Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây phúc bồn tử (rubus idaeus) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY PHÚC BỒN TỬ RUBUS IDAEUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO KHÓ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN

GIỐNG CÂY PHÚC BỒN TỬ (RUBUS IDAEUS) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN

GIỐNG CÂY PHÚC BỒN TỬ (RUBUS IDAEUS) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn: TS VÕ CHÂU TUẤN

Đà Nẵng - Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thị Nhung

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh – Môi trường,trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức lýthuyết cũng như thực hành thí nghiệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn, người thầy đã tận tìnhhướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa, các bạn, nhóm nghiêncứu đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm, động viên tôi trong suốt quá trình làm khóa luận.Tôi xin chân thành cảm ơn !

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Nhung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu một số phương pháp nhân giống ở thực vật 3

1.2 Giới thiệu về phương pháp nhân giống in vitro 4

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến đến quá trình nhân giống in vitro 4

1.2.1.1 Mẫu nuôi cấy 4

1.2.1.2 Vô trùng trong nuôi cấy 5

1.2.1.3 Môi trường nuôi cấy 6

1.2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 10

1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 10

1.2.2.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy 10

1.2.2.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy mô 10

1.2.2.3 Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh 11

1.2.2.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh 11

1.2.2.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất 11

1.2.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro trên cây ăn quả, cây thuốc 11

1.3 Giới thiệu về cây phúc bồn tử 12

1.3.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại 12

1.3.1.1 Nguồn gốc, phân bố 12

1.3.1.2 Vị trí phân loại 13

1.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái 13

1.3.3 Công dụng và giá trị sử dụng 14

1.3.4 Các nghiên cứu liên quan 16

1.3.4.1 Nghiên cứu ngoài nước 16

1.3.4.2 Nghiên cứu trong nước 17

1.3.5 Tình hình phát triển phúc bồn tử tại Việt Nam 17

1.3.5.1 Tình hình trồng phúc bồn tử tại Lâm Đồng - Việt Nam 17

1.3.5.2 Phương pháp nhân giống 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp vô trùng mẫu vật 20

2.3.2 Phương pháp tái sinh chồi in vitro 20

2.3.3 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 20

2.3.4 Phương pháp tái sinh rễ 21

2.3.5 Phương pháp đưa cây ra trồng tại vườn ươm 21

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Đánh giá hiệu quả khử trùng mẫu vật cây phúc bồn tử 22

3.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trường đến khả năng nhân nhanh chồì in vitro phúc bồn tử 24

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây phúc bồn tử 24 3.2.2 Ảnh hưởng của Kin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây phúc bồn tử 26 3.2.3 Ảnh hưởng của BAP và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây phúc bồn tử 27

3.2.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây phúc bồn tử 28

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh rễ in vitro cây phúc bôn tử .29

3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả năng tái sinh rễ in vitro cây phúc bồn tử 29

3.3.2 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tái sinh rễ in vitro cây phúc bồn tử 30

3.4 Kết quả khảo sát các điều phù hợp cho giai đoạn vườn ươm của cây con in vitro phúc bồn tử 31

3.4.1 Kết quả khảo sát giá thể tối ưu 31

đoạn vườn ươm 33

3.4.3 Đánh giá khả năng phát triển của cây trong giai đoạn vườn ươm 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

1 Kết luận 36

2 Đề nghị 36

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC

: Active carbon (than hoạt tính)

: 6 - benzyl amino purine: Coconut water (nước dừa): Cộng sự

: Điều hòa sinh trưởng

: β-indol-acetic acid

: Indole 3 - butyric acid

: Kinetin

: Murashige và Skoog (1962)NAA : α-naphthalen acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nồng độ và thời gian khử trùng của một số tác nhân vô trùng 5

Bảng 3.1: Hiệu quả khử trùng hạt phúc bồn tử 22Bảng 3.2: Hiệu quả khử trùng đoạn thân có mắt lá cây phúc bồn tử 23Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP trong nhân nhanh chồi in vitro cây phúc bồn tử sau 4

tuân nuôi cấy 24Bảng 3.4: Ảnh hưởng của Kin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây phúc bồn tử

sau 4 tuần nuôi cấy 26Bảng 3.5: Hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro phúc bồn tử khi kết hợp BAP và IBA ở

các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy 27

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro phúc bồn tử trên

môi trường MS bổ sung 0,75mg/l BAP và 0,2mg/l IBA sau 4 tuần nuôi cấy

28Bảng 3.7: Kết quả đánh giá ảnh hưởng hàm lượng khoáng đến khả năng ra rễ cây phúc

bồn tử sau 20 ngày khảo sát 30Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA đến khả năng tái sinh rễ cây phúc bồn

tử sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường ¼ MS 31Bảng 3.9: Khảo sát giá thể tối ưu trồng phúc bồn tử sau 15 ngày ươm trồng 32

