Nghiên cứu đa dạng hệ vi sinh trong ruột tôm thẻ chân trắng tại tỉnh sóc trăng bằng kỹ thuật metagenomics

Gần đây nhất, trong Chuỗi Hội nghị Bàn tròn Nuôi trồng thủysản gần đây TARS ở Chang Mai, Thái Lan, bệnh SHIV - căn bệnh do virus gây ra,lần đầu tiên được phát hiện và xác định trong mẫu

Nguyễn Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG

BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2018

Nguyễn Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI SINH TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TẠI TỈNH SÓC TRĂNG

BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8.42.01.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Chu Hoàng Hà

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới

sự hướng dẫn của PGS TS Chu Hoàng Hà và TS Nguyễn Trung Nam Các nộidung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và TS.

Nguyễn Trung Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn Ths Lê Hoàng Đức, cùng tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018

Học viên

Nguyễn Hồng Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Giới thiệu 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

NỘI DUNG 3

Chương 1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng 3

1.1.1 Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái cấu tạo của tôm thẻ chân trắng 3

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng; phân bố tự nhiên của tôm thẻ chân trắng 4

1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam 6

1.2.1 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam 6

1.2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi và các biện pháp phòng trừ bệnh trên thế giới và Việt Nam 8

1.3 Công nghệ metagenomics và hướng tiếp cận mới trong nuôi trồng và phòng trừ bệnh hại trên tôm nuôi 10

1.3.1 Giới thiệu về công nghệ metagenomics 10

1.3.2 Các nghiên cứu và thành tựu của công nghệ metagenomics trong lĩnh vực thủy sản 13

1.3.3 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next generation sequencing – NGS) và hệ thống giải trình gen thế hệ mới Illumina 19

1.3.3.1 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới 19

1.3.3.2 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina 20

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.1.2 Hóa chất phục vụ nghiên cứu 24

2.1.3 Thiết bị phục vụ nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp thu mẫu 25

2.2.2 Các phương pháp phân tích mẫu nước 25

2.2.3 Phương pháp tách ADN 25

2.2.4 Đánh giá chất lượng ADN tách chiết 33

2.2.5 Các phương pháp giải trình tự 33

2.2.6 Xử lý số liệu giải trình tự gen ADN 16S rARN 33

Chương 3 Kết quả và thảo luận 35

3.1 Kết quả thu mẫu và đánh giá các chỉ tiêu môi trường 35

3.2 Kết quả tách ADN tổng số của các mẫu ruột, nước 37

3.2.1 Kết quả tách ADN mẫu ruột 38

3.2.2 Kết quả tách ADN mẫu nước 41

3.3 Kết quả xác định trình tự metagenome ADN 46

3.3.1 Xác định trình tự ADN metagenome 46

3.3.2 Kết quả phân tích đa dạng vi sinh vật mẫu ruột và nước 48

3.3.3 Thành phần vi khuẩn trong mẫu tôm thẻ khỏe mạnh và bệnh 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

1 Kết luận 56

2 Đề nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A

TSS Turbidity and suspendid solids Tổng chất rắn lơ lửng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thông tin các vị trí thu mẫu 35

Bảng 3.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu môi trường ao nuôi thu mẫu 36

Bảng 3.3 Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp 39

Bảng 3.4 Kết quả định lượng ADN tổng số tách chiết theo ba phương pháp 42

Bảng 3.5 Bảng mô tả bộ dữ liệu giải trình tự gen trên máy Illumina 48

Bảng 3.6 Các thông số giải trình tự và các chỉ số đa dạng phân tích ở các mẫu nước, ruột của tôm thẻ bị bệnh và khỏe mạnh 49

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái tôm thẻ chân trắng 3

Hình 1.2 Quy trình sản xuất tôm thẻ chân trắng (Nguồn: FAO) 6

Hình 1.3 Sản lượng tôm trên thế giới giai đoạn 1995-2017, dự báo đến năm 2019 7

Hình 1.4 Tổng sản lượng tôm đánh bắt và nuôi trồng (Nguồn: FAO) 7

Hình 1.5 Số liệu sản xuất ngành tôm năm 2017 8 Hình 1.6 Xây dựng và sàng lọc thư viện metagenomics .12 Hình 2.1 Hình ảnh quá trình lọc nước qua các màng lọc có kích thước 8 µm, 0,8

µm và 0,22 µm .29

Hình 3.1 Hình ảnh ao nuôi tôm thu mẫu (A); và mẫu tôm khỏe (hình B, phải) và

mẫu tôm bệnh (hình B, trái) 35

Hình 3.2 Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm sử dụng ba phương

pháp khác nhau 39

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình tách chiết metagenome ADN từ mẫu ruột tôm phục vụ

giải trình tự gen thế hệ mới 41

Hình 3.4 Sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ mẫu ruột tôm sử dụng ba phương

Hình 3.11 Thành phần 10 ngành chính trong mẫu ruột, nước của tôm thẻ bị bệnh

MỞ ĐẦU

1 Giới thiệu

Theo dự báo của GOAL 2018, đến năm 2020 Việt Nam sẽ vượt qua hai quốcgia xuất khẩu tôm lớn ở châu Á là Ấn Độ và Indonexia để trở thành quốc gia xuấtkhẩu tôm lớn thứ hai châu Á, sau Trung Quốc Theo VASEP, sản lượng tôm ướctính của Việt Nam vào năm 2019 có thể đạt 700.000 tấn Diện tích nuôi trồng và sảnlượng liên tục tăng là dấu hiệu đáng mừng đối với ngành nuôi trồng thủy sản Tuynhiên, sự tăng trưởng này cũng đi kèm với sự gia tăng nhiều yếu tố rủi ro, trong đó,nan giải nhất vẫn là vấn đề dịch bệnh trên tôm nuôi với diễn biến phức tạp qua cácnăm Các bệnh phổ biến trên tôm nuôi có thể kể đến là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính

(AHPND) (hay bệnh chết sớm – EMS) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra,

hội chứng đốm trắng (Bacterial White Spot Syndrome – BWSS) do vi khuẩn thuộc

họ Bacillaceae, bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do White spotsyndrome virus (WSSV) gây ra,… Hiện nay kháng sinh được sử dụng phổ biến đểkiểm soát dịch bệnh Tuy nhiên, từ việc phụ thuộc vào kháng sinh trước khi sửdụng các biện pháp phòng trị bệnh khác đến việc sử dụng kháng sinh mất kiểm soát

đã dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh (ABR - antibiotic resistance) Cùng với đó,chính sách kiểm duyệt vệ sinh an toàn thực phẩm đối với dư lượng chất kháng sinhtrong sản phẩm thủy sản của các thị trường nhập khẩu và tiêu thụ lớn như Mỹ, EU,

