Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ và nhiệt độ tới khả năng tạo màng biocellulose, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== KIỀU THỊ MAI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON, NITƠ VÀ NHIỆT ĐỘ TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE, ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hà Nội, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== KIỀU THỊ MAI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON, NITƠ VÀ NHIỆT ĐỘ TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE, ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Người hướng dẫn khoa học PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG Hà Nội, 2019 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất, chân thành tất lòng đến PGS TS inh Thị Kim Nhung suốt thời gian vừa qua hướng dẫn giúp đỡ em hồn thiện khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn lời cảm ơn tới tồn thể thầy tổ vi sinh vật thuộc khoa Sinh – KTNN, trường ại học Sư phạm Hà Nội hướng dẫn khuyến khích em suốt khoảng thời gian học tập vừa qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn cảm ơn đến Ban giám hiệu trường ại học Sự phạm Hà Nội Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN giúp đỡ tạo điều kiện em hồn thành tốt đề tài nghiên cứu Lời cảm ơn cuối em xin gửi tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm giúp đỡ em khoảng thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! N n t n 05 n m 2019 Sinh viên Kiều Thị Mai LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan toàn nội dung khóa luận q trình tìm hiểu lâu dài tồn thật ây thành nghiên cứu nỗ lực riêng thân em thời gian qua Tất số liệu khóa luận thu thập từ thực nghiệm qua xử lý thống kê, khơng có số liệu chép hay bịa đặt không trùng với kết công bố Nếu có sai sót em xin hồn tồn nhận trách nhiệm N n t n 05 n m 2019 Sinh viên Kiều Thị Mai MỤC LỤC MỞ ẦU1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn óng góp đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhu cầu dinh dưỡng nhiệt độ vi sinh vật có khả lên men tạo màng Biocellulose 1.1.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 1.1.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 1.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 1.2 Cấu trúc tính chất màng Biocellulose 1.2.1.Cấu trúc màng Biocellulose 1.2.2 Một số tính chất màng Biocellulose Qúa trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.4 Chức cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter Túi bảo quản thực phẩm 1.3 Lịch sử nghiên cứu vấn đề Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam 10 Chương ỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 ối tượng nghiên cứu hóa chất 12 211 ối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 12 2.1.3 Hóa chất 12 Các loại môi trường 13 Môi trường giữ giống (MT1) 13 Môi trường nhân giống (MT2) 13 Môi trường lên men (MT3) 13 2.2 Phạm vị nghiên cứu, địa điểm thời gian 14 Phương pháp nghiên cứu 14 Phương pháp vi sinh 14 1 Phân lập tuyển chọn chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski Beijerinck) 14 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái cách xếp tế bào tiêu nhuộm kép 15 3 Phương pháp bảo quản chủng giống môi trường thạch nghiêng 15 Phương pháp hóa sinh 16 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase 16 2 Xác định khả oxy hóa acid acetic 16 3 Xác định khả tổng hợp cellulose 17 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon, nitơ nhiệt độ đến khả tạo màng Biocellulose 17 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon 17 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ 17 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ 18 Phương pháp xác định trọng lượng tươi màng Biocellulose 18 Phương pháp sấy khơ đóng thành bao bì đựng thực phẩm 18 Phương pháp thống kê xử lý kết 18 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả tạo màng