Bảng 3.10: Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của cây phúc bồn tử trong điều

kiện nhà lưới 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cây phúc bồn tử ngoài tự nhiên 19Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu 20Hình 3.1: Hạt cây phúc bồn tử được nuôi trên môi trường MS không chất kích thích

không có hiện tượng tái sinh chồi 22Hình 3.2: Chồi phúc bồn tử tái sinh trên môi trường MS không chất kích thích sinh

trưởng sau 1 tháng nuôi cấy 24Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi cây phúc bồn tử sau 4

tuần nuôi cấy 25Hình 3.4: Ảnh hưởng của Kin đến khả năng tái sinh chồi cây phúc bồn tử sau 4 tuần

nuôi cấy 27Hình 3.5: Hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro phúc bồn tử khi kết hợp BA và IBA sau 4

tuần nuôi cấy 28Hình 3.6: Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro phúc bồn

tử sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,75mg/l BAP + 0,2 mg/lIBA kết hợp nước dừa ở các nồng độ khác nhau. 29Hình 3.7: Rễ cây phúc bồn tử phát triển trên môi trường 1/4MS không chất kích thích

sinh trưởng sau 20 ngày nuôi cấy 30Hình 3.8: Phúc bồn tử được ươm trồng trên các loại giá thể khác nhau 32Hình 3.9: Cây phúc bồn tử phát triển trên giá thể CT4 (trái) và trên CT1 (phải) sau

30 ngày 33Hình 3.10: Phúc bồn tử ra rễ sau 15 ngày (A) và 20 ngày (B) 34Hình 3.11: Cây phúc bồn tử 15 ngày ra rễ thích nghi và sinh trưởng sau 15 tháng

ươm trồng 34Hình 3.12: Cây phúc bồn tử phát triển trong điều kiện vườn ươm tại Đà Nẵng 35Hình 3.13: Một số cây Phúc bồn tử có hiện tượng phát sinh chồi từ gốc sau 2 tháng

sinh trưởng 35

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện nay nhu cầu về cây ăn quả, cây dược liệu ngày một tăng Người tiêu dùnghướng đến các dòng sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, tốt cho sức khỏe Tuy nhiên,tại Việt Nam vẫn chưa nhiều các sản phẩm đáp ứng được thị hiếu và mong muốn chongười tiêu dùng Nhiều loại quả vẫn phải nhập ngoại, giá thành đắt đỏ, do nước ta chưachủ động về nguồn giống hoặc diện tích canh tác quá ít, phụ thuộc vào một số cơ sởsản xuất trong khi nhu cầu thị trường lại quá cao Việc nghiên cứu, chủ động nguồngiống và mở rộng sản xuất một số loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao là điều cần thiết

để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước, giảm giá thành sản phẩm và hướng đến việcxuất khẩu ra nước ngoài

Phúc bồn tử còn gọi là quả mâm xôi, là một loại quả cao cấp, được sử dụng ởnhiều nước trên thế giới, nhất là ở châu Âu và châu Mỹ Phúc bồn tử được trồng tậptrung nhiều nhất ở Bắc và Nam Mỹ Quả phúc bồn tử được sử dụng như một loại quả

ăn tươi, nó còn được dùng trong công nghiệp thực phẩm chế biến hương liệu, làm sirô,chế biến nước giải khát, nước cốt, sản xuất rượu vang, các loại mứt là mặt hàng xuấtkhẩu có giá trị cao Ngoài ra, phúc bồn tử còn được sử dụng nhiều trong y học, kết quảnghiên cứu của các nhà khoa học ở Mỹ và Nhật Bản cho rằng isothiocyanates trongphúc bồn tử ngoài tác dụng diệt khuẩn còn có khả năng điều hòa tiêu hóa, ngăn ngừaviệc tắc nghẽn mạch máu, giảm huyết áp, chống hen suyễn, ung thư và sâu răng [24].Tại Việt Nam, phúc bồn tử cũng đã được Trung tâm ứng dụng Khoa học côngnghệ & Tin học nghiên cứu và đưa vào trồng tại Lâm Đồng Các giống này có nguồngốc từ Mỹ, Thụy Điển, New Zealand được du nhập từ những năm 1990 Một số mọcdại và được người dân thuần hóa mang về trong tại địa phương nhưng diện tích trồngkhông nhiều Trong khi nền nông nghiệp Việt Nam còn chưa phát triển cao, vẫn chưa

có nhiều sản phẩm nổi bậc và xuất khẩu ra nước ngoài, chưa kể phúc bồn tử tại ViệtNam còn được xem như vua của những loại quả, giá thành khá đắt đỏ, khoảng hai trămnghìn đồng 1kg Như vậy, việc đưa cây phúc bồn tử, rộng rãi tại Việt Nam là điều hếtsức cần thiết, góp phần làm phong phú thêm mặt hàng nông phẩm có giá trị

Cây phúc bồn tử phát triển tốt ở nhiệt độ 6-27oC, nơi có nhiều ánh sáng [23].Trong khi đó, Đà Nẵng thuộc nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, ít biến động Nhiệt

độ trung bình các tháng trong năm dao động từ 21,3 đến 29,2oC, độ ẩm không khítrung bình khoảng 80%, nhiều nắng, phù hợp với điều kiện phát triển của cây phúc bồn

tử [12] Trong khi đó, nền nông nghiệp tại Đà Nẵng vẫn chưa được chú trọng pháttriển, chủ yếu là trồng lúa và rau màu, chưa có loại cây nào mang giá trị kinh tế cao.Mặt khác, Đà Nẵng hiện nay đã và đang chú trọng phát triển công nghệ sinh học, đây

là cơ hội tốt để đưa cây nuôi cấy mô có giá trị kinh tế cao trồng tại Đà Nẵng, hoặc đưađến những vùng lân cận có khí hậu tương tự như Quảng Nam – vốn rất nhiều đất nôngnghiệp Từ đó tạo một điểm nhấn cho nền nông nghiệp miền trung Chủ động về nguồngiống sẽ là yếu tố quan trọng đầu tiên cần được thực hiện để đưa Phúc bồn tử trồng đạitrà tại miền Trung

Dựa trên những cơ sở đó, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình

nhân giống cây phúc bồn tử (Rubus idaeus) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.”

