Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA ACETAMINOPHEN LÊN s ự PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NG ựA VẰN {DANIO RERIO) Dưomg Thùv Linh s Hoàng Thị Mỹ Hạnh ^ Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Lai Thành ỉ ' Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội TÓM TẮT Trong nhiều tìiập kỷ, Acetaminophen chất thuộc nhóm thuốc hạ nhiệt - giảm đau sử dụng rộng rãi nhiều đối tượng kể ứẻ sơ sinh phụ nữ mang thai Tuy nhiên, có số phát tác dụng phụ lên cấu trúc phát ừiển mạch máu sắc tố Bên cạnh đó, việc đánh giá ảnh hưởng Acetaminophen lên phát triển phơi thai chưa có nghiên cứu kỹ với phương pháp đại đảm bảo độ tin cậy hiệu cao so với yêu cầu an toàn dược phẩm Nghiên cứu sử dụng phôi cá ngựa vằn để đánh giá ảnh hưởng Acetaminophen lên phát triển từ giai đoạn sớm tới ấu thể kết thúc giai đoạn tạo hình hồn thiện mặt hình thái Phôi cá phơi nhiễm liên tục với Acetaminophen từ 96 sau thụ tinh Các giá trị LC50, EC50 TI (chỉ số dị dạng) Acetaminophen quan sát đánh giá kết sau 24, 48, 72 sau 96 Các giá trị sau 96 phơi nhiễm tương ứng là: 700, 300 mg/1 2,33 Các bất thường hình thái phù màng nỗn hồng, phù não, dị dạng đi, hoại tử, tụ máu giảm sắc tố ấu thể ghi nhận Kết thu nghiên cứu cho thấy Acetaminophen có ảnh hưởng khơng nhỏ tới q trình phát triển phơi cá ngựa vằn đặc biệt khả gây dị dạng Từ khóa: Acetaminophen; độc tính; cá ngựa vằn; danio rerío; dị dạng EFFECTS OF ACETAMINOPHEN IN THE EMBRYONIC DEVELOPMENT OF ZEBRAF1SH (DANIO RERIO) SUMMARY Acetaminophen is an over-the-counter analgesic used by all groups of people, including infant and pregnant women The side-effects on structure and development of blood vessels or pigmentation were reported However, the researches on the effect o f Acetaminophen on embryonic development are limited On this study, we evaluated the zeabrafish embryo development at early stage and lava stage under Acetminopheii treatment The zebrafish embryos were exposed with Acetaminophen after hours after fertilization until 96 hours as larval stage The LC50, EC50 and TI (index malfomiation) of Acetaminophen were 29 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn II Hà Nội - 2015 calculated and morphology observation after 24, 48, 72 and 96 hours Aữer 96 hours, the LC50, EC50 and TI are 700, 300 mg/L and 2.33, respectively The malíormation morphology such as yolk sac edema, heart edema, head edema, curved tail, necrosis as well as hypopigmentation were observed Based on these evidences, we concluded that Acetaminophen affected to the development of zebrafish embryos Keywords: Acetaminophen, toxicity, zebrafísh, Danio rerỉo, malíormation ĐẶT VÁN ĐÈ Acetaminophen thành phần đa số loại thuốc giảm đau - hạ sốt thương mại sử dụng Theo số liệu năm 2008 tổ chức PDA, Mỹ, khoảng 24,6 tỉ liều Acetaminophen sử dụng năm có xu hướng tăng [3] Loại thuốc sử dụng phổ biển, kể cho trẻ sơ sinh phụ nữ mang thai Tuy nhiên, ảnh hưởng Acetaminophen lên phát triển phôi thai chưa có kết nghiên cứu ứiực rõ ràng hạn chế