Biocellulose 20 1 Phân lập Gluconacetobacter có khả sinh màng Biocellulose 20 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo màng Biocellulose dai, mỏng 21 3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng chủng G.xylinus T1 24 3.2 Ảnh hưởng cacbon tới khả tạo màng Biocellulose chủng G.xylinus T1 25 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ tới khả lên men tạo màng Biocellulose chủng G.xylinus T1 30 3.3.1 Ảnh hưởng nitơ hữu 30 3.3.2 Ảnh huởng nitơ vô 32 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả lên men tạo màng Biocellulose chủng G.xylinus T1 34 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose ứng dụng bảo quản thực phẩm 36 3.5.1 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose 36 3.5.2 Ứng dụng bảo quản thực phẩm 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Quá trình hình thành cellulose tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter Hình 2 Con đường chuyển hốc cacbon vi khuẩn Gluconacetobacter Hình Khuẩn lạc vi khuẩn mẫu phân lập 20 Hình Vòng phân giải CaCO3 21 Hình 3 Màng Biocellulose sinh từ vi khuẩn Gluconacetobacter 23 Hình Lên men tạo màng MT3 có thay đổi hàm lượng cacbon 28 Hình Lên men tạo màng MT3 có hàm lượng glucose 10g/l 29 Hình Lên men tạo màng MT3 có hàm lượng pepton 5g/l 31 Hình Lên men tạo màng MT3 có thay đổi hàm lượng (NH4)2SO4 32 Hình Lên men tạo màng MT3 có hàm lượng (NH4)2SO4) 3g/l 33 Hình Màng nuôi cấy nhiệt độ 30C 35 Hình 10 Màng Biocellulose sau ngày lên men 37 Hình 11 Cà chua bọc màng Biocellulose 39 Hình 12 Cà chua bị hỏng sau ngày 39 Hình 13 Cà chua bọc túi nilông bị hỏng sau 12 ngày 39 Hình 14 Cà chua bọc màng Biocellulose hỏng sau 23 ngày 39 Hình 15 Bảo quản dưa chuột 39 Hình 16 Dưa chuột bị hỏng sau ngày 39 Hình 17 Mận bảo quản thường, túi nilông băng màng Biocellulose 40 Hình 18 Mận bảo quản sau 10 ngày 40 Hình 19 Thịt bảo quản thường, túi nilông băng màng Biocellulose 40 Hình 20 Thịt bọc nilon hỏng sau ngày 40 Hình 21 Thịt bọc màng Biocellulose hỏng sau ngày 40 ìn 3.13 C c ua bọc tú n lơn bị hỏn sau 12 n ìn 3.14 C c ua bọc m n Biocellulose hỏn sau 23 n ìn 3.15 Bảo quản dưa chu t ìn 3.16 Dưa c u t bị hỏng sau n ìn 3.17 Mận bảo quản t ườn tú n lơn v ìn 3.18 Mận bảo quản sau 10 n m n B ocellulose ìn 3.19 Thịt bảo quản t ườn tú n lôn v b n m n B ocellulose Thịt bảo quản màng sau 10 ngày ìn 3.20 T ịt bọc nilon hỏng sau n Thịt bảo quản màng sau 15 ngày ìn 3.21 T ịt bọc tron m n B ocellulose ỏng sau 7n Qua kết nghiên cứu nhận thấy: Các loại thông thường chín để ngồi mơi trường tự nhiên dễ bị hỏng bị loại vi khuẩn xâm nhập nước nên thời gian bảo quản ngắn từ - 10 ngày bị hỏng, thời gian tùy thuộc vào loại Còn loại thực phẩm tươi sống để ngồi mơi trường tự nhiên dễ bị hỏng xâm nhập loại vi khuẩn, thời gian bảo quản thông thường - ngày Các loại bảo quản túi nilon có thời gian bảo quản lâu có ngăn cản xâm nhập vi khuẩn từ bên môi trường vào Tuy nhiên thời gian bảo quản kéo dài từ - 18 ngày tùy thuộc vào loại khác Thời gian bảo quản túi nilông thường kéo dài so với không bảo quản từ - ngày Thịt bảo quản nilơng thời gian tồn ngắn từ - ngày Khi bảo quản màng Biocellulose khơng kéo dài thời gian bảo quản mà thực phẩm giữ đặc tính ban đầu, khơng hỏng, giúp tươi lâu, bị biến đổi độ cứng, hương vị Các loại bảo quản từ - 23 ngày tùy thuộc vào loại quả, thịt bảo quản giữ từ - ngày Bảo quản màng Biocellulose so với bảo quản nilông không bảo quản có thời gian bảo quản dài nhiều chí tăng gấp đơi thời gian bảo quản Dựa vào kết thực nghiệm chúng tơi thấy màng Biocellulose sau sử lý có tác dụng bảo quản thực phẩm tốt Vì màng Biocellulose dùng để thay túi nilơng bảo quản thực phẩm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập chủng vi khuẩn giấm từ môi trường dịch Kombucha lên men từ nước chè, từ chủng tuyển chọn chủng G.xylinus T1 có khả sinh màng Biocellulose có khả hình thành màng mỏng, dai bền 1.2 Tìm nguồn cacbon, nitơ nhiệt độ thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G.xylinus T1 có đặc tính mỏng, dai bền là: đường glucose với hàm lượng 10 - 12 (g/l); nitơ vô (NH4)2SO4 với hàm lượng từ (g/l), nguồn nitơ hữu pepton với hàm lượng (g/l) nhiệt độ 30C 1.3 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose gồm bước tạo màng Biocellulose có đặc tính mỏng, dẻo, dai bền từ chủng G.xylinus T1 Kiến nghị Do thời gian có hạn nên nghiên cứu ảnh hưởng tất yếu tố mơi trường tới q trình hình thành màng Biocellulose chủng vi khuẩn G.xylinus T1 ể màng Biocellulose có chất lượng tốt, mang lại hiệu kinh tế cao, mặt khoa học thẩm mĩ, xin đề nghị số ý kiến sau: - Tiến hành thí nghiệm quy mơ lớn hơn, lặp lại thí nghiệm nhiều lần để kiểm chứng kết thu - Tiến hành nghiên cứu để tìm kiếm nguồn ngun liệu có giá thành thấp khác để phục vụ cho việc sản xuất màng Biocellulose quy mơ cơng nghiệp (nước mía, nước chiết bã men bia, rỉ đường) - Tiến hành nghiên cứu để sản xuất màng Biocellulose quy mô công nghiệp để sản xuất túi nilon có khả tự phân hủy để bảo vệ môi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO T l ệu tiếng việt [1] Tạ Thị Mai Anh, Nguyễn Thị Lan, Vũ Văn Khoan, Văn Kiên, Nguyễn Thị Thùy Vân, inh Thị Kim Nhung (2010) Nghiên cứu phương pháp xử lý màng BC ứng dụng điều trị bỏng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 Kỷ yếu Hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học Các trường ĐHSP toàn quốc lần thứ V, năm 2010 Đại học Đồng Tháp, Bộ Giáo dục Đào tạo [2] Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội [3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn ình Quyến, Phạm Văn Ty (2009) Vi sinh vật học Nxb Giáo dục [4] Nguyễn Thành ạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 [5] Vũ Thị Minh ức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb ĐHQG Hà Nội, tr 1-50 [6] Trương Thị Ngọc Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương (2005) a dạng hóa mơi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum Số 2, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp [7] Nguyễn Thúy Hương (2006) Chọn lọc dòng A xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mơ lớn Số 3, Tạp chí di truyền ứng dụng [8] Nguyễn Thúy Hương – Trần Thị Tưởng An, “Thu nhận Bacteriocin phương pháp lên men tế bào Lactococus lactic cố định chất mang BC ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Science Technology Development, Vol 11, No 09, (2008), tr.100 – 109 [9] ặng thị Hồng ( 2007), phân lập , tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Actobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ HSP Hà Nội [10] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006) Nguyên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn Actobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí dược học, số 5, năm 2006 [11] Nguyễn ức Lượng (2000), Công nghệ Vi sinh vật tập 1-2-3, Nhà Xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM [12] inh Thị Kim Nhung (2012), Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng, Đề tài trọng điểm cấp Bộ (2010-2012) [13] inh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011) Nghiên cứu vi khuẩn Acetorbacter xylinum sinh tổng hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng Tạp chí y học thảm họa & bỏng Viện bỏng Quốc Gia, Hội bỏng Việt Nam, trang 122 - 127 [14] Nguyễn Thị Nguyệt, Nghiên cứu vi khuẩn Actobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận văn Thạc sỹ sinh học HSP Hà Nội, 2008 [15] Lương ức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông nghiệp [16] Trần Linh Thước (2006) Phương pháp phân tích vi sinh vật Nxb Giáo dục [17] Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng Bacterial cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội T l ệu nước n o [18] Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emilia Klemenska, Aleksander Masny, Anderzej Plucienniczak (2005), Molecurlar basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum, Acta biochimica polonica, Vol 52, pp 691-698 [19] Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley vch pp 31-85 [20] Brown R.M (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl Chem 71 (5), p.765-775 [21] Neelobon S , Jiraporn B, Suwanncee T , (2007) “Effect of culture conditions on bacterial cellulosee (BC) production from Acetobacter xylinum TISTR976 and physical properties of BC parchment paper”, Vol 14, N o 4, Suranaree J.Sci Technol, 2007, p 357- 365 [22] Yoshinaga, T T (1997) ’’Prodution of Bacterial cellulose by agoation culture systems’’, Pure and application chemistry 69: 2453-2458 [23] Schramm M., Hestrin S (1954) “Factor affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum”, J.gen Microbiol, Vol 11, pp 123-129 [24] Jay shah, Brown M R (2005), Toward electronic paper displays made from microbial cellulose Vol 66, Apply microbiol Biotechnol, 2005, p 352-355 [25] Wojciech K Czaja, David J Young, Marek Kawecki, Malcolm Brown R, Jr (2007), The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications Vol.8, No.1 Biomacromolecules, 2007, p.1-12 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đ n t s n trưởng chủng G xylinus T1 Bảng 3.6 Số lượng tế b o tạ c c t đ ểm chủng vi khuẩn G x l nus T1 (× Chủng tế b o/ml) Thời gian nuôi cấy (h) G xylinus T1 12 24 36 48 60 72 84 96 Số lượng tế bào (× bào/ml) 2,02 12,7 35,8 55,6 120,8 132,5 126,7 121,3 118,5 tế 0,02 0,03 0,05 0,04 0,03 0,04 0,02 0,02 0,03 Phụ lục 2: Ảnh hưởng hàm lượng cacbon, nitơ nhiệt độ đến khả tạo màng biocellulose chủng G.xylinus T1 Bảng 3.7 Ản ưởng m lượn lucose đến khả n n tạo m n B ocellulose chủng G.xylinus T1 STT Hàm lượng Glucose (g/l) ặc điểm màng Biocellulose ̅± m Màng mỏng, dễ bị rách 22,7 ± 0,01 Màng mỏng, dễ bị rách 27,2 ± 0,02 Màng mỏng, độ dai 32,2 ± 0,05 Màng mỏng, độ dai 40,9 ± 0,04 10 Màng mỏng, dai nhẵn 52,87 ± 0,03 12 Màng mỏng, dai nhẵn 55,21 ± 0,03 16 Màng dày, dai 59,3 ± 0,03 20 Màng dày, dai, không nhẵn 62,2 ± 0,02 Bảng 3.8 Ản ưởng m lượn Pepton đến khả n n tạo m n B ocellulose chủng G.xylinus T1 ̅± m STT Hàm lượng Pepton (g/l) Không hình thành màng 3,49  0,1 Màng mỏng, dễ bị rách 3,64  0,03 Màng mỏng, dộ dai 5,68  0,05 Màng mỏng, dai nhẵn 6,17  0,2 Màng dày, dai nhẵn 6,43  0,01 Màng mỏng, dai nhẵn 7,39  0,22 Màng mỏng, dộ dai 5,64  0,02 Màng mỏng, dễ bị rách 4,06  0,03 Bảng 3.9 Ản STT ặc điểm màng Biocellulose ưởng nồn đ (NH4)2SO4 đến ìn t Biocellulose chủng G.xylinus T1 Hàm lượng ặc điểm màng Biocellulose n m n ̅± m (NH4)2SO4 (g/l) Màng mỏng, dễ rách 2,01 ± 0,12 Màng mỏng, dễ rách 3,12 ± 0,2 Màng mỏng, dai, mềm 5,98 ± 0,02 Màng mỏng, dai, 7,59 ± 0,01 Màng mỏng, dai 5,96 ± 0,02 Màng mỏng, dai, mềm 4,55 ± 0,05 Màng mỏng, dễ rách 2,28 ± 0,04 Bảng 3.10 Ản ưởng nhiệt đ tới khả n n ìn t n m n B ocellulose chủng G.xylinus T1 STT Nhiệt độ (C) ặc điểm màng 15 Màng khơng hình thành - - 20 Xuất sợi cellulose màng lơ lửng dung dịch - - 25 Màng mỏng 1-3mm, dai bề mặt nhẵn 2.87  0.01 0.03 30 Màng mỏng từ 3-4mm, dai, bề mặt nhẵn 3.03  0.02 0.04 35 Màng mỏng khoảng 2mm, bề mặt nhẵn 3.00  0.03 0.05 40 Màng Biocellulose khơng hình thành - - 45 Màng Biocellulose khơng hình thành - - m (%) ... KHOA SINH – KTNN ====== KIỀU THỊ MAI NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CACBON, NITƠ VÀ NHIỆT ĐỘ TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE, ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẦM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC... 3.3.2 Ảnh huởng nitơ vô 32 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả lên men tạo màng Biocellulose chủng G.xylinus T1 34 Xây dựng quy trình tạo màng Biocellulose ứng dụng bảo quản thực phẩm. .. pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon 17 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ 17 3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ 18 Phương pháp xác định trọng lượng tươi màng Biocellulose