- Xác định điều kiện khử trùng mẫu thích hợp từ hạt và đoạn thân

- Xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp cho nhân chồi và tạo rễ in vitro

- Xác định tuổi cây, thời gian huấn luyện cây in vitro, giá thể , chế độ tưới và chế

độ chắn sáng cho cây in vitro sinh trưởng trong điều kiện nhà lưới

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhân giống

in vitro cây phúc bồn tử, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôicấy trên chi Rubus

3.2.Ý nghĩa thực tiễn

- Xây dựng được quy trình nhân giống cây phúc bồn tử bằng kĩ thuật nuôi cấy

mô tế bào, góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, khắc phục đượcnhững hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống

- Tạo nguồn giống cho các nghiên cứu trong quy trình sản xuất tiếp theo, ứngdụng vào sản xuất tại Đà Nẵng, góp phần đưa cây phúc bồn tử - cây ăn quả giá trị cao

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu một số phương pháp nhân giống ở thực vật

- Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt: Đây là hình thức nhân giống khá khổbiến, dễ thực hiện, giá thành sản xuất thấp Tuy nhiên, cây giống gieo từ hạt dễ phát sinhbiến dị do thụ phấn chéo, khó giữ được đặc tính, năng suất ban đầu Với phương

pháp này, trên quy mô sản xuất, chỉ nên áp dụng đối với những đối tượng có khả nănghạt nảy mầm cao, đồng đều Quy trình sản xuất hạt giống cần đảm bảo tạo ra nguồn hạtgiống đảm bảo tính xác thực về di truyền, hình thái và chất lượng với nguồn gen vậtliệu nhân giống khi được cung cấp cho sản xuất gieo trồng ở thế hệ tiếp theo [16]

- Giâm cành: là một trong những phương pháp nhân giống vô tính, được sử dụngkhá rộng rãi tỏng nghề trồng trọt, nhất là trong sản xuất cây ăn quả, cây công nghiệp , và

cả cây cảnh Ưu điểm cơ bản là giữ được hầu hết các đặc điểm của cây giống (cây mẹ),tức là cây mới được tạo ra không bị phân ly, biến dị Đây là đặc tính rất quý trong việcchọn tạo giống mới Tuy nhiên số lượng cây giống tạo ra không nhiều

- Chiết cành là phương pháp nhân giống vô tính cây trồng bằng cách cho mộtcành hay một đoạn cành ra rễ trên cây, sau đó tách khỏi cây mẹ, đem trồng thành cây mới

- Ghép cây là tách rời một mắt ghép, một chồi non vừa lú ra ở nách lá hoặc mộtđoạn thân non của cây có những đặc tính nổi bật đặt vào một cây khác có đặc tính sốngkhoẻ và phát triển tốt, còn gọi là gốc ghép (gốc tháp) tiếp tục sống và tăng trưởng nhờvào gốc ghép Cây ghép giữ được các đặc tính của giống muốn nhân Tuy nhiên, lấy mắtghép liên tục nhiều đời của một giống để ghép có thể dẫn đến hiện tượng thoái

hóa giống

- Nhân giống in vitro: Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật

được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện

vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định.Mặc dù chi phí đầu tư ban đầu cao, nhưng mang lại hiểu quả rất lơn cho sản xuất Tạo rachính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lượng cao hoặc có nhữngtính trạng mong muốn khác Tạo ra các cây trưởng thành một cách nhanh

chóng, tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để tạo

hạt, tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã được biến đổi gen Tạo ra các câytrong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối đa khả năng phát tánbệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không

có nuôi cấy mô thì thường có tỷ lệ nảy mầm thấp hoặc sinh trưởng yếu, ví dụ: hoa lanhoặc cây nắp ấm, làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lâynhiễm khác và nhân nhanh các cây này như là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồngruộng và nông nghiệp [4], [8]

1.2 Giới thiệu về phương pháp nhân giống in vitro

Kỹ thuật nuôi cấy mô tê bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô

tả nuôi cấy mô các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm chứmôi trường chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng [2]

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ mô

lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người ta dùng phương pháp này

để nghiên cứu đặc tính cơ bản của tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiện nay cácnhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu các vấn đề liênquan thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vôtính đối với các loại cây quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đờisống hằng ngày của con người [2]

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến đến quá trình nhân giống in vitro

1.2.1.1 Mẫu nuôi cấy

Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: mô phânsinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non…, khi đặt vào môitrường có chứa một lượng hormon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên,mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành,lá… rất khác nhau Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưavào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai tròquyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu đượcnhững cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở một giaiđoạn nhất định Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vôtính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi bên và mô phân sinh đỉnh [4]

1.2.1.2 Vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thíchhợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vikhuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vàibào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trườngnuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiệnnày mô cấy không thể phát triển và chết dần Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kếtthúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rấtcao mới có hi vọng thành công Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôicấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:

- Vô trùng mô cấy

- Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy

- Trong thao tác nuôi cấy cần phải tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy

Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc vớimôi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm Phươngpháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệtnấm, khuẩn Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý,nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy Các chất kháng sinh ítđược sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hưởng xấu lên sự sinh trưởng của môcấy Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween

80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn Street (1974), đưa ra khái niệm vềnồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [9]:

Bảng 1.1 Nồng độ và thời gian khử trùng của một số tác nhân vô trùng Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

