Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề lâm sàng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn trên thế giới vì tần suất mắc bệnh và tử vong tăng cao. Nghiên cứu (NC) ở các nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM là 10% [61], [105]. Tại Canada, VPTM là 18 ca trên 1000 ngày thở máy [75]. Các quốc gia Á Châu VPTM là 18% [43]. Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17]. VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày ở nhóm có và không VPTM) và tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5], [41]. VPTM được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Chẩn đoán VPTM được thiết lập dựa trên chứng cứ lâm sàng và vi sinh. Việc xác định vi khuẩn (VK) gây bệnh thông qua cấy định lượng hoặc bán định lượng đàm hút qua nội khí quản đơn thuần hoặc qua nội soi phế quản [34], [41], [50]. Việc định danh VK bằng nhuộm Gram, nuôi cấy, đặc tính mọc và các phản ứng sinh hóa là chuẩn mực. Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển này không thể áp dụng trong các trường hợp sau: VK Gram âm khó mọc, mọc chậm; VK hiếm hoặc chỉ biểu hiện một vài đặc tính về sinh hóa. Cũng như các VK yếm khí, VK không cấy được và bệnh lý nhiễm khuẩn có kết quả cấy âm tính, nhất là trên bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trước đó [50], [57], [73], [74], [83], [97], [114]. Chẩn đoán phân tử, ngày nay, đã trở thành phương pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học của nhiều bệnh lý hô hấp [73]. Vai trò của giải trình tự gene 16S - rRNA trong định danh VK càng được chứng tỏ và được áp dụng rộng rãi trên lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117]. Phương pháp giải trình tự gene 16S - rRNA có thể phát hiện được hệ vi sinh trên đường hô hấp của người khỏe và BN [29], [44], [88]. Tại Việt Nam số liệu từ các NC về định danh VK dựa trên sinh học phân tử ở các BN VPTM chưa nhiều và chưa được hệ thống đầy đủ. Ngày nay, VK đa kháng kháng sinh là một thách thức toàn cầu [58]. Đặc biệt là các quốc gia Á Châu, kể cả Việt Nam [12], [20], [59], [74], [78], [101]. Tỉ lệ A. baumannii kháng Carbapenem tăng lên nhanh chóng 6,7% (2001) [8]; 8% (2004) [17]; 80% (2010) [11]; 90% (2012) [5]. Tuy nhiên, kháng sinh đồ định lượng MIC bằng que E-test chưa được áp dụng rộng rãi và số liệu chưa được hệ thống đầy đủ. Các VK mang gene SHV, TEM, IMP, OXA, NDM thủy phân phổ rộng các cephalosporin là thường gặp [81]. Trong nước, việc tiếp cận có hệ thống gene kháng thuốc của VK chính yếu gây VPTM chưa được ghi nhận và hệ thống hóa đầy đủ. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào áp dụng giải trình tự thế hệ mới trong việc xác định VK gây VPTM trên các mẫu dịch rửa phế quản phế nang. Chúng tôi đặt ra 3 câu hỏi nghiên cứu: (a) Có sự khác biệt nào trong định danh VK gây VPTM giữa hai phương pháp định danh VK dựa vào kiểu hình và giải trình tự gene 16SrRNA; (b) Giá trị MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm VK gây VPTM phân bố như thế nào?; (c) Tỉ lệ VK chính yếu gây VPTM mang gene kháng thuốc là bao nhiêu và có mối liên quan giữa các VK mang gene kháng thuốc với MIC hay không? Trả lời những câu hỏi nghiên cứu trên sẽ cung cấp những kiến thức quan trọng về qui mô đề kháng kháng sinh và xác lập được những tác nhân liên quan đến VPTM, giúp cho việc điều trị BN tốt hơn. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu: 1. Xác định đặc điểm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật giải trình tự gene 16S - rRNA, có so sánh với phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nhuộm Gram, nuôi cấy và các phản ứng sinh hóa. 2. Đánh giá MIC và tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các nhóm vi khuẩn gây viêm phổi thở máy. 3. Xác định gene kháng thuốc của vi khuẩn gây viêm phổi thở máy bằng kỹ thuật PCR và mối liên quan với MIC.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN MINH GIANG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI THỞ MÁY VÀ GENE KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ NGÀNH: HỒI SỨC CẤP CỨU VÀ CHỐNG ĐỘC MÃ SỐ: 62720122 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Bảng từ viết tắt đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ, sơ đồ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa………………………………………………………………………3 1.2 Tỉ lệ mắc viêm phổi thở máy 1.3 Tỉ lệ tử vong 1.4 Bệnh nguyên 1.5 Các yếu tố nguy 25 1.6 Chẩn đoán 28 1.7 Thực kháng sinh đồ vi khuẩn phân lập từ VPTM 29 1.8 Ứng dụng sinh học phân tử phát gene kháng thuốc 30 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thiết kế nghiên cứu 32 2.2 Địa điểm nghiên cứu 32 2.3 Thời gian nghiên cứu 32 2.4 Đối tượng nghiên cứu 32 2.5 Cỡ mẫu cơng thức tính cỡ mẫu 32 2.6 Tiêu chuẩn chọn mẫu 33 2.7 Phương pháp tiến hành 34 2.8 Phương pháp phát gene kháng thuốc…………………………………….45 2.9 Thu thập số liệu phân tích liệu 45 2.10 Đạo đức nghiên cứu……………………………………………………46 2.11 Liệt kê định nghĩa biến số (phụ lục 11) 46 2.12 Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………………………… 47 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Đặc điểm chung 48 3.2 Định danh vi khuẩn dựa vi sinh kinh điển 50 3.3 Định danh vi khuẩn dựa giải trình tự gene 16S-rRNA 51 3.4 Tổng số loài vi khuẩn phát mẫu dịch rửa phế quản phế nang 55 3.5 So sánh giải trình tự gene 16S-rRNA vi sinh kinh điển định danh vi khuẩn 56 3.6 Tính độ nhạy độ đặc hiệu PGM 58 3.7 Thời gian nằm ICU tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy 59 3.8 Kết kháng sinh đồ 60 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC dựa E-test 66 3.10 Kết PCR tìm gene kháng thuốc 73 3.11 Kết điều trị 75 Chương 4: BÀN LUẬN 76 4.1 Định danh vi khuẩn 77 4.2 Kết kháng sinh đồ 91 4.3 Xác định gene kháng thuốc mối liên quan với đề kháng kháng sinh 98 KẾT LUẬN 105 KIẾN NGHỊ 108 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BẢNG VIẾT TẮT VÀ ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH - VIỆT Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt APACHE Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Thang điểm lượng giá bệnh lý cấp tính mạn tính ARDS ATS Acute Respiratory Distress Syndrome American Thoracic Society Hội chứng nguy ngập hô hấp cấp Hội Lồng Ngực Hoa Kỳ BA Blood agar Đĩa thạch máu BAL Bronchial-alveolar lavage Rửa phế quản phế nang CDC Chocolate agar Haemophilus influenzae Centers for Disease Control and Bệnh nhân Cặp base Bệnh viện Chợ Rẫy Bệnh viện Nhân Dân Gia Định Thạch chocolate cho Haemophilus influenzae Trung tâm kiểm soát bệnh CFU Prevention Colony-Forming Unit tật Hoa