TNFα là một cytokine tiền viêm đóng vai trò then chốt trong cơ chế bệnh sinh của bệnh viêm khớp dạng thấp. Cho đến nay, việc sử dụng Entanercept (ETA) trung hòa TNFα là phương pháp hiệu quả nhất cho việc điều trị căn bệnh này. Tuy nhiên, việc sử dụng sản phẩm này cũng gây ra nhiều tác dụng phụ tới người bệnh do liều tiêm cao và việc sử dụng kéo dài. Chính vì vậy, việc giảm liều lượng tiêm, số lần tiêm cũng như kéo dài thời gian hiệu quả cho thuốc là rất cần thiết. Các vật liệu mang thuốc đã được nghiên cứu nhằm mục đích này, tuy nhiên lại chưa có tính hướng đích. Tại các ổ dịch khớp viêm các tế bào miễn dịch tập trung với số lượng rất lớn và biểu hiện lượng Dectin1 cao hơn rất nhiều lần so với bình thường. Dựa vào đây nhóm nghiên cứu đã đưa ra ý tưởng sử dụng Curdlan với đặc trung là liên kết βglucan – một phối tử mạnh và đặc hiệu với Dectin1 để tạo ra tính đặc hiệu cho vật liệu mang thuốc. Vật liệu mang thuốc được đưa về kích thước nano nhằm tận dụng được các ưu điểm của kích thước này mang lại như khả năng mang thuốc, tính thấm qua thành mạch và tăng khả năng tương tác bề mặt. Để đánh giá tác dụng sinh học của một sản phẩm phức hệ mang thuốc dạng nano có nhiều đối tượng và cấp độ thực nghiệm như sử dụng thực nghiệm trên tế bào động vật, động vật thực nghiệm hay trên người. Trong đó, biện pháp đánh giá tác dụng sinh học trên tế bào là dễ triển khai, an toàn và có khả năng đánh giá được tác động của sản phẩm lên một đối tượng tế bào nhất định, bước đầu đưa ra được các đặc tính sinh học của phức hệ, từ đó củng cố cơ sở lý thuyết cơ bản, đưa ra bằng chứng thực nghiệm và hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển phức hệ có tính ứng dụng nhằm điều trị các bệnh lý nói chung. Trong khuôn khổ đề tài này đó là điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp. Dòng đại thực bào chuột RAW 264.7 là một dòng tế bào thương mại dễ nuôi, phổ biến, biểu hiện mạnh các cytokines IL6, IL1β, IL10, TNFα…, ngoài ra, dòng tế bào này cũng biểu hiện tốt thụ thể Dectin1, một thụ thể được biểu hiện nhiều ở các tế bào miễn dịch trong các ổ dịch Viêm khớp dạng thấp. Đại thực bào RAW264.7 là một ứng cứ viên sáng giá cho mô hình thử nghiệm hoạt tính sinh học ở cấp độ tế bào cho các sản phẩm điều trị bênh Viêm khớp dạng thấp. Nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo phức hệ nanogel AgaroseCurldan mang thuốc Etanercept ức chế yếu tố hoại tử u TNFα và thử nghiệm trên đại thực bào RAW 264.7” với mục đích chế tạo ra phức hệ mang thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp có kích thước nano và đánh giá các tác dụng sinh học cơ bản của phức hệ trên mô hình tế bào.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Hữu Tuấn Dũng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ GEL AGAROSE-CURDLAN MANG THUỐC ENTANERCEPT ỨC CHẾ YẾU TỐ HOẠI TỬ KHỐI U TNF-α VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN ĐẠI THỰC BÀO RAW264.7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Hữu Tuấn Dũng NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ GEL AGAROSE-CURDLAN MANG THUỐC ENTANERCEPT ỨC CHẾ YẾU TỐ HOẠI TỬ KHỐI U TNF-α VÀ THỬ NGHIỆM TRÊN ĐẠI THỰC BÀO RAW264.7 Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Phạm Thị Thu Hường Hà Nội – Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, hỗ trợ dẫn tận tình từ phí thầy cơ, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòngng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thu Hường tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn cán bộ, tập thể nhóm nghiên cứu bạn sinh viên phòng Sinh học Nano Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym & Protein Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, người giúp đỡ, động viên khích lệ tơi nhiều suốt thời gian thực luận văn thạc sĩ; thầy cô giáo Bộ mơn Hóa sinh học thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Sau cùng, muốn gửi tới gia đình, bạn bè lời cám ơn chân thành động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập vằ hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cám ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Hữu Tuấn Dũng MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TNF-α phản ứng viêm viêm khớp dạng thấp 1.1 Yếu tố hoại tử khối u TNF-α .8 1.2 TNF-α bệnh viêm khớp dạng thấp Các phương pháp điều trị viêm khớp dạng thấp theo chế trung hòa TNF-α 13 Vật liệu mang thuốc dạng nano 14 Thụ thể Dectin-1 Curdlan 16 Mơ hình hoạt động phức hệ mục tiêu nghiên cứu 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Vật liệu 19 `Chế tạo phức hệ nano 19 Dòng đại thực bào RAW264.7 19 Xây dựng quy trình chế tạo phức hệ dạng nano 19 Đánh giá đặc tính vật lý, hóa học phức hệ 20 3.1 Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử 20 3.2 Phương pháp tán xạ ánh sang động (DLS) 21 3.3 Phương pháp khố phổ hồng ngoại (FTIR) 21 3.4 Phương pháp đánh giá khả phân tán phức hệ 22 Đánh giá khả giải phóng thuốc hiệu suất bao gói phức hệ .22 Phân tích hiệu sinh học phức hệ lên tế bào nuôi cấy .23 5.1 Phương pháp đánh giá biểu Dectin-1 23 5.2 Phương pháp đánh giá độc tính tế bào sử dụng kit CCK-8 24 5.3 Phương pháp Boyden-Chamber .26 5.4 Phương pháp ELISA .27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 Quy trình chế tạo phức hệ tính chất lý hóa phức hệ 28 1.1 Quy trình chế tạo phức hệ 28 1.2 Kích thước phức hệ 29 1.3 Phân bố kích thước phức hệ 30 1.4 Các thành phần hóa học phức hệ 31 Khả giải phóng thuốc hiệu suất bao gói phức hệ 34 Khả phân tán phức hệ 35 Tác động sinh học phức hệ lên tế bào 36 6.1 Khả biểu Dectin-1 phức hệ dòng tế bào ni cấy 36 6.2 Ảnh hưởng phức hệ lên khả sinh trưởng dòng tế bào 37 6.3 Tính hướng đích phức hệ lên dòng đại thực bào RAW264.7 39 6.4 Khả trung hòa TNF-α phức hệ .44 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .51 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Sự biểu TNF-α đại thực bào thơng qua thụ thể TLR4 Hình Khớp xương người bệnh viêm khớp dạng thấp (bên phải) khớp xương người bình thường (bên trái) .10 Hình TNF-α chế tác động phản ứng viêm .11 Hình Một số loại thuốc điều trị viêm khớp dạng thấp 13 Hình Thụ thể Dectin-1 β-Glucan .16 Hình Mơ hình hoạt động dự kiến phức hệ nanogel mang thuốc ức chế yếu tố hoại tử khối u TNF-α tương tác với đại thực bào 17 Hình Phản ứng WTS-8 kit CCK-8 (Sigma) với tế bào sống 25 Hình Quy trình chế tạo phức hệ .28 Hình Ảnh phức hệ kính hiển vi điện tử (A) SEM, (B) TEM 29 Hình 10 Phân bố kich thước phức hệ theo mật độ (A), thể tích (B) số lượng (C) 30 Hình 11 Kết đo khối phổ hồng ngoại hấp thụ (FTIR) mẫu: Đối chứng Agarose (A); Đối chứng Curdlan (B); Mẫu phức hệ ACE (C) 32 Hình 12 Hàm lượng entanercept giải phóng khỏi phức hệ theo thời gian 34 Hình 13 Khả phân tán phức hệ nano gel dung dịch PBS pH 7.4 nồng độ khác .35 Hình 14 Biểu Dectin-1 dòng tế bào STO RAW264.7 36 Hình 15 Ảnh hưởng phức hệ lên khả sinh trưởng tế bào .38 Hình 16 Tác dụng hướng đích phức hệ ACE dòng tế bào biểu Dectin1 (RAW) khơng biểu Dectin-01 (STO); *P