Hypochloride Canxi 9-10% 5-30 Rất tốtHypochlotide Natri 2-10% 5-30 Rất tốt

HgCl2 0,1-1% 2-10 Trung bìnhChất kháng sinh 4-50mg/l 30-60 Khá tốt

1.2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của mô tế bào,

là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết nhằm duy trì sự sống, sinh trưởng vàphát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phụthuộc vào từng loài thực vật được nuôi cấy Thành phần của môi trường nuôi cấy môgồm:

- Các chất vô cơ:

Các chất dinh dưỡng vô cơ là các nguyên tố khoáng được cung cấp dưới dạng đalượng và vi lượng Sự sinh trưởng của thực vật trong nuôi cấy in vitro yêu cầu cần phải

có cả các nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng kết hợp với nhau

Các nguyên tố đa lượng được sử dụng ở nồng độ lớn hơn 5 mM/L Bao gồm cácnguyên tố sau: nitrogen (N), potassium (K), phosphorus(P), calcium (Ca), magnesium(Mg) và sulphur (S) ở dạng muối khoáng trong môi trường nitrogen (N) thường đượccung cấp dưới dạng ammonium (NH4+) và nitrate (NO3-) Môi trường nuôi cấy chứa

ít nhất 25 mM/L nitrogen (N) và potassium (K), các nguyên tố khác khoảng 1-3 mM/L[8], [17]

Các nguyên tố vi lượng được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 0,05 mM/l Bao gồmcác nguyên tố: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu) vàmolybdenum (Mo) Các nguyên tố khoáng này mặc dù với nồng độ nhỏ nhưng cầnthiết cho sự sinh trưởng ở thực vật Nguyên tố quan trọng nhất là Fe, Fe chỉ có hiệuquả ở pH thấp, chính vì vậy nó được cung cấp ở dạng FDTA – Fe phức tạp để có hiệuquả ở pH khác nhau ở dạng này không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theonhu cầu của mô thực vật [8]

dụng cho sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô, fructose nếu hấp môi trường sẽ gâyđộc hại cho cây [8], [17].

- Các chất hữu cơ:

+ Vitamin

Là những chất hữu cơ cần thiết cho quá trình trao đổi chất, là thành phần của cácenzim, do đó, muốn cây phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy cần bổ sung các vitamin.Thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6), acid pantothenic (B5) là cácvitamin thường được sử dụng Trong đó B1 bổ sung vào môi trường để tham gia vàoquá trình chuyển hóa carbohydrate [5], [17]

+ Axit amin

Bổ sung axit amin vào môi trường nuôi cấy là rất quan trọng, để kích thích tăngtrưởng trong tế bào, cũng như kích thích và duy trì các phôi soma Lglutamine, L-asparagine, L-cystein, L-glycine là các axit amin thường được sử dụng để bổ sung vàomôi trường nuôi cấy ở dạng hỗn hợp, nếu riêng lẻ thì sẽ ức chế sự tăng trưởng của tếbào [5]

+ Chất hữu cơ phức tạp

Là nhóm các chất hữu cơ bổ sung có thành phần không xác định như proteinhydrolysate, nước dừa, dịch nấm men, nước cam, nước ép cà chua, casein thủy phân,casein thủy phân đã đem lại hiệu quả đáng kể trong nuôi cấy mô, chiết xuất khoai tâycũng đã đem lại hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn [3] Công bố đầu tiên về việc sửdụng nước dừa trong nuôi cấy mô được nhà khoa học Overbeek tìm ra [37] Sau đó tácdụng tích cực của nước dừa đã được nhiều nhà khoa học khác chứng nhận Chất cóhoạt tính trong nước dừa được chứng minh là myo-inositol và một số các acid aminkhác, nước dừa là hợp chất tự nhiên chứa nhiều chất khoáng, vitamin, hợp chất kíchthích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin có tác dụng kích thích hình thành chồi Đây làthành phần không thể thiếu trong quá trình tạo chồi và cụm chồi từ mô sẹo Nước dừathường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Thông thường nướcdừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khửtrùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnhhưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dungdịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏphần cặn Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kíchthích phân hóa và nhân nhanh chồi [18]

- Than hoạt tính (AC)

Than hoạt tính vừa ức chế vừa thúc đẩy sự tăng trưởng phụ thuộc vào từng loàithực vật được nuôi cấy, nó kích thích sự tăng trưởng ở phong lan, cà chua, cà rốt, ứcchế sự tăng trưởng ở đậu tương, thuốc lá [4]

Nó hấp thụ các hợp chất độc cho cây như phenol, làm giảm tác hại của chất độcđối với cây, giúp cây sinh trưởng tốt hơn, hạn chế sự tác động của chất độc Than hoạttính còn có khả năng thay đổi pH của môi trường [4], [5]

Ngoài ra than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các chất điều hòa sinh trưởng,vitamin gây ra sự ức chế tăng trưởng Than hoạt tính còn có thể tạo độ tối cho môitrường và như vậy sẽ giúp tạo rễ và tăng trưởng

- Các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) ở thực vật

Bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng,phát triển và phân hóa cơ quan Các chất này kích thích sự phân chia tế bào, do đó điềuchỉnh sự phát triển của các chồi và rễ trên cây và phôi trong môi trường nửa rắn hoặclỏng Bốn chất điều hòa sinh trưởng chính được sử dụng là: auxin, cytokinin, giberelin

và axit abscissic, các chất này được bổ sung trong môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, yêucầu các chất này thay đổi theo từng loài thực vật, loại mô, hàm lượng các chất điều hòasinh trưởng nội sinh trong cây