… ngày càng chặt chẽ và gắt gao đã đặt ra thách thức không nhỏ đối với ngành Nuôitrồng thủy sản Việt Nam trong việc quản lý sử dụng và nghiên cứu đưa ra các biệnpháp thay thế kháng sinh trong phòng ngừa và điều trị các bệnh thủy sản Một trongnhững hướng đi mới và hiệu quả đã được nhiều quốc gia trên thế giới hướng tới là

sử dụng các chế phẩm probiotics Tuy nhiên, sử dụng probiotics trong nuôi trồngthủy sản hầu hết đều dựa vào kinh nghiệm thực hành [91]; hơn nữa, việc nuôi cấy,phân lập và tìm hiểu các cơ chế tương tác giữa các vi sinh vật trong môi trường nuôitôm còn gặp nhiều khó khăn, từ đó dẫn đến việc các chế phẩm probiotics chưa thực

sự phát huy được tiềm năng hiệu quả của chúng

Sự phát triển vượt bậc của Công nghệ gen trong những năm gần đây đã cho

ra đời nhiều công cụ kỹ thuật hữu ích Trong đó, công nghệ metagenomics đượcxem là

sự tổng hợp sức mạnh và các thành tựu mới nhất của các công nghệ genomics, sinhtin học, sinh học hệ thống Công nghệ này cho phép tiếp cận và phân tích toàn bộ hệgen của quần xã sinh vật trong sinh cảnh nhất định và tìm hiểu mối quan hệ tươngtác giữa các thành phần vi sinh vật trong quần xã đó Từ đó cho phép phát hiện sớmcác chủng vi sinh vật gây bệnh cũng như tìm được các chủng vi sinh vật hoặc cácgen có ích trong phòng ngừa và điều trị các bệnh thủy sản.

Xuất phát từ thực tiễn này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

đa dạng hệ vi sinh trong ruột tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Sóc Trăng bằng kỹ thuật metagenomics”.

2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài nhằm:

- Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA metagenome phục vụ cho quá trìnhgiải trình tự gen hệ vi sinh vật đất và ruột tôm thẻ chân trắng

- Đánh giá cấu trúc và đa dạng hệ vi sinh vật trong nước và ruột tôm thẻ chântrắng thông qua phân tích cơ sở dữ liệu 16S rRNA metagenome

- Xác định mối tương quan giữa hệ vi sinh vật trong nước nuôi tôm thẻ và hệ

vi sinh vật trong ruột tôm thẻ

NỘI DUNG Chương 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Đặc điểm sinh học tôm thẻ chân trắng

1.1.1 Hệ thống phân loại, đặc điểm hình thái cấu tạo của tôm thẻ chân trắng

Tôm thẻ chân trắng có tên khoa học là Litopenaeus vannamei (Boone, 1931),

tên tiếng anh là Pacific white shrimp, thuộc giống Litopenaeus, họ Penaeidae, bộDecapoda, lớp Malacostraca, ngành Arthropoda

Tôm thẻ chân trắng có vỏ màu xanh lam, khi vỏ mỏng có màu trắng đục,chân bò có màu trắng ngà (Hình 1.1.) Chùy là phần kéo dài tiếp với bụng Dướichùy có

2 – 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 - 6 răng cưa ở phía bụng, các răng cưa này kéo dài,đôi khi tới đốt thứ hai Vỏ đầu ngực của tôm thẻ chân trắng có những gai gân và gairâu rất rõ, không có gai mắt và gai đuôi (gai telssm), không có rãnh sau mắt, đường

gờ sau chuỳ khá dài đôi khi từ mép sau vỏ đầu ngực Gờ bên chuỳ ngắn, chỉ kéo dàitới gai thượng vị Phần bụng của tôm có 6 đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rấthẹp hoặc không có Telsson (gai đuôi) không phân nhánh Râu không có gai phụ vàchiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp Xúc biện của hàm dưới thứ nhất thondài và thường có 3 - 4 hàng, phần cuối của xúc biện có hình roi Gai gốc (basial) vàgai ischial nằm ở đốt thứ nhất chân ngực [3]

Hình 1.1 Hình thái tôm thẻ chân trắng (Nguồn: wikipedia)

1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái và tập tính của tôm thẻ chân trắng; phân bố

tự nhiên của tôm thẻ chân trắng

Đặc điểm sinh trưởng

Vòng đời của tôm thẻ chân trắng được chia làm 6 thời kỳ:

Thời kỳ phôi: bắt đầu từ khi trứng được thụ tinh đến khi trứng nở, bao gồmnhiều giai đoạn đến khi phát triển thành phôi Nauplius

Thời kỳ ấu trùng: bao gồm nhiều giai đoạn để ấu trùng tôm lột xác và biếnthái hoàn toàn:

Giai đoạn Nauplius (N): gồm 6 giai đoạn phụ tương ứng với 6 lần lột xác của

ấu trùng Nauplius, diễn ra trong khoảng 36-51 giờ, trong đó các Nauplius bơi từngđoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng,không cần cho ăn

Giai đoạn Zoea (Z): gồm 3 giai đoạn phụ, diễn ra trong khoảng 105- 120 giờ,trong đó các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ hai lần, mỗi lần khoảng 36 giờ

Ở giai đoạn này, ấu trùng Zoea bơi lội liên tục có định hướng, thẳng về phía trước

và ăn thực vật nổi bằng hình thức lọc

Giai đoạn Mysis (M): gồm 3 giai đoạn, diễn ra trong 72 giờ, trong đó cácMysis có đặc tính treo mình trong nước, đầu chúc xuống dưới, và ăn các động vậtnổi hoặc tảo silic bằng hình thức bắt mồi chủ động

Giai đoạn Post-larvae (PL) (giai đoạn hậu ấu trùng): tôm thẻ đã có hình dạngloài nhưng chưa hoàn thiện sắc tố, các Post-larvae hoạt động nhanh nhẹn, bắt mồichủ động với thức ăn chủ yếu là động vật nổi Ở cuối giai đoạn này, các Post-larvaechuyển sang sống đáy

Thời kỳ ấu niên: ở thời kỳ này, hệ thống mang của tôm đã hoàn chỉnh, tômchuyển sang sống đáy hoàn toàn, bắt đầu bò bằng chân và bơi bằng chân bơi Thời

kỳ này tương ứng với cuối giai đoạn tôm bột và đầu tôm giống trong sản xuất [3]

Thời kỳ thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định tỷ lệ thân Giai đoạn này tương đương

với giai đoạn ươm giống và nuôi thịt trong sản xuất

Thời kỳ sắp trưởng thành: thời kỳ này tôm trưởng thành về mặt sinh dục vàthể hiện sự sinh trưởng không đồng đều một cách rõ rệt giữa hai giới tính, trong đócon cái lớn nhanh hơn con đực.

