Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria Roscoe) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ - NĂM 2019 LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc quan tâm giúp đỡ hướng dẫn tận tình Xin bày tỏ lòng biết ơn tới cán giảng viên Bộ môn Sinh học Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế; Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2013-2014); Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh học-Trường Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa bản, Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo điều kiện tốt để chúng tơi hồn thành luận án Xin cám ơn đồng nghiệp, bạn bè nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tơi hồn thành luận án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân gia đình ln giúp đỡ, động viên khích lệ vật chất lẫn tinh thần Xin trân trọng cảm ơn! Huế, ngày tháng năm 2019 Tác giả Trương Thị Phương Lan i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa công bố cơng trình khác Nếu có sai sót tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tác giả luận án Trương Thị Phương Lan ii BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurine CoA coezyme A cs cộng CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide CzDCS Curcuma zedoaria DCS CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1 CzCURS2 Curcuma zedoaria CURS2 CzCURS3 Curcuma zedoaria CURS3 ĐC đối chứng DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl dw dry weight (khối lượng khô) FRAP ferric reducing antioxidant power fw fresh weight (khối lượng tươi) HPLC high-performance liquid chromatography IBA 3-indolebutyric acid KIN kinetin MAPK mitogen-activated protein kinase MeJA methyl jasmonate MS Murashige and Skoog (1962) NAA naphthaleneacetic acid NO nitric oxide PAA phenyl acetic acid ROS reactive oxygen species SA salicylic acid SNP sodium nitroprusside YE yeast extract (dịch chiết nấm men) iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY NGHỆ ĐEN 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học củ nghệ đen 1.1.3.1 Tinh dầu 1.1.3.2 Curcuminoid 1.1.4 Công dụng nghệ đen 1.1.4.1 Hoạt tính giảm đau 1.1.4.2 Hoạt tính kháng ung thư 1.1.4.3 Hoạt tính bảo vệ gan 1.1.4.4 Hoạt tính kháng viêm chống loét 1.1.4.5 Hoạt tính chống oxy hóa 10 1.1.4.6 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm 10 1.1.4.7 Các hoạt tính khác 11 1.3 ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG 15 iv 1.3.1 Elicitor 15 1.3.1.1 Khái niệm 15 1.3.1.2 Phân loại 15 1.3.1.3 Cơ chế kích kháng 16 1.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kích kháng 18 1.3.2 Ứng dụng elicitor 20 1.3.2.1 Elicitor sinh học 20 1.3.2.2 Elicitor phi sinh học 26 1.4 CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID 27 1.4.1 Các đường sinh tổng hợp curcuminoid 27 1.4.2 Vai trò gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid 31 1.4.2.1 Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS) 31 1.4.2.2 Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS) 31 1.4.2.3 Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase 32 1.4.2.4 Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase 33 1.4.2.5 Các gen khác 34 1.4.3 Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp 35 1.4.4 Cải thiện biểu gen xử lý elicitor 37 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Nuôi cấy in vitro nghệ đen 40 2.2.1.1 Khử trùng mẫu vật 40 2.2.1.2 Tái sinh chồi tạo rễ in vitro 41 2.2.1.3 Nuôi cấy callus 41 2.2.1.4 Nuôi cấy tế bào 41 2.2.2 Phân lập gen tổng hợp curcuminoid 42 2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 42 v 2.2.2.2 Khuếch đại PCR 43 2.2.2.3 Tạo dòng giải gen 43 2.2.2.4 Xây dựng phả hệ 45 2.2.3 Xác định biểu gen tổng hợp curcuminoid 46 2.2.3.1 Xử lý elicitor 46 2.2.3.2 Phân tích RT-PCR 46 2.2.3.3 Phân tích HPLC 48 2.2.4 Xử lý thống kê 49 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO 50 3.1.1 Nhân giống nghệ đen in vitro 50 3.1.1.1 Tái sinh chồi 50 3.1.1.2 Tạo rễ in vitro 52 3.1.2 Nuôi cấy callus 54 3.1.2.1 Ảnh hưởng 2,4-D KIN 54 3.1.2.2 Ảnh hưởng 2,4-D NAA 55 3.1.2.3 Ảnh hưởng 2,4-D AgNO3 55 3.1.3 Nuôi cấy tế bào nghệ đen 57 3.2 NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 59 3.2.1 Phân lập gen 59 3.2.2 