+ Auxin: phân chia tế bào, kéo dài tế bào, hình thành rễ, phát sinh phôi soma Khiđược sử dụng ở nồng độ thấp, auxin kích thích tạo rễ, ở nồng độ cao sẽ hình thành môsẹo Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: 1-naphthaleneacetic acid(NAA), 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), indole-3 acetic acid (IAA),indolebutyric acid (IBA) Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axeticaxit (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sựhình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là naphtyl axetic axit (NAA) và2,4 - diclophenoxy axit (2,4 D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sựphân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ NAA được Went và Thimann(1937) phát hiện Chất này có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tănghoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận

và sử dụng đường trong môi trường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơnauxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [5]

+ Cytokinin: kích thích tổng hợp ADN, thúc đẩy sự phân chia tế bào, kích thích

sự tăng trưởng của chồi, liên quan đến sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trongnuôi cấy mô, các cytokinin thường được sử dụng là: Zeatin, 6- benzylaminopurine(BAP), kinetin, 2-iP Khi sử dụng ở nồng độ cao, các chất này kích thích sự hình thànhchồi và ức chế tạo rễ [8] Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axitnucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BAP là cytokinin tổnghợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin Kinetin và BAP cùng có tác dụngkích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạnchế sự hoá già của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất,quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzim.Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phải các chất kíchthích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phânchia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng sự tác động tương hỗ giữa cáchoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác độngquyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Tỉ lệ auxin vàcytokinin trong môi trường nó quyết định đến sự phát sinh hình thái, nếu tỉ lệauxin/cytokinin cao sẽ dẫn đến việc tạo phôi, tạo callus và hình thành rễ, nếu ngược lại tỉ

lệ cytokinin/auxin cao dẫn đến sinh sản chồi và mắt lá Das (1958) và Nitsch (1968)khẳng định rằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thíchmạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình cảm ứng cho sự phân chia tế bào [8], [14].+ Giberelin và axit abscissic: ít được sử dụng trong nuôi cấy mô, Gibbrellic acid(GA3) được sử dụng chủ yếu để kéo dài lóng và tăng trưởng mô phân sinh, Abscissicacid (ABA) chỉ được sử dụng để tạo phôi soma [8]

- Chất làm rắn môi trường

Chất làm rắn môi trường được sử dụng để tạo môi trường nuôi cấy mô nửa rắn đểcây có thể tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Chất làm rắn môi trường thường sửdụng là agar Agar là polysaccharide có phân tử lượng cao thu được từ rong biển và cóthể giữ nước Nó được thêm vào môi trường ở nồng độ khác nhau từ 0,5% đến 1% ( w/v) Agar chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác, vì gel của agar không phảnứng với các thành phần của môi trường nuôi cấy, ngoài ra chúng không bị thủy phânbởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiếnhành [8], [13], [17]

- Độ pH của môi trường

pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sinh trưởng và phátsinh hình thái của mẫu nuôi cấy ở các giai đoạn khác nhau Bởi vì, pH ảnh hưởng đến

sự hấp thụ các ion và quá trình đông đặc của chất gel, pH càng cao thì tăng khả năngđông đặc của agar Ngoài ra sự ổn định pH trong môi trường sẽ giúp duy trì trao đổichất trong tế bào pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy là 5,8 trước khi khử trùng Giá trị

pH thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 sẽ ức chế sự tăng trưởng và phát triển của cây pH củamôi trường nuôi cấy thường giảm 0,3 – 0,5 sau khi hấp khử trùng và luôn thay đổi quacác giai đoạn của quá trình nuôi cấy [17]

1.2.1.4 Điều kiện nuôi cấy

Để tăng hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, ngoài thành phần môi trường thìđiều kiện nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, cũng phải được tối ưu hóa

- Ánh sáng: Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photonthông lượng) và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phát sinhhình thái của các mô nuôi cấy Nhìn chung, đèn huỳnh quang là nguồn ánh sáng chínhcho việc duy trì nuôi cấy mô [10]

- Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quátrình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động củaauxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây con được nuôi cấy [10]

1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro

Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạtđược khi trải qua các giai đoạn [13]:

1.2.2.1 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro.Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôicấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuyvậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thửchắc chắn sẽ đạt kết quả

1.2.2.2 Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy mô

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôicấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin,

cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũngcần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng táisinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thờigian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi.

1.2.2.3 Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân,

ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng(Auxin, Cytokynin, Gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiếtnấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tuỳ thuộc vào từngđối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua cáccụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các mắt lá (vi giâm cành)hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

1.2.2.4 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giaiđoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ này sẽ xuấthiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môitrường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễphụ từ mô nuôi cấy

1.2.2.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quátrình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trongthực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡngsang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt dộ,ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươmcũng như ruộng sản xuất

1.2.3.Một số nghiên cứu nhân giống in vitro trên cây ăn quả, cây thuốc

- Bùi Ngọc Thắng (2017) cũng đã nghiên cứu nhân giống cây hà thủ ô đạt hiệuquả nhân giống cao Kết quả nghiên cứu cho thấy, mẫu được khử trùng với cồn 70o vàHgCl2 0,1% trong 6 phút đạt tỷ lệ mẫu sạch là 48,53% được tái sinh trên môi trường MS

bổ sung 0,2mg/l BAP Cảm ứng tái sinh cụm chồi đạt hiệu quả cao nhất trên môi trường

MS bổ sung 1mg/l BAP, 0.3mg/l Kin và 0.2mg/l NAA Tỷ lệ ra rễ đạ 100% trên môitrường MS bổ sung 0.2mg/l IBA, 0.1mg/l NAA và 20g/l sucrose sau 4 tuần nuôi cấy [1]