phương pháp đối tượng nghiên cứu trước Mơ hình thử độc tính động vật có vú bậc cao (như: chuột, thỏ, gà ) giải pháp hiệu nhưiig bị hạn chế vấn đề đạo đức nghiên cứu, ngân sách thời gian Trong thập niên gần đây, mơ hình thử độc phơi cá ngựa vằn (Danio rerio) khắc phục khó kliăn Với Iihững đặc điểm sinh sản nhanh, dễ ni phòng thí nghiệm, 85% hệ gen tương đồng với hệ gen người [2] đặc biệt trìnli phát triển phôi tương tự động vật bậc cao đưa phơi cá ngựa vằn trở thành mơ hình lý tưởng cho thử độc tính động vật có xương sống ĐĨI TƯỌÌ^G VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cá ngựa vằn {Daino rerỉó) trưởng thành cung cấp phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Động vật, Bộ môn Sinh học xế bào, khoa Sinh học, trưòmg Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Cá nuôi điều kiện 27 ± °c, 14 sán g /10 tối, pH 7,0-7,2 Đầu chu kì sáng, cặp cá ngựa vằn giao phối 30 phút Phôi thu rửa nước RO chọn kính hiển vi để loại bỏ phơi chết, khơng thụ tinh bất thường giai đoạn tò 4-256 tế bào tương ứng 1-3 sau thụ tinh Acetaminophen (>99%, Sigma) pha nước RO với nồng độ tương ứng: 150, 200, 250, 300, 400, 550, 700, 900, 1200 (mg/1) Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm nồng độ acetaminophen đĩa 24 giếng, đổi chứng âm thay thể nước RO 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Trong nghiên cứu này, tiêu chí đánh giá thử độc tính dựa theo tiêu chuẩn OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) [5] Phôi đạt yêu cầu phơi nhiễm với dải nông độ Acetaminophen khác nhau, quan sát ngày ghi lại kết ti lệ sống chết dị dạng hình thái quan sát Tỉ lệ dị dạng tính theo tỉ lệ phơi bất thường / ấu thể sống sót Hình thái so sánh với mơ tả trước Kimmel cs [4] Các tiêu để xác định phôi chết gồm phôi đông tụ, khơng tách đi, khơng hình thành thể tiết (24giờ), thiếu nhịp tim (từ 48 đến 96 giờ) Từ kết thử nghiệm, chúng tơi tiến hành tính nồng độ gây chết 50% (LC50), nồng độ gây dị dạng 50% (EC50), chi số TI (chi số đánh giá mức độc hại hóa chất) Các phân tích tìiống kê gồm hồi quy, biểu đồ, độ tin thực với phần mềm Graphpad Prism v.5.04 KẾT QUẢ NGHIÊN u Anh hưởttg Acetaminophen lên sức sống phôi cá ngựa vằn Để xác định độ độc Acetaminophen, đường cong đáp ứng liều 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 xây dựng dựa tỉ lệ phôi sống ti lệ phôi dị dạng Kết thể hình 3.1 Mt 150 200 ỉịọ ỉõ o 400 ỉ$ 700 900 U M mg/1 Ti lệ phơi sổng ^ Tí lệ phơi dị tìạtig Hình 3.1 Đường cong đáp ứng liều với Acetaminophen sau phơi nhiễm (A) 24 giờ, (B) 48 giờ, (C) 72 giờ,(D) 96 31 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Sau 24 phơi nhiễm, Acetaminophen ảnh hưởng tới khả sống sót hình thái phơi tăng dần theo nồng độ Tại nồng độ 700 mg/l xuất phôi chết, đó, ảnh hưởng gây dị dạng quan sát nồng độ thấp 400 mg/1 (Hình lA) Sau 48 phơi nhiễm, ảnh hưởng Acetaminophen tăng đáng kể so với thời điểm 24 giờ, thể số lượng phôi chết tăng lên (nồng độ 1200 mg/1 số lượng phôi chết đạt 74,3%) nồng độ 250 mg/1 xuất dị dạng hình thái (Hình IB) Tại thời