Thời kỳ trưởng thành: tôm có khả năng tham gia sinh sản Lúc này, tômtrưởng thành sống ở vùng xa bờ nơi có độ trong cao và độ mặn ổn định [1]

Phân bố và tập tính

Trong tự nhiên, t ô m t h ẻ chân trắng phân bố ở vùng ven bờ phía đông TháiBình Dương, từ biển Bắc peru đến nam Mexico và Equador Ở vùng biển tự nhiên,tôm chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độ sâu khoảng 72 m, có thể sống ở

độ mặn trong phạm vi 5 50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28 34‰, pH = 7,7 8,3, nhiệt độ thích hợp 25 - 32oC, tuy nhiên chúng có thể sống được ở nhiệt độ 12 -

Sinh sản

Tôm chân trắng thành thục sớm, con cái có khối lượng từ 30 - 45 g/con là cóthể tham gia sinh sản Ở khu vực tự nhiên có tôm chân trắng phân bố thì quanh nămđều bắt được tôm chân trắng Song mùa sinh sản của tôm chân trắng ở vùng biển lại

có sự khác nhau ví dụ: ở ven biển phía Bắc Equađo tôm đẻ tử tháng 12 đến tháng 4.Lượng trứng của mỗi vụ đẻ phụ thuộc vào cỡ tôm mẹ: Nếu tôm mẹ từ 30 - 45g thìlượng trứng từ 100.000 - 250.000 trứng, đường kính trứng 0,22 mm

Sau mỗi lần đẻ hết trứng, buồng trứng tôm lại phát triển tiếp Thời gian giữa

2 lần đẻ cách nhau 2 - 3 ngày Con đẻ nhiều nhất tới 10 lần/năm Thường sau 3 - 4lần đẻ liên tục thì có lần lột vỏ Sau khi đẻ 14 - 16 giờ trứng nở ra ấu trùng Nauplius

ấu trùng Nauplius trải qua 6 giai đoạn: Zoea qua 3 giai đoạn, Mysis qua 3 giai đoạnthành Postlarvae Chiều dài của Postlarvae tôm P.Vannamei khoảng 0,88 - 3mm

Hình 1.2 Quy trình sản xuất tôm thẻ chân trắng (Nguồn: FAO)

1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam

1.2.1 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng trên thế giới và tại Việt Nam

Tôm thẻ chân trắng bắt đầu được đánh bắt tự nhiên từ năm 1981 với sảnlượng khiêm tốn Đến năm 1995 chúng mới bắt đầu được nuôi trồng và cho đến nay,đây là loài tôm được nuôi phổ biến nhất Theo thống kê của FAO (2018) và GOAL(2017), tổng sản lượng tôm thẻ chân trắng đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng liên tụctăng qua các năm, và tăng mạnh từ những năm 2000 đến nay (Hình 1.3) [22] Đặcbiệt, đối với sản lượng tôm thẻ chân trắng nuôi trồng, có thể dễ dàng thấy được sựtăng trưởng mạnh và đều qua các năm, và được dự doán là tiếp tục tăng trong năm

2019 (Hình

1.3) Trong báo cáo của FAO năm 2018, tính đến năm 2015, sản lượng tôm thẻ chân

trắng tự nhiên và nuôi trồng chiếm 47% tổng sản lượng tôm trên thế giới (2015)

(Hình1.4)

Hình 1.3 Sản lượng tôm trên thế giới giai đoạn 1995-2017, dự báo đến năm 2019

Hình 1.4 Tổng sản lượng tôm đánh bắt và nuôi trồng (Nguồn: FAO)

Các quốc gia dẫn đầu trong nuôi trồng và xuất khẩu tôm thẻ chân trắng có thể

kể đến là Trung Quốc, Ấn Độ, Ecuador, Việt Nam và Indonexia [22] Theo thống kêcủa FAO Fishery Stastistics, bắt đầu từ năm 2006, Việt Nam là một trong nhữngnước sản xuất tôm thẻ chân trắng chính trên toàn thế giới Báo cáo của FAO (2018)chỉ ra rằng trong suốt chín tháng (từ tháng 1 đến tháng 9) năm 2017, xuất khẩu tômthẻ chân

trắng của Việt Nam đạt 390 000 tấn, tăng 11% so với cùng kỳ năm 2016 Thị trườngchính của tôm Việt Nam xuất khẩu là Trung Quốc (chiểm 50-60% tổng lượng tômxuất khẩu), tiếp đến là Mỹ, EU28, Nhật Bản, và Hàn Quốc.

Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổng cục thủy sản, diện tích nuôi tôm nước

lợ trong năm 2017 cả nước đạt 721,1 nghìn ha; tăng 3,8% so với năm 2016 trong đódiện tích tôm chân trắng là 98,7 nghìn ha; tăng 4,7% so với năm 2016; và sản lượngtôm nước lợ năm 2017 đạt 683,4 nghìn tấn, tăng 4% so với năm 2016 trong đó sảnlượng tôm chân trắng 427 nghìn tấn, tăng 8,5% so với năm 2016 (Hình 1.5.) Vàtheo thống kê sơ bộ mới nhất của Tổng cục thủy sản, trong chín tháng đầu năm

2018, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 701.302 ha (tăng 0,7% so với cùng kỳ năm2017), sản lượng nuôi đạt 509.400 tấn (tăng 8,0% so với cùng

kỳ năm 2017)

Hình 1.5 Số liệu sản xuất ngành tôm năm 2017

(Nguồn: Tổng cục Thủy sản Việt Nam - 2017)

1.2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi và các biện pháp phòng trừ bệnh trên thế giới và Việt Nam

Theo đánh giá của GAA qua các năm, vấn đề bệnh và dịch bệnh trên tômluôn là vấn đề thách thức đối với sự phát triển bền vững của sản xuất tôm nuôi Năm

1987 và 1988 sự bùng phát của bệnh gan tụy (MBV) tại Đài Loan gây thiệt hạinghiêm trọng cho nghề nuôi tôm sú [14] Tại Trung Quốc, sự bùng phát của dịchbệnh đốm trắng vào năm 1992 làm sụt giảm nghiêm trọng sản lượng tôm sú nuôitrồng, và kéo dài đến năm 2000 Bệnh này cũng gây thiệt hại tới năng suất tôm nuôi

ở Thái Lan và Ấn Độ trong giai đoạn 1995-2003 [37] Sự phục hồi sản lượng tômnuôi trồng được thu nhận từ năm 2003 với sự xuất hiện của tôm thẻ chân trắng Tuynhiên, theo khảo sát của GOAL, sản lượng trong năm 2012 giảm xuống còn 3,4triệu tấn (giảm 5% so với năm 2011) do tác động của hội chứng tôm chết sớm(EMS) hay là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính ở Trung Quốc, Thái Lan, ViệtNam và Malaysia Gần đây nhất, trong Chuỗi Hội nghị Bàn tròn Nuôi trồng thủysản gần đây (TARS) ở Chang Mai, Thái Lan, bệnh SHIV - căn bệnh do virus gây ra,lần đầu tiên được phát hiện và xác định trong mẫu tôm tôm thẻ chân trắng

Litopenaeus vannamei được thu thập từ một trang trại ở tỉnh Chiết Giang, Trung

Quốc, vào tháng 12 năm 2014, đã được báo cáo là “sát thủ” đối với tôm đã xuất hiện

và hoành hành ở Trung Quốc, và cũng xuất hiện ở một số quốc gia khác có sảnlượng tôm thẻ chân trắng nuôi trồng lớn như Ấn Độ, Việt Nam; và các thông tin liênquan đến tác nhân gây bệnh – SHIV mới chỉ được nghiên cứu ở mức độ xác địnhđặc điểm [56], [57], phát hiện và định lượng bằng rt- PCR hoặc bằng hệ thống SHIVRT-PCR/POCKITTM system và giải trình tự toàn bộ hệ gen của loại virus này [55]