- Năm 2013, Priyanka và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài dược liệu

Psoralea Corylifolia Nguyên liệu được dùng nuôi cấy là thân cây, các mắt thân cây được

cắt ngắn cấy vào môi trường nhân chồi, được khảo sát trên ba loại môi trường: MS bổsung thêm BAP (12 μM), MS + NAA (10,0 μM) và MS + Kinetin (15,0 μM) kết quả thuM), MS + NAA (10,0 μM), MS + NAA (10,0 μM) và MS + Kinetin (15,0 μM) kết quả thuM) và MS + Kinetin (15,0 μM), MS + NAA (10,0 μM) và MS + Kinetin (15,0 μM) kết quả thuM) kết quả thuđược trên môi trường cơ bản MS + BAP 12 μM), MS + NAA (10,0 μM) và MS + Kinetin (15,0 μM) kết quả thuM là tốt nhất cho nhân nhanh chồi với sốchồi cao nhất (6,12 chồi/mẫu cấy) Trong vòng hai tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổsung 2,5 μM), MS + NAA (10,0 μM) và MS + Kinetin (15,0 μM) kết quả thuM IBA tạo rễ in vitro chồi có chiều dài trung bình 7,11cm [39]

- Nghiên cứu được tiến hành nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro câydâu tây SmiA từ vật liệu ban đầu là chồi nảy mầm từ hạt của Nông Thị Huệ (2018) Hệ

số nhân chồi đạt cao nhất (7,8 chồi/mẫu) sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung0,4 mg/l BA Môi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro là môi trường bán lỏng MS

bổ sung 0,25 mg/ α-NAA, tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 93,33%, số rễ trung bình đạt 12,36 rễ/chồi,chiều dài rễ trung bình đạt 1,49 cm sau 4 tuần nuôi cấy Trên giá thể đất phù sa, tỷ lệ câysống cao, sinh trưởng tốt Chế độ bón phân NPK kết hợp Atonik thích hợp nhất cho sựsinh trưởng và phát triển của cây dâu tây SmiA in vitro với chiều cao cây trung bình đạt19,13 cm sau 1 tháng chăm sóc Hoa nở sau 20 - 25 ngày hình thành

nụ và quả chín sau 30 - 35 ngày [10]

- Sedlák (2008) cũng đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy hai giống

cherry Karešova và Rivan Theo đó, tốc độ tăng sinh cao nhất 3,0 chồi/mẫu là thu được cho Rivan trên môi trường MS chứa 2 mg/l BAP Trong trường hợp trồng Karešova, bất kỳ cytokinin nào được thử nghiệm đã không thúc đẩy sự gia tăng thỏa đáng Tốc

độ tăng sinh cao nhất 1,6 chồi/mẫu đạt được trên môi trường MS với 2 mg/l 2iP không

đủ cho quy mô sản xuất trong ống nghiệm lớn hơn [41]

1.3 Giới thiệu về cây phúc bồn tử

1.3.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

1.3.1.1 Nguồn gốc, phân bố

Cây Phúc bồn tử (Rubus idaeus) là loài cây có nguồn gốc tự nhiên được phân bố

trải rộng ở Bắc Mỹ, các vùng Bắc Âu cho đến Tây Bắc Á Phúc bồn tử có xuất sứ từĐông Nam Á và Bắc Mỹ vào những năm 1200 Hạt giống được khám phá bở một nhànông học La Mã gốc Anh, từ đó lan truyền ra khắp châu Âu Diên tích trồng cây Phúcbồn tử này tăng theo thời gian: năm 1880 diện tích trồng cây này là 2000 mẫu Anh,năm 1919 diện tích này tăng lên 54000 mẫu Anh, năm 1948 là 60000 mẫu Anh Theo

số liệu của tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO) , năm 2002 trên thế giới có 37 quốcgia trồng cây này với với diện tích canh tác khoảng trên 85000 ha Cây Phúc bồn tửcho năng suất bình quân 5600kg/ha, khoảng 414,031 triệu tấn sản phẩm một năm.Hiện này con số này có tăng nhưng chưa có thống kê chính xác [28],[29].

Cây phúc bồn tử thuộc dạng cây bụi, thích nghi ở những vùng đồi thấp, đồngbằng với loại đất pha cát, đất sét có độ mùn cao, có pH đất vào khoảng 6.0 – 6.5 Khảnăng sinh trưởng tốt trong ngưỡng nhiệt độ từ 6oC đến 27oC [23] Thời gian sinhtrưởng của chúng từ 9 tháng đến 3 năm [45]

1.3.1.2 Vị trí phân loại

Cây Phúc bồn tử thuộc bộ Rosales, họ Rosaceae, chi Rubus là một chi lớn thuộc

họ hoa hồng, loài Rubus idaeus, tên tiếng Anh là Raspberry, tên tiếng Pháp là

Framboise

1.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái

Cây Phúc bồn tử thuộc dạng cây bụi, thân leo mọc thẳng cao khoảng 1.5-2m nênngười ta thường làm giàn lưới để tránh thân cây mọc bò tràn ra mặt đất làm ảnh hưởngđến sự phát triển của quả Cây Phúc bồn tử phát triển tùy thuộc nhiều vào chất lượnggiống và kỹ thuật canh tác [45]

Các bộ phận của cây Phúc bồn tử có những đặc điểm sau:

- Cây Phúc bồn tử thuộc loại cây rễ chùm sống thành từng bụi có khoảng 20-30cây con Mỗi cây con này khi trưởng thành, cho quả sẽ tiếp tục sinh sản ra nhiều cây con tiếp theo [31]

