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1.Vật liệu nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp tạo màng xử lí màng CVK 18 2.3.2.Phương pháp lên men thu màng CVK từ số môi trường 19 2.3.4.Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK 21 2.3.5.Phương pháp xác định hàm lượng Captopril 22 2.3.6.Tạo màng CVK nạp Captopril 24 2.3.7.Phương pháp xác định lượng Captopril nạp vào màng CVK 24 CHƯƠNG : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Tạo màng CVK A xylinum từ môi trường khác 26 3.2.Độ dày màng CVK điều kện nuôi cấy 27 3.3.Tinh chế màng CVK 29 3.4 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK 30 3.5.Khả hấp thụ thuốc Captopril màng CVK 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Gần việc sử dụng vật liệu sinh học sản phẩm chăm sóc sức khỏe có ý đặc biệt nhờ khả tái tạo tính chất hóa học chúng.Trong có cellulose, vật liệu có nhiều ưu điểm vượt trội so với polyme tự nhiên tổng hợp khác Hiện nay, A xylinum Cellulose vi khuẩn (CVK) đối tượng nghiên cứu ứng dụng nhà khoa học nước nước Nhiều kết nghiên cứu cho thấy màng CVK tạo nên từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, sản xuất hàng loạt với quy mô công nghiệp Cellulose vi khuẩn (CVK) sản phẩm loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum Màng sinh học (CVK) có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật (gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β-1,4 glucozit) Chúng có đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề Màng CVK coi nguồn polymer mới, nguồn nguyên liệu [4,5,12] Trên giới màng cellulose vi khuẩn ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng làm màng lọc cho q trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho pin lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt sản xuất sợi truyền quang, làm môi trường chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm Đặc biệt lĩnh vực y học, màng CVK ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho người Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK chưa phát triển, bước đầu nghiên cứu Công dụng lớn từ việc sử dụng màng CVK nạp thuốc chữa lành vết thương, bảo vệ, hấp thu dịch tiết việc giải phóng loại thuốc trị liệu có liên quan Captopril chất ức chế ACE ACE enzym chuyển đổi angiotensin Captopril sử dụng để điều trị huyết áp cao Giảm tăng huyết áp giúp ngăn ngừa đột quỵ, đau tim vấn đề thận Nó sử dụng để điều trị suy tim, bảo vệ thận khỏi bị tổn hại bệnh tiểu đường, điều trị tình trạng nguy kịch sau đau tim [7, 14] Captopril chất ức chế men chuyển hoạt động cách làm giãn mạch máu để máu lưu thơng dễ dàng Captopril có khả chống lại nhiều bệnh hiệu điều trị số hạn chế Captopril có thời gian bán thải ngắn (1-3h), dễ bị oxy hoá làm giảm tác dụng thuốc Vì gây ảnh hưởng lớn đến hiệu thuốc đặc tính an toàn captopril bệnh nhân Những tác dụng phụ gặp như: Hạ huyết áp (Thường gặp liều đầu tiên), ho, suy thận cấp, dị ứng, phù mạch thần kinh nước ngồi mao mạch, thay đổi vị giác, viêm tuỵ, viêm lưỡi, thiếu máu, bệnh vàng da,… Vì vậy, để cải thiện hạn chế captopril cần thay đổi hạn chế