Tại Việt Nam, Theo báo cáo về tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi của Tổngcục Thủy sản, trong 6 tháng đầu năm 2017 tổng diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệthại là 11.430 ha, chiếm 1,89% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước Trong đó, tổngdiện tích tôm nuôi bị bệnh là 4.165,78 ha, chiếm 36.4% (các bệnh trên tôm nuôi:bệnh đốm trắng 14%, bệnh hoại tử gan tụy cấp 14%, bệnh đỏ thân, còi, phân trắng chiếm

8%) tổng diện tích bị thiệt hại; không xác định nguyên nhân 4.745 ha, chiếm 41,6%;

do biến đổi môi trường, thời tiết là 2.519 ha, chiếm 22,0 %.

Thống kê hàng năm của GAA đều chỉ ra rằng, bệnh trên tôm luôn là tháchthức lớn đối với ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản nói chung và ngành côngnghiệp

nuôi tôm nói riêng Và các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh trên tôm để nhằmgiảm thiểu đến mức thấp nhất thiệt hại trên tôm nuôi trồng đã được đưa ra Trong số

đó, kháng sinh được sử dụng như là một loại thuốc quan trọng trong điều trị cácbệnh nhiễm khuẩn, xử lý, cải tạo môi trường Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinhvới mức độ cao trong nuôi tôm đã làm gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh của vikhuẩn Theo Phuong và cs (2006); Dang và cs (2007), kết quả điều tra thực địa đãchỉ ra enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, oxolinic acid và flumequin,sulfamethoxazole và oxytetracycline là các loại kháng sinh đang được sử dụng phổbiến trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam [18], [54] Cùng với đó, yêu cầu ngàycàng cao trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đối với các sản phẩm thủy sản về

dư lượng kháng sinh, hóa chất của các nước nhập khẩu đã đặt ra thách thức cho cácnước nuôi trồng thủy sản, trong đó có Việt Nam Theo Nguyễn Quốc Ân (2009),chloramphenicol hoặc các kháng sinh khác như oxytetracycline, sulfamethazone,enrofloxacine, ciprofloxacin, flofenicol, trimethoprim… đã được phát hiện trongmột số lô hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam [2] Vì vậy, trong những năm gầnđây, các biện pháp nuôi trồng sử dụng các chế phẩm sinh học đang được khuyểncáo và khuyến khích sử dụng Các nghiên cứu của Moriarty (1999), F arzan f ar (2006) đã đề xuất bổ sung các chủng khuẩn Bacillus spp., Lactobacillus spp vàocác chế phẩm sinh học để kiểm soát và cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh [23], [50].Nghiên cứu của Balcázar (2007) và Liu (2010) đã đề cập đến vai trò của chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis trong việc chống lại các chủng vi khuẩn Vibrio spp gây

bệnh chết sớm (EMS) hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) trên tôm thẻchân trắng giống [6], [43]

1.3 Công nghệ metagenomics và hướng tiếp cận mới trong nuôi trồng và phòng trừ bệnh hại trên tôm nuôi

1.3.1 Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Công nghệ metagenomics được xem là sự tổng hợp sức mạnh và các thànhtựu mới nhất của các công nghệ genomics, tin sinh học, sinh học hệ thống Công cụgenomics cho phép nghiên cứu hệ gen trong từng cá thể đơn lẻ, tuy nhiên khi ápdụng trong nghiên cứu khu hệ vi sinh vật sẽ gặp phải những hạn chế sau: (i) Hầu hếtcác vi sinh vật là không nuôi cấy được Vi sinh vật trên hành tinh ước tính có 1030loại, trong

đó số lượng sinh vật có thể nuôi cấy được chỉ chiếm 0,1-1% tùy theo từng môitrường sinh thái); (ii) tính đa dạng của sinh vật trong hệ sinh thái và khả năng biến

dị di truyền xảy ra không ngừng để thích nghi nhanh chóng với những thay đổi củamôi trường sinh thái để đảm bảo cân bằng sinh thái bền vững

Trong khi đó, công nghệ metagenomics là một bước tiến xa hơn trong nghiêncứu hệ gen, cho phép phân tích hệ gen của cả quần xã sinh vật trong một khu hệ sinhthái để con người có thể hiểu được bức tranh tổng thể về: (i) Mức độ phức tạp củacác sinh vật trong một khu hệ sinh thái nhất định như quần xã sinh vật có mặt trongđường hô hấp, trong hệ tiêu hóa, tiết niệu của các nhóm người mắc các nhóm bệnhkhác nhau; sinh vật trong nước biển, trong các môi trường khắc nghiệt, cực đoan,…;(ii) mối tương tác giữa các sinh vật trong một môi trường để đảm bảo tính bền vữngcủa hệ sinh thái, mối tương tác giữa các sinh vật để con người chống lại bệnh tật, táitạo lại môi trường xanh, sạch; (iii) và từ những hiểu biết tổng thể về đặc điểm ditruyền của quần xã sinh vật, cùng với metabolomics, metaproteomics và công cụ tinsinh học, con người có thể học tập được các qui trình trao đổi chất, qui trình chuyểnhóa đảm bảo cân bằng sinh thái, môi trường và khai thác được nhiều nguồn gen mãhóa cho các tính trạng quí, hiếm, phục vụ đắc lực cho đảm bảo sức khỏe cộng đồng,nâng cao chất lượng cuộc sống, đảm bảo an ninh quốc gia, năng lượng và giữ đượctrái đất xanh sạch chống lại biến đổi khí hậu toàn cầu đang đe dọa đến toàn nhânloại

Về cơ bản, công nghệ Metagenomics bao gồm hai hướng chính: (i) Sàng lọcthư viện metagenome dựa vào hoạt tính sinh học; (ii) Sàng lọc thư viện metagenomedựa vào xác định trình tự nucleotid

Cả hai hướng nghiên cứu này đều phải tiến hành tách chiết các phân tử ditruyền từ mẫu môi trường Tùy theo mục đích mà Metagenomic ADN hayMetagenomic ARN được tách chiết Để khảo sát quần thể virus xâm nhiễm ở đườngmũi họng hoặc trong hệ tiêu hóa, Metagenomic ARN sẽ được tách chiết còn để khảosát vi sinh vật và đa dạng vi sinh vật thì Metagenomic ADN sẽ được tách chiết.Metagenomic ADN sẽ được giải trình tự trực tiếp để có được bức tranh tổng thể vềquần xã sinh vật, toàn bộ các gen có trong đó và đây là bước định hướng cho cácnhà nghiên cứu đi khai thác các nguồn gen khác nhau hoặc khai thác con đườngchuyển

hóa sinh học Ngoài ra, từ nguồn metagenome đã tách được, các nhà khoa học có thểtạo thư viện metagenome và thư viện này được chuyển vào các vật chủ tương thích

để sàng lọc các dòng có được hoạt tính sinh học mong muốn như sàng lọc cácenzyme mới, các chất kháng sinh mới, con đường chuyển hóa các chất độc hại hoặcnhận biết các chất có khả năng dùng làm thuốc Toàn bộ kỹ thuật có liên quan đếncông nghệ metagenomics được mô tả ở Hình 1.6

Hình 1.6 Xây dựng và sàng lọc thư viện metagenomics.

Mặc dù các công cụ giải trình tự metagnome mới phát triển mạnh mẽ trongvài năm gần đây nhưng các nhà khoa học đã nhen nhóm, ấp ủ các nghiên cứu vềmetagenomics trong vòng 20 năm qua Theo thống kê của GOLD, các nhà khoa học

đã nhận biết được có tới 7338 glycosyl hydrolase giả định Gene mã hóa choenzyme này chiếm tới 1,5 % trong tổng số gene tương đồng thu được từ các

dự án metagenomics ở đối tượng VSV của mối, người và đường ruột của chuột.Trong đó

13 họ glycosyl hydrolase tương đồng là gene chiếm ưu thế trong các hệmetagenome Các chất xúc tác sinh học mới được phát hiện với số lượng lớn nhờcác công cụ giải trình tự metatranscriptomics [79] Và theo GOLD, tính đến tháng10/2018, trên thế giới có 33.475 dự án phân tích metagenome đã và đang được thựchiện.

Hiện tại, công nghệ Metagenomics đã và đang được sử dụng như một công

cụ hữu hiệu vào các lĩnh vực chủ yếu sau: (1) tái tạo môi trường; (2) sàng lọc cácsản phẩm cho công nghiệp; (3) sàng lọc các phân tử dùng làm thuốc; (4) ứng dụngtrong lĩnh vực y tế; (5) tìm ra mối tương tác giữa vi sinh vật và cây trồng, bảo vệthực vật như tìm ra mối tương tác giữa các sinh vật, quần xã sinh vật để đảm bảo cơthể khỏe mạnh, chống lại vi khuẩn, virus gây bệnh; (6) phát triển hệ sinh thái bềnvững, chống lại biến đổi khí hậu toàn cầu

1.3.2 Các nghiên cứu và thành tựu của công nghệ metagenomics trong lĩnh vực thủy sản

Chúng ta phải chấp nhận một thực tế là 99% vi sinh vật trong hệ sinh thái visinh vẫn chưa được nuôi cấy và đây là một hạn chế chủ yếu trong việc tìm kiếm cácgene, enzyme và các chất có hoạt tính sinh học mới cũng như nghiên cứu sinh lý,khả năng trao đổi chất và vai trò của chúng trong môi trường [7], [59], [62] Cuốinhững năm 1980, các phân tích trực tiếp từ trình tự rARN đã chỉ ra phần lớn vi sinhvật có mặt trong môi trường chưa được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy [30].Phát hiện này cùng với những tiến bộ trong phương pháp tách chiết, tinh sạch ADN

từ môi trường và công nghệ xác định trình tự ADN đã đẩy nhanh tốc độ phát triểncủa các nghiên cứu di truyền quần thể vi sinh vật hỗn hợp [29], [44] 16S ribosomalDNA/RNA (rADN/rARN) đã được sử dụng rộng rãi trong việc phân loại vi sinh vậtchưa được phân lập (nuôi cấy) trong môi trường [76] Những nghiên cứu dựa trênchỉ số này thực sự đã định nghĩa lại và mở rộng tầm hiểu biết của chúng ta về đadạng sinh học, sinh thái vi sinh và tiến hóa [45] Một tính toán đơn giản về đa dạngsinh học của vi sinh vật đất giao động từ 3.000 đến 11.000 genome trên một gamđất, nhưng chỉ với 1% trong số đó đã được nuôi cấy [17], [69], [70] Phân tích visinh vật đất được nuôi cấy đã phát hiện ra một nguồn dồi dào các hợp chất có ýnghĩa trong y tế như chất kháng sinh, nhân tố kháng ung thư, chất ức chế miễndịch [53] và rất

nhiều các sản phẩm có ý nghĩa công nghệ sinh học khác [34], [58], [65], [71] Tuynhiên, phương pháp tiếp cận phụ thuộc vào vi sinh vật nuôi cấy bị giới hạn vì đa số

vi sinh vật đất không thể nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy thông thường trongphòng thí nghiệm Một khối lượng khổng lồ thông tin di truyền vẫn còn nằm trong

vi sinh vật chưa được nuôi cấy và metagenomics là công nghệ chìa khóa để xâmnhập vào nguồn tài nguyên quý giá và giàu tiềm năng này [30], [52] Phương pháptiếp cận này cho phép nghiên cứu sự đa dạng di truyền phổ rộng của mỗi gene đơn

và các sản phẩm của nó cũng như là phân tích toàn bộ operon mã hóa cho các conđường sinh tổng hợp hoặc phân giải Metagenomics cho phép chúng ta trả lời cáccâu hỏi chìa khóa về hệ sinh thái vi sinh nhờ việc kết nối chức năng tiềm tàng tớicác vi sinh vật đặc biệt trong các quần thể vi sinh vật đất đa loài

Trong số các phương pháp được thiết kế để thâm nhập ở mức độ di truyềncủa vi sinh vật chưa được nuôi cấy, thì metagenomics nổi lên như một công cụ hữuhiệu nhất Thuận lợi của phương pháp này là phân tích dựa trên trình tự và chứcnăng trong các mẫu nghiên cứu từ nước, đất và vật chủ eukaryotes Ý tưởng cloningtrực tiếp ADN từ mẫu môi trường lần đầu tiên được đề xuất bởi Schmidt (1991) vàtiếp theo là việc xây dựng các thư viện metagenomics ADN từ hỗn hợp vi sinh vậtđược làm giàu từ cỏ khô trong phòng thí nghiệm Sau đó là các thư việnprokaryotes từ nước biển [63] Một clone có kích thước 40 kb được xác định từ thưviện này có chứa gene

16S rARN có nguồn gốc từ vi khuẩn cổ chưa được nuôi cấy trước đây [30] Các kếtquả nghiên cứu metagenomics hệ vi sinh vật từ bọt biển đã chỉ ra rằng chúng mangcác gene và nhóm gene đặc biệt cho việc tổng hợp các chất tự nhiên có hoạt tínhsinh học [38] Một số lipase mới cũng được phát hiện và phân tích từ việc sàng lọcthư viện metagenomics [31], [44] Năm 2007, Martin-Cuadrado và cộng sự đã xâydựng thư viện metagenomic của fosmid từ các sinh vật phù du sâu 3000 m ở biểnMediterranean Kết quả phân tích 16S rARN cho thấy cấu trúc quần thể này tươngđồng với quần thể được tìm thấy trong đới thiếu ánh sáng của Thái Bình Dương.Gene liên quan đến trao đổi chất, vận chuyển, phân giải các hợp chất hữu cơ phứctạp cũng có sự tương đồng với hệ sinh vật dị dưỡng ở các vùng biển sâu Gilbert vàcộng sự (2010) đã phân tích dữ liệu metagenomics và metatranscriptomics ở nước

bề mặt ở

trạm quan trắc Western Channel Observatory (Mỹ) [28] Kết quả cho thấy cấu trúctheo mùa của các phức hệ vi sinh vật với sự đa dạng tương quan với độ dài củangày Nhóm tác giả đã tạo ra 8 metagenomes (4.5 triệu trình tự, 1,9 Gbp, vớikhung đọc trung bình khoảng 350 bp) và 7 metatranscriptomes (392.632 trình tựmARN, 159