- Thân cây có đường kính 0,5-1,5 cm, có nhiều lông và gai mềm, màu sắc củalông mang đặc trưng của từng loài Khi cây còn nhỏ thân cây có màu xanh khi cây giàthân cây chuyển sang màu nâu Khi cắt ngang thân cây già thân nhìn tương tự cây hoahồng, trong cùng là một lõi xốp, phần sát biểu bì nhu mô vỏ đã hóa gỗ [31], [43]

- Lá Phúc bồn tử là loại lá đơn có lông ở mặt trên, gốc phiến hình tim, phiến chia

5 thùy hình chân vịt Cuống lá tròn nối liền phần thân với phiến lá Viền quanh lá có hìnhrăng cưa [42]

- Hoa Phúc bồn tử mọc thành cụm, cụm hoa hình chụm hay hình đầu có 5 cánhtrắng, đường kính khoảng 4-5 mm và có 5 đài hoa, mỗi hoa có 60-100 bầu nhụy và 60-

90 nhị đực Sự thụ phấn của cây Phúc bồn tử phụ thuộc vào côn trùng, thông thường

do lòai ong thụ phấn Phấn hoa đã thành thục trước khi bao phấn nở và không

phát tán ra ngòai trước khi hoa nở Hạt phấn có thể sống được 2 đến 3 ngày và númnhụy có thể tiếp nhận phấn hoa hiệu quả trong vòng 8-10 ngày Thường ra hoa vào đầu

hè và có thể ra hoa 1-2 lần trong năm [43], [45]

- Quả thuộc lọai quả hạch có chứa nhiều khóang chất, vitamin , được dùng ăn tươi, dùng làm nguyên liệu chế biến dạng sấy khô, sirô, các lọai rượu vang [24]

Trong tự nhiên, phúc bồn tử thích nghi với loại đất pha cát hoặc đất sét mùn.Không nên trồng Phúc bồn tử trên các vùng đất đã canh tác các cây họ cà trên 5 năm(hồ tiêu, cà chua, khoai tây…) vì cây phúc bồn tử cũng dễ bị nhiễm một số bệnh nấmmốc như cây họ cà [23], [45]

Thời gian trồng trọt và thu hoạch cây phúc bồn tử kéo dài từ 9 tháng đến 3 nămtùy thuộc vào điều kiện và môi trường canh tác [34]

Hiện nay, việc nhân giống cây phúc bồn tử chủ yếu dùng phương pháp gieo hạt

và nhân cấy từ ngó, nhân giống in vitro Việc nhân giống được thực hiện ở vườn ươm

cho đến khi cây cao khoảng 15 cm thì đem ra trồng với khoảng cách cây khoảng 60 x

60 cm Trong năm đầu tiên người ta thường ngắt bỏ hoa để tập trung cho cây sinhtrưởng về chiều cao và đẻ nhánh Quả Phúc bồn tử được thường thu hoạch từ vào nămthứ 2 trở đi Quả được hình thành tương đối nhanh, khoảng 30-50 ngày, thường chínvào mùa hè, trái được thu hoạch khi vừa chuyển sang màu hồng và còn cứng [45]

1.3.3 Công dụng và giá trị sử dụng

- Giá trị dinh dưỡng:

Phúc bồn tử chứa một chất rất có ích cho sức khoẻ là axít ellagic (một dạngtannin), được xem là chất dinh dưỡng có nguồn gốc thực vật (phyto-nutrients) chốngôxy hoá hiệu quả nhất Nó giúp bảo vệ màng tế bào và các cấu trúc cơ thể bằng cáchtrung hoà các gốc tự do Ngoài ra phúc bồn tử còn chứa nhiều hợp chất flavonoid nhưkaempferol, quercetin, anthocyanin Phúc bồn tử có hàm lượng cao vitamin C (53,7%),mangan (41%), Mg, Cu, Zn, K, acid folic, omega-3, vitamin K, vitamin E, chất xơ(31%) [37]

Có thể nói phúc bồn tử được xếp hàng thượng phẩm trong biểu đồ đánh giá thựcphẩm, nhiều lợi ích hơn dâu tây, việt quất (blueberry), nho đen (black grape), anh đào(cherry)… vì ngoài các vitamin, khoáng tố, nó còn là nguồn chất xơ giúp ổn địnhđường huyết nên rất tốt cho bệnh nhân tiểu đường

- Giá trị dược liệu:

Chống lão hoá, ung thư, tiểu đường, kháng khuẩn: ellagitannin trong phúc bồn tửđược chứng minh có tác dụng chống lão hoá 50% mạnh hơn dâu tây, gấp ba lần tráikiwi, gấp mười lần cà chua Với tác dụng hiệp lực của vitamin C và anthocyanin, khảnăng chống ôxy hoá và ngăn ngừa ung thư của phúc bồn tử được gia tăng gấp đôi, loạitrừ được các gốc tự do làm thay đổi cấu trúc ADN của tế bào Vitamin C và flavonoidcòn góp phần kháng viêm và kháng khuẩn mạnh, và tác dụng này không bị giảm đi khi

sử dụng phúc bồn tử đã được đông lạnh [37]