Với mục đích tạo màng CVK dựa lồi vi khuẩn thuộc chủng A xylium, từ chế tạo màng sinh học để khảo sát hấp thụ thuốc qua màng nhằm kéo dài thời gian hấp thụ , hạn chế tác dụng phụ, khắc phục tính tan nước khả dụng sinh học CVK việc điều trị bệnh Đó lý chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả hấp thụ thuốc captopril màng cellulose vi khuẩn lên men từ số mơi trường” Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình chế tạo màng cellulose từ chủng Acetobacter xylinum từ số môi trường: môi trường chuẩn, môi trường nước dừa già, môi trường nước vo gạo - Nghiên cứu so sánh khả hấp thụ thuốc Captopril từ màng CVK Bảng 5: Bảng nồng độ Captopril giá trị OD 200nm (n=3) Nồng độ C% Lần Lần Lần Trung bình 0,1 0,113 0,1129 0,1131 0,113±0,01 0,2 0,229 0,231 0,228 0,22±0,0013 0,4 0,457 0,457 0,456 0,457±0,0028 0,6 0,668 0,667 0,669 0,668±0,0028 0,8 0,887 0,888 0,887 0,887±0,0033 1,081 1,080 1,082 1,081±0,0012 (mg/ml) Hình 5: Đồ thị đường chuẩn Captopril OD 200nm Phương trình đường chuẩn: 23 y=1,073x + 0,0149 Trong đó: (R2 =0,9993) x: nồng độ Captopril (mg/ml) y: giá trị OD tương ứng R2 : hệ số tương quan bình phương 2.3.6.Tạo màng CVK nạp Captopril Mục đích: Chế tạo màng CVK nạp Captopril đáp ứng yêu cầu thể chất mềm, mịn, dẻo, độ bền độ đàn hồi cao, có khả điều trị tốt Cách tiến hành: [22] Màng CVK có ướt loại bỏ 30% lượng nước cách sấy nhiệt độ 600oC 3h Cho màng CVK ngâm 25ml dung dịch chứa Captopril nhiệt độ 80oC giờ, cho phép giải pháp hấp thụ đầy đủ Sau lấy cho vào bao nilon, hấp tiệt trùng 1200oC 20 phút, hàn bao bì 2.3.7.Phương pháp xác định lượng Captopril nạp vào màng CVK Lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK tiến hành thử nghiệm mẫu Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0,5cm Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 1cm Cho mẫu màng sấy khơ vào bình tam giác có chứa sẵn 100ml dung dịch Captopril Sau cho vào máy rung siêu âm để nhiệt độ 80⁰C, sau 30 phút, 1giờ, lấy mẫu đo quang phổ để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng đến giá trị OD không đổi, lặp lại thí nghiệm lần lấy giá trị trung bình để tính tốn Lấy giá trị OD thu thay vào phương trình đường chuẩn ta nồng độ Captopril (C%) dung dịch, từ tính khối lượng Captopril có dung dịch theo cơng thức số [17]: 26 C% (w/v) = [mct(mg)/Vdd(ml)] x 100% (1) Trong đó: C% : nồng độ phần trăm khối lượng - thể tích số mg : 24 chất tan có 100ml dung dịch mct : khối lượng chất tan (mg) Vdd : thể tích dung dịch (ml) Sau tính lượng thuốc Captopril có dung dịch ta tính khối lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK theo công thức 2: mHT = m1 - m2 (2) Trong đó: mHT khối lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK (mg) m1 khối lượng thuốc Captopril ban đầu (mg) m2 khối lượng thuốc Captopril dung dịch sau hấp thụ (mg) Tỉ lệ thuốc hấp thụ vào màng CVK tính theo cơng thức số 3: EE (%) = (Qt − Qd) / Qt x 100% (3) Trong đó: EE: phần trăm thuốc hấp thụ vào màng Qt : lượng thuốc lý thuyết Qd : lượng thuốc lại 2.3.8 Phương pháp xử lý thống kê Phân tích thống kê khác biệt tính chất xác định nhóm thực qua việc sử dụng Excel với phân tích chiều phương sai việc xác định khoảng tin cậy Các kết nghiên cứu trình bày dạng “số trung bình ± SD” Những khác biệt coi có ý nghĩa thống kê giá trị p nhỏ 0,05 Mỗi công thức lặp lại lần Xác định độ dày mỏng, kích thước màng, lượng thuốc hấp thụ vào 2.