điểm đánh giá sau 72 phơi nhiễm, phôi chết bắt đầu phát thấy nồng độ Acetaminophen 550 mg/1 tất phơi sống xuất dị dạng Kết thúc thí nghiệm thời điểm phơi nhiễm 96 giờ, nồng độ 400 mg/1 Acetaminophen đă bắt đầu làm số phôi chết tỷ lệ phôi chết tăng theo chiều tăng nồng độ (hình ID) Trong nồng độ phơi nhiễm, ngồi nồng độ 150 mg/1 khơng xuất dị dạng, tất nồng độ lại có phơi dị dạng mức độ tỷ lệ phôi dị dạng tỷ lệ thuận với nồng độ Từ kết theo dõi, tính tốn tỷ lệ chết, tỷ lệ dị dạng nồng độ thời gian phơi nhiễm khác nhau, xác định giá trị LC50, EC50 thể Bảng 3.1 Giá trị TI tính dựa vào tỉ số LC50/EC50 Kết bảng 3.1 cho thấy giá trị TI khoảng thời gian phơi nhiễm khác lớn Như vậy, Acetaminophen xem chất có khả gây dị dạng phôi thai Bảng 3.1 Các số LC50, EC50 TI Acetaminophen đối vói phơi cá ngựa vằn khoảng thời gian phơi nhiễm khác 24 LC50 (mg/1) EC50 (mg/1) TI - 830 - 48 72 96 935 800 700 394 340 300 2,56 2,34 2,33 Anh hưởng Acetaminophen tới phát triển hình thái phơi ngựa vằn Bên cạnh tác động tới khả sống sót phơi, Acetminophen ảnh hưởng tới phát triển hình thái ấu thể Chúng quan sát nhiều dị dạng hình thái trình phát triển phôi thời gian phơi nhiễm khác Kết thể hình 3.2 Phân tích dị dạng hình thái phơi, chúng tơi quan sát thấy số dị dạng xuất suốt trình phát triển hoàn thiện quan như: phù màng nỗn hồn, phù màng bao tim, sắc tố Trong đó, số dị dạng xuất sau hoàn thiện quan như: phù não, phù mắt, hoại tử mắt 32 Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Hình 3.2 Các dị dạng phơi nhiễm Acetaminophen A: Đối chứng; B: Phù màng nỗn hồng (24 giờ); C: Hoại tử (48 giờ); D: Phù màng bao tim (72 giờ); E: Phù não (96 giờ); F: Phù mắt (96 giờ); G; Mất sắc tố (96 giờ); H; Dị dạng hình thái (96 giờ); I: Hoại tử não (96 giờ) Mũi tên: Điểm bất thường BÀN LUẬN Tác động Acetaminophen phụ thuộc vào liều thời gian phơi nhiễm thể ti lệ phôi chết mức độ nghiêm trọng phức tạp bất thường hình thái Chúng tơi quan sát mức độ nghiêm trọng dị dạng gia tăng phù nề lớn hơn, tăng dị dạng hình thái đuôi hoại tử T bảng Icho thấy, số TI >1 tất giai đoạn đánh giá kết tương đồng với kết Ingrid cs [8] Từ chúng tơi đưa kết luận Acetaminophen chất có ảnh hưởng đến q trình phát ưiển hình thái phơi Chỉ số TI thời điểm 48 (TI = 2,56) có giá trị lớn thời điểm đánh giá Kểt hợp với giảm mạnh giá trị EC50 giai đoạn phơi nhiễm 24 - 48 giờ, ta nhận thấy Acetaminophen tác động lớn vào hình thái giai đoạn hình thành phát triển quan mà giai đoạn sau hồn thiện Bên cạnh đó, số cơng bố kết 33 Hội nghị Khoa học Cống nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 nghiên cứu chứng minh tính độc Acetaminophen lên phát triển quan thận, khuyết tật ống tiền thận gây độc gan [1,7] Dựa kết phơi nhiễm với Acetaminophen, xác định việc tiếp xúc với Acetaminophen 24 phôi, đủ để gây ảnh hưởng lên phát triển hình thái thể phù màng nỗn hồng (hình 2B) Trong dị dạng thu dị dạng phù màng bao tim dị dạng phổ biến nhất, xuất nhiều nồng độ ừong suốt thời gian phơi nhiễm Ngồi ra, chúng tơi ghi nhận ảnh hưởng Acetaminophen