Kỳ Đơn vị tạo khuẩn lạc Cytomegalovirus Chronic Obstructive Pulmonary Disease Clinical pulmonory infection score Virus cytomegalovirus Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Thang điểm viêm phổi lâm sàng Protein C phản ứng Dịch rửa phế quản phế nang Thạch eosin methylene blue BN Bp BVCR BVNDGĐ CAHI CMV COPD CPIS Base pair CRP DRPQPN EBM C - reactive protein EPIC The European Prevalence of Infection in Intensive Care ESBL Extended-Spectrum BetaLactamase Eosin methylene blue agar Tỉ lệ mắc nhiễm khuẩn ICU bệnh nhân Châu Âu Men β-lactamase phổ rộng Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt FiO2 Fraction of inspired oxygene Phân suất oxy khí thở vào HIV Human immunodeficiency virus ICU Intensive care unit Virus gây suy giảm miễn dịch người Khoa săn sóc đặc biệt IDSA Infectious Diseases Society of Hội bệnh lý truyền nhiễm America Hoa Kỳ Interquartile range Infection-related ventilator - Khoảng tứ phân vị Biến chứng liên quan nhiễm associated complication Kligler iron agar khuẩn bệnh nhân thở máy Thạch kligler iron Confidence interval MacKonkey agar Mueller Hinton agar Minimal inhibitory concentration Medical intensive care unit Methycillin-Resistant Kháng sinh đồ Khoảng tin cậy Thạch MacKonkey Thạch Mueller Hinton Nồng độ ức chế tối thiểu Khoa ICU nội Tụ cầu vàng kháng Staphylococcus aureus methycillin Methycillin-Sensitive Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng nhạy methycillin Nghiên cứu Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ Giải trình tự hệ Nội khí quản IQR IVAC KIA KSĐ KTC MA MH MIC MICU MRSA MSSA NC NCBI National center for biotechnology information NGS NKQ Next generation sequencing NNIS National Nosocomial Infections Surveillance System NSPQ NTNT Hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ Nội soi phế quản Ngưng tim ngưng thở Từ viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh Thuật ngữ tiếng Việt OR Odds ratio Tỷ số số chênh PCT PEEP PGM Procalcitonin Positive end-expiratory pressure Personal genome machine Procalcitonin Áp lực dương cuối thở Máy gene cá thể PK/PD pharmacokinetic/pharmacodynamic Dược động/dược lực Possible possible ventilator - associated Có thể viêm phổi thở máy VAP PPI pneumonia Proton pump inhibitors Ức chế bơm proton Probable VAP PSB Probable ventilator - associated pneumonia Protected Specimen Brush Có thể có khả viêm phổi thở máy Chải phế quản có nòng bảo SSĐB vệ Tỷ số nguy Độ bảo hòa oxy động mạch Khoa hồi sức ngoại Độ bão hòa oxy theo mạch đập Săn sóc đặc biệt TBMMN Tai biến mạch máu não THA T0 VAC Tăng huyết áp Nhiệt độ Biến chứng liên quan thở máy Biến cố liên quan thở máy Vi khuẩn Viêm phổi Viêm phổi thở máy RR SaO2 SICU SpO2 VAE VK VP VPTM Risk ratio Arterial oxygene Saturation Surgical intensive care unit Pulse oximetric saturation Ventilator - associated condition Ventilator-associated event DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban đầu:…………………………….7 Bảng 1.2 Bệnh nguyên viêm phổi thở máy:……………………………………8 Bảng 1.3 Tần suất vi khuẩn phân lập từ ICU bệnh viện Fatmawati:……… 11 Bảng 1.4 Tần suất vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân viêm phổi khoa ICU Việt Nam:…………………………………………………………… 12 Bảng 1.5.1 Tác nhân vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân thở máy ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh:……………………… 13 Bảng 1.5.2 Tác nhân vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân thở máy ICU bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh (tiếp theo):…………… 14 Bảng 1.6 Tính đa dạng vi khuẩn phát giải trình tự gene:…….25 Bảng 1.7 Các yếu tố nguy VPTM:……………………………………… 26 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tạo amplicon - phản ứng tạo “bản sao” vùng V3, V6, V7 V9 gen 16S-rRNA:………………………………38 Bảng 2.2 Thành phần hóa chất thêm vào dung dịch rửa việc tinh phản ứng PCR khuếch đại vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA:… 39 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo amplicon hoàn chỉnh - tạo “đầu bằng” cho vùng V3, V6, V7 V9 gene 16S-rRNA:……………… 40 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng tạo “thư viện” - phản ứng gắn Adapter trP1 vào đầu “đầu bằng” vùng V3, V6, V7 V9 gene 16SrRNA:……………………………………………………………………… 40 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo “bản sao” thư viện:………….………41 Bảng 2.6 Thành phần dung dịch sử dụng cho việc gắn “thư viện” gene vào hạt ISP: …………………………………………………………………………………… 42 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng chuẩn bị gắn “thư viện” gene vào hạt ISP:…… 43 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng tách mạch “thư viện” gene khỏi gắn hạt SP:….…………………………………………………………………… 43 Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu:……………………… 49 Bảng 3.2 Phân bố vi khuẩn phân lập định danh truyền thống:……… 51 Bảng 3.3 So sánh hai phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào nuôi cấy giải trình tự hệ thống PGM:……………… ………………… 57 Bảng 3.4 Độ nhạy độ đặc hiệu PGM:………………………………… .58 Bảng 3.5 Kết kháng sinh đồ khuếch tán chung:………………………………60 Bảng 3.6 Kháng sinh đồ khuếch tán Acinetobacter spp:………………….61 Bảng 3.7 Kháng sinh đồ khuếch tán Klebsiella spp:… .62 Bảng 3.8 Kháng sinh đồ khuếch tán Pseudomonas spp:………………….63 Bảng 3.9 Kết kháng sinh đồ MIC Acinetobacter baumannii:……… 66 Bảng 3.10 Kết kháng sinh đồ MIC K Pneumoniae:……………… 67 Bảng 3.11 Kết kháng sinh đồ MIC Pseudomonas aeruginosa:………68 Bảng 3.12 Kết kháng sinh đồ MIC Escherichia coli:……………… 69 Bảng 3.13 Kết kháng sinh đồ MIC Burkholderia cepacia:………… 70 Bảng 3.14 Phân bố gene kháng thuốc phát được:……………………………73 Bảng 3.15 Mối liên quan gene kháng thuốc đề kháng kháng sinh:……….74 Bảng 3.16 Kết người bệnh khỏi khoa chung:………………………………75 Bảng 3.17 Kết điều trị:……………………………………………………… 75 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tạo thư viện cho kỹ thuật NGS:………………………….………38 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu:………………………………………………………47 Biểu đồ 3.1 Phân tích cụm 99 lồi vi khuẩn định danh giải trình tự 16SrRNA:………………………………………………………………………………53 Biểu đồ 3.2 Số loài vi khuẩn phát mẫu DRPQPN: ………….55 Biểu đồ 3.3 Mối liên quan vi khuẩn phân lập số ngày nằm ICU:… 59 Biểu đồ 3.4 Mạng lưới đa kháng kháng sinh A baumannii, K pneumoniae P aeruginosa: ……………………………………………………65 Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ số kháng sinh bị đề kháng:…………………………………… 72 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi thở máy (VPTM) vấn đề lâm sàng quan trọng khơng Việt Nam mà giới tần suất mắc bệnh tử vong tăng cao Nghiên