Mbp, với khung đọc trung bình khoảng 272 bp) Dữ liệu này đã chứng minh được sựkhác biệt rõ ràng giữa tiềm năng di truyền và thực tế Quần thể vi sinh vật trên bề

mặt của con trai (Mytilus californianus) ở đảo Tatoosh (Washington) cũng đã được

Pfister và cộng sự (2010) nghiên cứu để kiểm tra sự có mặt của hệ vi sinh vật nitơ[53] Kết quả phân tích trình tự của khoảng 31 triệu bp từ 6 mẫu trai đã chỉ ra một

sự đa dạng phong phú của các quần thể vi khuẩn và vi khuẩn cổ Một phần trămprotein được xác định từ mỗi mẫu có liên quan đến chu trình nitơ, vượt xa so với

các mẫu metagenomics từ nước biển Đĩa Hirudo verbana, loài động vật có ý nghĩa

trong y học, cũng đã được Bomar và cộng sự (2011) sử dụng công nghệmetatranscriptomics để nghiên cứu phức hệ vi sinh vật trong ruột của chúng [7].Thông tin phân tích dữ liệu từ nghiên cứu này đã được sử dụng để thiết kế các loạimôi trường tối ưu để nuôi cấy một số vi sinh vật có ý nghĩa y học trong ruột củachúng Thông qua việc nuôi cấy này, một số enzyme và protein có giá trị đã đượcphân lập và xác định hoạt tính Ghai và cộng sự (2011) lần đầu tiên nghiên cứu hệ visinh vật ở sông Amazon sử dụng công nghệ metagenomics [27] Kết quả phân tích

đã chỉ ra rất nhiều đặc điểm chung với các phức hệ vi sinh vật trong các vùng nướcngọt khác (Hồ Gatun ở Panama), tuy nhiên có rất ít tương đồng với các mẫu đượcthu từ biển

Hơn hai thập kỷ qua, vi sinh vật trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản cũng

đã được nghiên cứu để điều chỉnh, tác động và kiểm soát các hệ thống này Vi sinhvật rất phong phú trong hệ sinh thái nuôi trồng thủy sản và phát tán cả chiều rộng vàchiều sâu trong tất cả các hệ thống nuôi trồng thủy sản cũng như bề mặt trầm tích

Hệ vi sinh vật này cũng đóng một vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa ởquy mô nhỏ và toàn cầu, cấu trúc quần thể, di chuyển gene, sự tiến hóa của sinh vậtbiển… thậm chí là trong chu kỳ carbon, chu kỳ dinh dưỡng của các vật liệu hữu cơ.Các nghiên cứu metagenomics cho thấy có những nhóm phân bố toàn cầu, nhưnggenome của chúng chứa đựng thông tin về trình tự không tương đồng với các trình

tự đang

tồn tại trong các cơ sở dữ liệu tin sinh học [35], [40], [51], [80] Phân tích dữ liệutrình tự metagenomics vi sinh vật từ chương trình thám hiểm đại dương (GOS),Williamson và cộng sự (2008) đã phát hiện ra một sự phong phú về nguồn genevirus, khoảng 3% trong tổng số protein được dự đoán, trong đó có hàng nghìn gene

mã hóa cho các chức năng tế bào và trao đổi chất khác nhau [80] Djikeng và cộng

sự (2009) nghiên cứu ARN virus trong hồ nước ngọt Lake Needwood, Maryland,USA đã chỉ ra rằng, cũng giống như các nghiên cứu về môi trường trong các thủyvực khác, phần lớn trình tự axit nucleic được phát hiện không chỉ ra sự khác biệt ýnghĩa với các trình tự đã biết [20] Tuy nhiên, các trình tự còn lại chỉ giống nhaukhoảng 30% Từ kết quả này, nhóm tác giả giả thuyết rằng các virus mới này có thểnhiễm vào các vật chủ khác nhau như thực vật, côn trùng, cá, vật nuôi và con người.Trong số đó có các virus dsARN chưa từng được xác định Kết quả nghiên cứu nàycũng đưa ra giả thuyết do sự tiếp xúc trực tiếp của con người, vật nuôi và động vật,

hệ sinh thái nước ngọt có thể là một nguồn đa dạng virus (cả gây bệnh và không gâybệnh) và có thể là một nguồn phát sinh các đại dịch Bên cạnh đó virus trong cácnguồn khác cũng đã được nghiên cứu chi tiết, điển hình là năm 2011, Park và cộng

sự đã sử dụng công nghệ metagenomics và pyrosequencing để phân tích quần thểvirus chưa được nuôi cấy từ ba nguồn thức ăn lên men là tôm, kimchi và dưa cải[51] Kết quả thu được 81.831 trình tự virus từ mẫu tôm, 70.591 trình tự từ mẫukimchi và 69.464 trình tự từ mẫu dưa Kết quả nghiên cứu này cho thấy thực phẩmlên men có chứa ít phức hệ virus hơn các quần thể trong môi trường sống khác nhưnước biển, trầm tích biển và đất.Trong tổng kết của Alavandi và Poornima (2012),nhiều virus mới đã được phát hiện gần đây trong các lĩnh vực sinh học biển sử dụngcông nghệ metagenomics [4] Từ đó đã có một số phát hiện mới như loàipicornavirus (SePV1) chỉ có 19.3-30.0% trình tự protein tương đồng trong

3D polymerase của SePV1 so với những picornavirus khác thường xuất hiện trênloài Phoca hispida, một loài động vật có vú ở Bắc cực Tornovirus trên rùa biển(WTTV1) và anellovirus trên hải cẩu California (ZcAV) có một sự tương đồngtrong trình tự genome rất ít so với những virus đã được xác định trước đó SWTV1được phát hiện từ fibropapilloma ở một con rùa biển Florida, có genome mạch đơngồm 1.800 nucleotide với sự tương đồng amino acid rất thấp so với virus gâythiếu máu gà

(chicken anemia virus) ZcAV là một anellovirus phát hiện trong phổi của một conhải cẩu California chết vì bệnh phổi, có một genome mạch chuỗi đơn gồm 2.140nucleotide với 35% trình tự amino acid trên ORF1 giống với anellovirus ở mèo Gầnđây, một circovirus và hai nodavirus mới đã được phát hiện trên loài tôm hoang dại