lên hệ tim mạch hệ thần kinh phù màng bao tim, tụ máu, phù não, hoại tử não (Hình 2D, 2E, 21) Một số nghiên cứu công bố tác động Acetaminophen lên phát triển phôi cá ngựa vằn thông qua chi số đánh giá TI, chưa có đánh giá dị dạng hình tíiái q trình phát triển phôi [8] Tuy nhiên nghiên cứu đưa tiêu dị dạng chi tiết như: phù màng bao tim, tụ máu, sắc tố Trong nghiên cứu Chuenlei Pamg cs đưa kết luận Acetaminophen cỏ ảnh hưởng lên phôi cá giai đoạn 24 - 144 sau thụ tinh [6] Như vậy, nghiên cứu này, chúng tơi xác định xác dị dạng mức độ ảnh hưởng Acetaminophen lên giai đoạn phát triển sớm phôi cá ngựa vằn KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhằm xác định mối liên hệ đáp ứng liều tỉ lệ sống chết tỉ lệ dị dạng xác định số TI Từ kết thu được, kết luận Acetaminophen chất có khả gây quái thai mạnh ảnh hưởng đến phát triển phôi cá ngựa vằn thể dị dạng quan sát LỜI CẢM ƠN Kinh phí thực nghiên cứu tài trợ đề tài TN.15.13 QG13.11 TÀ I LIỆU THAM KHẢO Driessen, M., Kienhuis A.S., et al (2013), “Exploring the zebrafísh embryo as an altemative model for the evaluation of liver toxicity by histopathology and expression profiling”, Archives o f toxicology, 87 (5), pp 807-823 Howe, K., Clark M.D., et al (2013), “The zebrafĩsh reíerence genome sequence and its relationship to the human genome”, Nature, 496 (7446), pp 498-503 Http://W ww.Fda.Gov/Drugs/Drugsafetv/Informationbvdnjgclass/Ucm 1651 OV.Htm 34 Hội nghị Khoa họG Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II Hà Nội - 2015 Kimmel, C.B., Ballard w.w„ Kimmel S.R., Ullmann B„ and Schilling T.F (1995), “Stages of embryonic development of the zebrafish”, Developmentai dynamỉcs, 203 (3), pp 253-310 Oecd (2013), T.N.F.E.a.T.F.T., Oecd and Guidelines for the Testing o f Chemicals s., Oecd Publishing Parag, c , Seng W.L., Semino c., and Mcgrath p (2002), “Zebrafish; a preclinical model for drug screening”, Assay and drug development technologies, 1(1), pp 41-48 Peng, H.-C., Wang Y.-H., Wen C.-C., Wang Cheng C.-C., and Chen Y.-H (2010), “Nephrotoxicity during assessments of acetaminophen zebrafish embryogenesis”, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicoỉogy & Pharmacology, 151 (4), pp 480-486 Selderslaghs, I.w , Blust R., and Witters H.E (2012), “Peasibility study of the zebrafísh assay as an altemative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds”, Reproductive Toxicology, 33 (2), pp 142-154 35 ... hưởng Acetaminophen lên hệ tim mạch hệ thần kinh phù màng bao tim, tụ máu, phù não, hoại tử não (Hình 2D, 2E, 21) Một số nghiên cứu công bố tác động Acetaminophen lên phát triển phôi cá ngựa vằn. .. luận Acetaminophen cỏ ảnh hưởng lên phôi cá giai đoạn 24 - 144 sau thụ tinh [6] Như vậy, nghiên cứu này, xác định xác dị dạng mức độ ảnh hưởng Acetaminophen lên giai đoạn phát triển sớm phôi cá ngựa. .. tới phát triển hình thái phơi ngựa vằn Bên cạnh tác động tới khả sống sót phơi, Acetminophen ảnh hưởng tới phát triển hình thái ấu thể Chúng quan sát nhiều dị dạng hình thái q trình phát triển phơi