cứu (NC) nước Âu – Mỹ cho thấy tỉ lệ VPTM 10% [61], [105] Tại Canada, VPTM 18 ca 1000 ngày thở máy [75] Các quốc gia Á Châu VPTM 18% [43] Tại Việt Nam, VPTM dao động từ 20% - 52%, [2], [5], [7], [8], [11], [16], [17] VPTM nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong (26% - 72%), kéo dài thời gian nằm viện (41 so với 23 ngày nhóm có khơng VPTM) tăng chi phí điều trị (5 – 10 lần) [5], [41] VPTM định nghĩa viêm nhu mô phổi xảy sau 48 thở máy qua nội khí quản qua khai khí quản [42], [61] Chẩn đoán VPTM thiết lập dựa chứng lâm sàng vi sinh Việc xác định vi khuẩn (VK) gây bệnh thông qua cấy định lượng bán định lượng đàm hút qua nội khí quản đơn qua nội soi phế quản [34], [41], [50] Việc định danh VK nhuộm Gram, ni cấy, đặc tính mọc phản ứng sinh hóa chuẩn mực Tuy nhiên phương pháp vi sinh kinh điển áp dụng trường hợp sau: VK Gram âm khó mọc, mọc chậm; VK biểu vài đặc tính sinh hóa Cũng VK yếm khí, VK khơng cấy bệnh lý nhiễm khuẩn có kết cấy âm tính, bệnh nhân (BN) sử dụng kháng sinh trước [50], [57], [73], [74], [83], [97], [114] Chẩn đoán phân tử, ngày nay, trở thành phương pháp tham chiếu để chẩn đoán vi sinh học nhiều bệnh lý hơ hấp [73] Vai trò giải trình tự gene 16S rRNA định danh VK chứng tỏ áp dụng rộng rãi lâm sàng [57], [58], [80], [116], [117] Phương pháp giải trình tự gene 16S - rRNA phát hệ vi sinh đường hô hấp người khỏe BN [29], [44], [88] Tại Việt Nam số liệu từ NC định danh VK dựa sinh học phân tử BN VPTM chưa nhiều chưa hệ thống đầy đủ 8.Khác Thang điểm Biến Apache-II định 72 Từ o đến 71 lượng - Tính trực tiếp từ clincalc thông qua: tuổi, 15 yếu tố khác BIẾN SỐ ĐỘC LẬP Tên biến Loại biến Sử dụng thuốc Biến nhị giá Số giá trị an thần dãn Cách đo Nội dung 1: Có - Có: 0: khơng lần sử dụng sau đặt NKQ suốt thời gian thở máy - Không: không ghi nhận Cách dùng Biến nhị giá 1: có 1.Liên tục - Liên tục: 2.Ngắt quãng dùng bơm tiêm tự động kéo dài 0: không - Ngắt quãng: tiêm tĩnh mạch ống Loại dùng Biến nhị giá 1.Midazolam - Có: có sử dụng 1: có 2.Seduxen hay nhiều loại 0: không 3.Fentanyl - Không: không sử 4.Norcuron dụng loại thuốc 5.Propofol 6.Suxamethonium 7.Khác Dùng thuốc Biến nhị giá dày 1: Có - Có: có sử 0: Không dụng miệng đường tĩnh mạch - Không: khơng có sử dụng Biến nhị giá Loại dùng Đặt lại NKQ Biến nhị giá 1.Ức chế bơm - Có: có sử 1: có proton dụng 0: khơng 2.Ức chế H2 nhiều loại 3.Kháng axít - Khơng: khơng có 4.Sucralfate sử dụng 1: có - Có: có đặt lại 0: không NKQ do: tắc, gập, hay tuột, xì, bệnh nhân tự rút - Khơng: khơng đặt lại NKQ Số lần Biến thứ tự Nhỏ Lớn Ngày xuất Biến VPTM định 87 Từ đến 90 lượng Ngày xác định VPTM LÂM SÀNG Kháng dùng sinh Biến nhị giá 1: có 1.Cefo/Sul - Có: có sử 2.Levofloxacin dụng hay 0: khơng 3.Imipenem nhiều loại kháng 4.Ciprofloxacin sinh 5.Moxifloxacin - Khơng: khơng có 6.Cepha sử dụng 7.Meropenem 8.Aminoglycosid 9.Ticar/Clavu 10.Cefa 11.Colistin 12.Vancomycin 13 Am/Sul Số ngày dùng Định lượng 90 Từ 1-90 Tổng số ngày dùng kháng sinh kháng sinh nội viện chứng Biến nhị giá Biến NSPQ 1.Chảy máu 1: có 2.Tràn khí da 0: khơng 3.Tràn khí trung thất 4.Khác - Có: có xảy hay nhiều biến chứng - Không: không ghi nhận biến chứng BIẾN SỐ PHỤ THUỘC Kết cấy Biến nhị giá đàm định lượng 1.≥104 đơn vị tạo - Dương: ≥104 đơn 1: dương khuẩn lạc/ml 0: âm 2.