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 25 CHƯƠNG : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo màng CVK A xylinum từ môi trường khác Khi nuôi cấy tĩnh bình điều kiện nhiệt độ phòng, vi khuẩn A xylinum sử dụng chất dinh dưỡng môi trường để sinh trưởng phát triển Trong ngày đầu tiên, vi khuẩn làm quen với môi trường, acid bắt đầu sinh làm pH môi trường giảm nhẹ Ngày thứ 2, vi khuẩn bắt đầu sản sinh lớp màng CVK bề mặt môi trường có màu trắng đục có lẫn nhiều tạp chất, lớp màng dày dần lên đến môi trường hết chất dinh dưỡng, vi khuẩn ngừng sinh trưởng, sau -14 ngày ni cấy tĩnh màng có độ dày khoảng 0,5 - 1cm, độ dày màng tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy Màng CVK nuôi cấy tĩnh môi trường (Nước cất lần, nước dừa già, nước vo gạo) đến ngày thứ thể hình 6; 7; 8: (Hình 6) (Hình 7) (Hình 26 Hình 6: Hình ảnh màng CVK lên men từ mơi trường nước cất lần Hình 7: Hình ảnh màng CVK lên men từ mơi trường nước vo gạo Hình 8: Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trường nước dừa già 3.2 Độ dày màng CVK điều kện ni cấy - Mục đích: thu màng CVK độ dày khác sử dụng màng cho thí nghiệm giai đoạn sau - Nguyên tắc: vi khuẩn A xylinum cho vào môi trường sử dụng chất dinh dưỡng môi trường để tổng hợp nên cellulose Màng cellulose dày lên dần ngưng lại thời điểm định, môi trường hết chất dinh dưỡng Độ dày màng tùy thuộc lượng môi trường thời gian nuôi cấy Thực hiện: môi trường cho vào bình ni cấy với thể tích mơi 30 trường khác sau: Cách tiến hành: môi trường cho vào bình ni cấy với thể tích mơi trường 150ml Lơ 1: Mơi trường ni cấy có thành phần nước cất lần (MT1) Lơ 2: Mơi trường ni cấy có chứa thành phần nước dừa (MT2) Lô 3: Môi trường nuôi cấy có chứa thành phần nước vo gạo (MT3) Mỗi lơ có – bình ni cấy, sau khoảng thời gian – ngày tiến hành thu màng lần (mỗi lô thu khoảng – bình) lúc màng có độ dày khoảng 0,3 – 0,5cm Tiếp tục ni cấy tĩnh bình lại lô 10 – 15 ngày thu màng lúc màng có độ dày khoảng 0,7 – 1cm Tùy thuộc lượng môi trường thời gian nuôi cấy, kết thu màng độ dày khác thể qua bảng 27 Bảng 6: Kết thu màng VCK độ dày khác Lô Thời gian ni Thể tích mơi trường Độ dày màng thu cấy (ngày) nuôi cấy (ml) (cm) 5-7 100 0,5 10-14 100 6-8 100 0,5 11-15 100 7-9 100 0,5 12-16 100 Kết cho thấy màng CVK thơ thu từ mơi trường dinh dưỡng có màu trắng ngà, dễ tách khỏi môi trường nuôi cấy, chứa nhiều nước, chất dẻo dai Bề mặt loại màng CVK chuẩn CVK dừa nhẵn màng CVK gạo Hình ảnh màng CVK thu ngày cấy thứ ngày thứ 14 minh họa hình (a) (b) Hình 9: Màng CVK với thời gian nuôi cấy khác (a): Màng CVK thu ngày nuôi cấy thứ (dày 0,5cm) (b): Màng CVK thu ngày nuôi cấy thứ 14 (dày 1cm) 28 3.3 Tinh chế màng CVK Tinh chế màng CVK để loại bỏ tạp chất có môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy trung hòa độc tố vi khuẩn Đây