Bảo vệ thị lực: theo các số liệu được công bố trong Archives of Ophthalmologythì 36% người lớn sau 50 tuổi thường bị chứng thoái hoá điểm vàng mà nguyên nhânchính là ăn không đủ lượng trái cây cần thiết mỗi ngày Nghiên cứu đánh giá trên110.00 phụ nữ và nam giới cho thấy một nhóm cần phải ăn ba khẩu phần gồm rau củ

và trái cây mỗi ngày mới đủ chất bảo vệ thị lực, và một nhóm chỉ cần ăn một muỗngbột phúc bồn tử thì đã đầy đủ các carotenoid, vitamin A, C, E và các khoáng tố vilượng như Cu, Zn, là những thành phần giúp loại trừ các gốc tự do gây hại cho võngmạc [37]

Chống rối loạn cương dương, chữa liệt dương: các nhà nghiên cứu ở Mỹ chứngminh rằng phúc bồn tử giúp cải thiện vi tuần hoàn ở dương vật, giúp thần kinh hưngphấn làm dương vật mềm yếu sẽ cương trở lại Y học cổ truyền cũng sử dụng thảodược này để làm thuốc bổ can minh mục, ích thận trợ dương, bổ huyết, chữa liệt dương

di tinh, xuất tinh sớm, mắt mờ, phụ nữ kinh nguyệt không đều, thận suy, tiểu tiện nhiều[37]

Giúp đẹp da, đen tóc: vitamin E, carotenoid và các chất flavonoid trong phúc bồn

tử có tác dụng giải dị ứng, tiêu viêm, thải độc, bảo vệ da chống lại các tia cực tím làmgiảm các vết thâm nám trên da, giúp da đàn hồi, tăng cường tuần hoàn ở các mao mạchngoại vi, thúc đẩy sự tái tạo các tế bào collagen mới giúp da sáng đẹp Các hoạt chấtnày còn ngăn cản sự rụng tóc, chậm bạc tóc [25]

Cải thiện tuần hoàn não, chống rối loạn tiền mãn kinh: nghiên cứu của một số nhàkhoa học Mỹ còn cho thấy chất chống ôxy hoá trong phúc bồn tử có tác dụng phòngngừa các gốc tự do gây tổn hại đến não, đồng thời tăng lưu lượng máu và ôxy đến não,

từ đó nâng cao khả năng phán đoán, tăng trí nhớ, sức sáng tạo Đối với phụ nữ tronggiai đoạn mãn kinh hoặc rối loạn tiền mãn kinh, nó giúp giảm stress, giảm

các cơn bốc hoả và chính những chất sinh học này đóng vai trò hormon thay thế gópphần điều hoà lượng estrogen bị thiếu hụt trong giai đoạn này [25].

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Đại học bang Ohio (Mỹ),những bệnh nhân mắc chứng Esophagus barrett, tình trạng có thể chuyển sang bệnhung thư thực quản nếu ăn thường xuyên quả Phúc bồn tử thì có thể ngăn ngừa quátrình phát triển đến giai đoạn ung thư thực quản [25]

Phần thân và lá phúc bồn tử được phơi sấy khô làm trà, làm nước súc miệng giúpchữa các bệnh viêm loét miệng, viêm họng, đắp lên các vết thương để chống sẹo lồi[25]

1.3.4 Các nghiên cứu liên quan

1.3.4.1 Nghiên cứu ngoài nước

- Năm 2009, Aliona và cs đã nghiên cứu thiết lập các điều kiện tối ưu trong nhân

giống invitro của hai giống Raspberry (Opal và Cayuga) Mắt lá, chồi đỉnh và đĩa lá dùng

làm mẫu cấy Sau khử trùng, các mẫu cấy được đặt trên môi trường MS bổ sung với cácnồng độ khác nhau của cytokinin (BAP, TDZ và K) và auxins (2,4D và IAA) được thêmvào độc lập hoặc kết hợp với GA3 Đối với cả hai giống, hệ số nhân chồi lớn nhất, xấp xỉ4.67 mỗi mẫu cấy trên môi trường MS chứa 0.5mg / l AIA + 1mg / l BAP + 0.5mg / lGA3 và chồi tối đa chiều dài, khoảng 2,58 cm, thu được trên môi trường chứa 0,5mg/lAIA + 1mg / l BAP Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình phát sinh cơ quan hiệu quảnhất cho cả hai giống cây mâm xôi từ mẫu cấy chồi đỉnh trên MS trung bình cung cấp0,5mg / l 2,4D + 1mg / l TDZ hoặc 1mg / l AIA + 1mg / l

BAP + 0.5mg / l GA3 [22]

- Năm 2013, Dziadczyk và cs xác định các điều kiện thích hợp để nuôi cấy tế bào

cây phúc bồn tử (Rubus idaeus) Nuôi cấy callus từ các lá mầm với năm phối hợp các

chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật: 1) 4,0 mg/l IAA và 1,0 mg/l BAP; 2) 0,25 mg/l2,4-D; 3) 0,5 mg/l 2,4-D; 4) 2,0 mg/l NAA và 2,0 mg/l BAP; 5) 4.0 mg/l NAA và 2.0mg/l BAP, được thêm vào môi trường Murashige và Skoog (1962) được cải tiến.Callus tốt nhất (phát triển mạnh mẽ, khỏe mạnh và dễ vỡ) đã được thu được trên môitrường bổ sung với 4,0 mg/l IAA và 1,0 mg/l BAP Để tìm ra điều kiện nuôi cấy thíchhợp cho phân tán mô sẹo trong môi trường lỏng, bốn sự kết hợp của hormon thực vật(auxin và cytokinin) đã được thử nghiệm Môi trường nuôi cấy tốt nhất chỉ bổ sung với1,0 mg/l 2,4-D Với môi trường có 8 mg/l IAAvà 1,0 mg/l BAP cũng có hiệu quả