Penaeus duorum ở Florida sử dụng công nghệ metagenomic giải trình tự ADN và

ARN của những loài virus này Circovirus ở trên tôm có genome ADN dài 1955nucleotide và chỉ tương đồng 50% khi so với bất kỳ loài virus nào trên ngân hànggen Tất cả các loài circovirus được biết trước đó đều gây bệnh trên chim, lợn, và cónhánh phân loại riêng biệt so với các circovirus trên gia cầm hay lợn, làm cho loàicircovirus trên tôm được xem là loài mới lần đầu tiên phát hiện trên một động vậtkhông xương sống Hai loài nodavirus mới, có độ tương đồng amino acid nhỏ hơn60% so với các nodavirus khác, được xem là những loài virus mới, cũng đã đượcphát hiện trên tôm Trong một mô hình nuôi thủy sản của Sritunyalucksana và cộng

sự, họ đã sử dụng metagenomics để xác định trình tự loài Laem Singh virus (LSNV)kết hợp với hội chứng sinh trưởng kém của loài tôm sú và virus mới đã được xem làmột ARN virus có độ tương đồng trình tự amino acid thấp trong RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) so với những virus khác trong họLuteoviridae Theo Min-Soo Kim và cs (2013), ngày càng có nhiều các nghiên cứu

về metagenomic virus kể từ khi có những hướng nghiên cứu mới mở ra như sinhthái virus với hơn 200 công trình (61 bài tổng quan) đã được xuất bản [48] Phântích trình tự nucleotide thu được từ metagenomics cho thấy rằng phần lớn các trình

tự trong metagenome của virus biển là không giống với bất kỳ gen nào trong ngânhàng gen Như vậy, có rất nhiều các virus trong môi trường sống còn chưa được xácđịnh Cyrielle Jan và cs (2014) đã sử dụng công nghệ metagenomics để phân loại đadạng ở mức độ họ hoặc cao hơn từ mẫu tôm thu tại ngư trường dòng hải lưu nước

ấm Rainbow dựa trên trình tự 16S rARN cho thấy rằng một số lượng lớn các trình

tự này có thể xếp vào nhóm vi khuẩn (84%), còn lại có thể là Eukarya (14%, có thể

là R exoculata) và Archaea (2%) Hầu hết các vi khuẩn được xếp vào nhóm

Gammaproteobacteria (30%), Alphaproteobacteria (4%), Zetaproteobacteria

(2.2%), Betaproteobacteria (1.6%) và Deltaproteobacteria

(1.0%) Nghiên cứu các gen chức năng từ cơ sở dữ liệu metagenomics này đã chothấy có nhiều gen tham gia vào các quá trình cố định carbon, chuyển hóa sulfur, sắt,đồng hóa nitrogen, khử nitrate …giúp cho việc cải thiện môi trường, tạo nguồn dinhdưỡng cho tôm.

Sử dụng kỹ thuật công nghệ metagenomics, cấu trúc hệ vi sinh vật trongnhiều mô hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã được xác định như nuôi tôm hùm

đá nhiệt đới (Panulirus ornatus) ở Australia in Australia, tôm thẻ chân trắng (L vannamei) ở Mỹ; tôm sú châu Á (L monodon) ở Thái Lan; cá Tuyết Atlantic (G morhua L.) ở Nauy; cá chép cỏ (C idellus), tôm (L vannamei, P orientalis), bào ngư (H diversicolor) ở Trung Quốc [36], [61], [73], [84], [85].

Công nghệ metagenomics cũng đã được sử dụng để xác định sự đa dạng quần

xã sinh vật trong môi trường nước nuôi tôm, sự khác biệt về thành phần vi sinh vậtcủa tôm khai thác tự nhiên và tôm nuôi trồng, đặc điểm thành phần vi sinh vật ruộttôm và chế độ ăn cho tôm thẻ chân trắng [25], [32], [68], [85] Năm 2014, Yuyi và

cs đã nghiên cứu hệ vi sinh vật trong hệ thống đầm nuôi tôm thẻ chân trắng

(Litopenaeus vannamei) [83] Kết quả phân tích 18.427 đoạn trình tự đã cho thấy nhóm vi khẩn chiếm ưu thế thu từ vùng nước ấm là Actinobacteria, vi khuẩn không xác định, Proteobacteria và Bacteroidetes, tương ứng 53,5%, 22,4%, 18,8% và 4,32% Nhóm các vi khuẩn chiếm thiểu số bao gồm Cyanobacteria/Chloroplast (0,289%), Firmicutes (0,265%), Gemmatimonadetes (0,203%) và Acidobacteria (0,109%), Fibrobacteres (0,0078%), Fusobacteria (0,0055%), Spirochaetes (0,0078%), và Verrucomicrobia (0,0078%) Trong khi đó, nhóm vi khẩn chiếm ưu thế thu từ vùng nước lạnh là Actinobacteria (41,80%), Proteobacteria (39,52%) và

Bacteroidetes (17,29%) Nhóm các vi khuẩn chiếm thiểu số bao gồm Cyanobacteria/Chloroplast (0,195%), Deferribacteres (0,04%), Firmicutes (0,05%)

và Gemmatimonadetes (0,017%) Nhóm vi khuẩn không xác định chỉ chiếm 1,07%.

Năm 2017, Fern a nda v à cộng sự đã đánh giá sự khác biệt thành phần vikhuẩn trong gan tụy và ruột của tôm thẻ chân trắng trong tự nhiên, trong điều kiệnnuôi trồng và tôm nuôi trồng có triệu chứng bệnh EMS/AHPND [25] Kết quả chothấy có sự khác nhau về thành phần vi khuẩn và chức năng dự đoán của vi khuẩntrong gan tụy

và ruột của tôm tự nhiên và tôm nuôi trồng; và thành phần vi khuẩn trong gan tụy vàruột của mỗi mẫu tôm từ các điều kiện khác nhau là khác nhau; có sự tương đồnggiữa thành phần vi sinh vật trong ruột tôm nuôi trồng và lớp bùn lắng trong đầm

nuôi; và nhóm tác giả nhận thấy rằng, các loài như Faecalibacterium prausnitzii and Pantoea agglomerans chiếm thành phần lớn trong gan tụy và ruột tôm nuôi khỏe mạnh, và Aeromonas taiwanensis, Simiduia agarivorans và Photobacterium

angustum là loài chiếm ưu thể trong gan tụy và ruột tôm nuôi bị bệnh.