trình quan trọng trước màng sử dụng để nạp thuốc giúp màng sử dụng lượng thuốc tối đa Màng CVK sau tách từ môi trường nuôi cấy rửa với nước ngâm vào dung dịch NaOH 3%, sau 48 ngâm dung dịch có màu nâu, màng CVK lấy rửa với nước sau ngâm HCl 3%, sau 48 lấy màng rửa với nước, thu màng CVK tinh chế có màu trắng sáng (a) (b) (c) 29 Hình 10: Màng CVK sau tinh chế (a): Màng CVK từ môi trường nước dừa già (b): Màng CVK từ môi trường nước cất lần (môi trường chuẩn) (c): Màng CVK từ môi trường nước vo gạo 3.4 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK • Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau xử lý loại tạp chất gây độc hại, kiểm tra diện đường glucose màng CVK • Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling pha để phát diện đường D – glucose, có xuất kết tủa nâu đỏ • Tiến hành: - Dịch thử màng CVK loại sau xử lý hóa học - Mẫu đối chứng: nước cất dung dịch D – glucose - Cho vào ống nghiệm chứa mẫu thử ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling Đun lửa đèn cồn 10 – 15 phút - Quan sát tủa xuất ống nghiệm - Kết quả: Không phát glucose diện màng Hình11: Thí nghiệm kiể tra độ tinh khiết màng 30 3.5 Khả hấp thụ thuốc Captopril màng CVK Màng tinh khiết sau tinh chế sấy nhiệt độ 60oC để loại nước sau cho màng vào bình chứa 100ml dung dịch Captopril 20% đặt bình vào máy lắc nhiệt độ phòng Sau tham khảo nghiên cứu trước xác định nhiệt độ 80o C tốt cho màng hấp thụ thuốc Captopril Sau ngâm màng CVK dung dịch Captopril khoảng thời gian 1giờ, 1giờ 30 phút, 2giờ lấy dung dịch đo quang phổ UV - 2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Kết đo quang phổ CVK trình bày bảng Bảng 7: Giá trị OD hấp thụ thuốc Captopril màng CVK (n = 3) Độ dày Màng chuẩn Màng dừa Màng gạo 0,5 0,5 màng (cm) 0,5 OD 0,732 ± 0,672 ± 0,772 ± 0,716 ± 0,784 ± 0,732 ± 0,021 0,023 0,0009 0,0027 0,015 0,034 Lấy giá trị OD thu bảng thay vào phương trình đường chuẩn Captopril ta tìm nồng độ Captopril (C%) dung dịch, lấy C% thay vào công thức (1) ta khối lượng Captopril có dung dịch (m1), lấy khối lượng Captopril có dung dịch thay vào cơng thức (2) ta khối lượng Captopril hấp thụ vào màng CVK (mHT), tiếp tục lấy khối lượng Captopril hấp thụ vào màng CVK thay vào công thức (3) ta thu tỷ lệ thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK, tỷ lệ hấp thụ cường độ hấp thụ thuốc màng CVK trình bày bảng 31 Bảng 8: Kết lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK (Kích thước d=1,5cm) (n=3) Độ dày màng OD sau hấp thụ mHT (mg) EE (%) CVK (cm) Màng 0,5 0,73 ± 0,021 21,70 ± 0,03 7,22 ± 0,0027 0,67 ± 0,02 25,62 ± 0,025 8,99 ± 0,03 0,5 0,77 ± 0.01 19,47 ± 0,04 6,49 ± 0.02 0,72 ± 0.03 22,95 ± 0,016 7,649 ± 0,045 0,5 0,784 ± 0,015 18,681 ± 0,031 6,227 ± 0,042 0,732 ± 0,034 21,95 ± 0,0167 7,317 ± 0,041 chuẩn Màng dừa Màng gạo 30 25 20 0.5cm 15 1cm 10 Chuẩn dừa gạo Hình12: Biểu đồ so sánh khối lượng Captopril hấp thụ vào màng CVK 32 Nhận xét: Từ kết bảng cho thấy, lượng thuốc hấp thu vào màng có độ dày 1cm nhiều màng 0,5cm độ dày màng, lượng thuốc hấp thu vào màng khác không giống nhau, tất sai khác có ý nghĩa thống kê với p