Phân tích biểu gen tổng hợp curcuminoid 68 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID 72 3.3.1 Thăm dò ảnh hưởng elicitor lên biểu gen tổng hợp curcuminoid 72 3.3.2 Biểu gen tổng hợp curcuminoid 74 3.3.3 Tích lũy curcumin 76 Chương BÀN LUẬN 79 vi 4.1 THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO 79 4.1.1 Nhân giống nghệ đen in vitro 79 4.1.2 Nuôi cấy callus tế bào nghệ đen 81 4.2 PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 83 4.2.1 Phân lập gen tổng hợp curcuminoid 83 4.2.2 Sự biểu gen tổng hợp curcuminoid 85 4.3 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 85 4.3.1 Đặc điểm elicitor sử dụng nghiên cứu 85 4.3.1.1 Dịch chiết nấm men 85 4.3.1.2 Salicylic acid 87 4.3.2 Ảnh hưởng elicitor lên sinh trưởng tế bào 89 4.3.3 Ảnh hưởng elicitor lên mức độ biểu gen 90 4.3.4 Ảnh hưởng elicitor lên khả sản xuất curcumin 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95 KẾT LUẬN 95 KIẾN NGHỊ 95 DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO 97 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại elicitor khác 17 Bảng 1.2 Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả tích lũy hợp chất thứ cấp nuôi cấy in vitro 21 Bảng 2.1 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng CDS gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 45 Bảng 2.2 Trình tự primer dùng để khuếch đại vùng thị gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 47 Bảng 3.1 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tái sinh chồi chồi in vitro nguyên vẹn 51 Bảng 3.2 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tái sinh chồi chồi in vitro chẻ đôi 52 Bảng 3.3 Ảnh hưởng AgNO3 lên khả tạo rễ chồi in vitro 53 Bảng 3.4 Ảnh hưởng KIN từ 0,5-2 mg/L 2,4-D mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA từ 0,5-2 mg/L 2,4-D mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 56 Bảng 3.6 Ảnh hưởng 2,4-D mg/L AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh trưởng callus nghệ đen 56 Bảng 3.7 Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 CzCURS3 loại mô khác nghệ đen 70 Bảng 3.8 Mật độ băng DNA vùng đặc hiệu ở gen tổng hợp curcuminoid 76 Bảng 3.9 Ảnh hưởng elicitor lên sinh trưởng tích lũy curcumin tế bào nghệ đen 77 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học curcumin Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp curcuminoid nghệ vàng 30 Hình 1.3 Vai trò gen DCS CURS tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng 32 Hình 2.1 Cây nghệ đen 39 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 40 Hình 2.3 Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ) 44 Hình 2.4 Vị trí primer xuôi ngược gen CzCURS1 48 Hình 3.1 Cây nghệ đen in vitro tháng tuổi 53 Hình 3.2 Callus nghệ đen tuần tuổi sinh trưởng mơi trường có 2,4-D mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) đối chứng sinh trưởng mơi trường có 2,4-D mg/L kết hợp với BAP mg/L (B) 57 Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng tế bào nghệ đen 58 Hình 3.4 Tế bào nghệ đen ni bình tam giác chứa mơi trường MS bổ sung 2,4-D mg/L BAP mg/L 59 Hình 3.5 Sinh khối tươi (A) khơ (B) tế bào nghệ đen 59 Hình 3.6 Sản phẩm PCR gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số nghệ đen 61 Hình 3.7 Sơ đồ xếp intron/exon gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 61 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzDCS (MF663785) ở nghệ đen DCS ở nghệ vàng (AB495006.1) 62 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS1 (MF402846) ở nghệ đen CURS1 ở nghệ vàng (AB495007.1) 63 Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS gen CzCURS2 (MF402846) ở nghệ đen CURS2 ở nghệ vàng (AB506762.1) 64 ... ni cấy tế bào [158], [169] Từ lý trên, thực đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng lên biểu số gen tham gia vào trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) ... CzCURS tham gia trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ở nghệ đen - Nghiên cứu ảnh hưởng số elicitor YE, SA MeJA lên mức độ biểu gen tổng hợp curcuminoid khả tích lũy curcumin tế bào nghệ. .. lập gen 59 3.2.2 Phân tích biểu gen tổng hợp curcuminoid 68 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID 72 3.3.1 Thăm dò ảnh hưởng elicitor lên biểu