Các kết quả phân tích từ cơ sở dữ liệu metagenome còn được sử dụng để tìm

ra và sau đó tiến hành phân lập các gen liên quan đến chuyển hóa chất trong môitrường nuôi và trong ruột tôm Gao và cs (2018) đã xác định được các gen liên quanđến các enzyme tiêu hóa trong ruột tôm chủ yếu là từ hai chi

Vibrio và Pseudoalteromonas [26] Từ đó, cung cấp thông tin có giá trị trong sàng

lọc các chủng probiotic và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

1.3.3 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next generation sequencing – NGS)

và hệ thống giải trình gen thế hệ mới Illumina

1.3.3.1 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Vào những năm 1970, sự ra đời của phương pháp giải trình tự ADN bằngchuỗi tổng hợp của Sanger và cộng sự đã khởi đầu cho sự phát triển công nghệ giảitrình tự gen Tiếp đó, vào những năm 2000, dự án Giải trình tự bộ gen người doVIện Nghiên cứu hệ gen người quốc gia (NHGRI- Hoa Kỳ) khởi động với sự hợptác của 15 quốc gia đã đạt được những thành tựu bước đầu với chi phí đắt đỏ, tiêutốn nhiều thời gian và nguồn lực Và sự ra mắt của nền tảng giải trình tự hiệu năngcao đầu tiên đã làm giảm 50.000 lần giá thành giải trình tự hệ gen so với chi phítrước đó của Dự án giải trình tự bộ gen người Từ đó, cụm từ “Công nghệ giải trình

tự gen thế hệ mới” ra đời gắn với cột mốc này Và trong vòng một thập kỷ trở lạiđây, công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới vẫn tiếp tục phát triển, tăng lưu lượng

xử lý lên 100 – 1000 lần, và giúp giảm đáng kể giá thành giải trình tự gen Tính từthời điểm ra đời, công nghệ giải trình tự gen đã phát triển qua ba thế hệ, và hiện nayđang phát triển đến công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ tư Cụ thể, giải trình tựgen theo phương pháp của

Sanger, dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp chuỗi ADN bằng dideoxynucleotide , làcông nghệ giải trình gen thế hệ thứ nhất; công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ haibao gồm các phương pháp Pyrosequencing: đo lượng PPi giải phóng trong phản ứngtổng hợp chuỗi ADN, phương pháp Ion Semiconductor: đo tín hiệu ion H+ giảiphóng ra trong phản ứng tổng hợp chuỗi ADN, và phương pháp của Illumina: đo tínhiệu từng loại huỳnh quang gắn vào nucleotide trong phản ứng tổng hợp chuỗiADN; công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ ba dựa trên các kỹ thuật phân tích tínhiệu đơn phân tử Phân tích tức thời tín hiệu đơn phân tử huỳnh quang gắn vàonucleotide trong phản ứng tổng hợp 1 chuỗi ADN trong lỗ nano.

1.3.3.2 Công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina

Về cơ bản, công nghệ giải trình tự gen thế hệ thứ hai của Illumina bao gồmbốn bước, cụ thể là bước 1: tạo thư viện bằng cách cắt ADN genome thành cácmảnh ADN và chọn lọc các mảnh ADN có kích thước 200-300 bp, sau đó ADNđược xử lý để mặc định gắn thêm 1 A vào đầu 3’ hoặc 5’ của mỗi mạch đơn, tiếp đó

2 loại PE adapter có chữ T nhô ra được nối với ADN đích (PE adapter) PE adapter

có vùng bám cho mồi PCR vì thế cho phép khuếch đại ADN đích với mồi mà ở đầu5’ có gắn thêm trình tự Index2-P5 và Index1-P7 (có thể chỉ cần 1 Index cũng được).(tổng cộng phần gắn thêm khoảng 60 nu); bước 2: polony-PCR tạo ra các clusterADN; bước 3: giải trình tự ADN trong từng cluster; và bước 4: ráp nối các đoạntrình tự ghi nhận được và xử lý kết quả Các hệ thống máy cho Illumina Seq baogồm: HiSeq2500, HiSeq3000, HiSeq4000, HiScanSQ, Genome Analyzer Ilx,MiSeq

Trong công nghệ metagenomics, chất lượng ADN đầu vào để giải trình tự cóvai trò quan trọng, ADN được tách chiết phải đại diện cho đầy đủ các vi sinh vật cótrong mẫu cũng như đủ chất lượng cho giải trình tự và xây dựng thư viện Nồng độ

và độ tinh sạch của metagenomic ADN tách từ các sinh vật trong môi trường đạt yêucầu cho giải trình tự thế hệ mới là rất quan trọng Tuy nhiên, metagenomic ADNtách chiết từ môi trường thường chứa các tạp chất như axit humic, và các cơ chấtcủa axit humic, đây là các chất ức chế phản ứng enzyme làm ảnh hưởng đến quátrình giải trình tự ADN [78] Do vậy, một vấn đề vẫn còn vướng mắc trong cácnghiên cứu metagenomics là tách chiết được metagenomic ADN không bị lẫn cáctạp chất Thêm

vào đó, quá trình tách chiết ADN cho giải trình tự metagenome ở các đối tượng khácnhau yêu cầu một protocol riêng biệt cho từng loại mẫu, do đó có nhiều phươngpháp tách chiết ADN khác nhau đã được công bố [11], [19].

Phương pháp tách chiết metagenomic ADN được chia thành 2 bước chính:bước đầu tiên là ly giải tế bào ly giải tế bào vi sinh vật, ở bước thứ 2 là quá trìnhtách chiết và tinh sạch ADN Quá trình ly giải tế bào dựa trên 3 nguyên lý chính làvật lý (sử dụng nhiệt độ, sóng siêu âm, nghiền trong nitơ lỏng, sử dụng hạt bead),hóa học (sử dụng hóa chất như SDS, CTAB, Chelax, PVPP) và enzyme (sử dụngcác enzyme như Lysozyme, Proteinase K) Các phương pháp này có thể được tiếnhành độc lập, nhưng thường được kết hợp với nhau để làm tăng hiệu quả của quátrình tách chiết ADN [49]

Từ những nguyên lý kể trên, nhiều hãng đã phát triển các bộ kit thương mạicho việc tách chiết ADN của hệ vi sinh vật trong môi trường Hai bộ kit thương mạihóa được sử dụng phổ biến trong tách chiết metagenomic ADN là bộ kit PowerSoil™ DNA Isolation (MO-BIO), và bộ kit FastDNA Spin Kit for soil (Qbiogene),chúng dựa trên nguyên lý sử dụng hạt bead để ly giải tế bào kết hợp với ly giảibằng hóa chất, sau đó ADN được tinh sạch qua cột lọc Bộ kit QIAmp DNA StoolMini Kit (QIAgen) cũng là một bộ kit được sử dụng phổ biến trong tách chiếtMetagenomic ADN trên nhiều đối tượng khác nhau Nguyên lý của bộ kit dựa trên

sự kết hợp giữa ly giải bằng enzyme Proteinase K kết hợp với ly giải bằng nhiệt độ.Cũng dựa trên nguyên lý này, bộ kit Metagenomic DNA Isolaion Kit for Water củahãng Epicentre cũng đã được phát triển và thương mại hóa phục vụ tách chiếtmetagenome ADN từ nước (http : / / www.ep i b i o.c om)

Ưu điểm của việc sử dụng kit tách chiết ADN là tiết kiệm thời gian và thuđược ADN có độ sạch cao do ADN được tinh sạch qua cột có gắn màng silica Tuynhiên nhược điểm chính của việc sử dụng kit tách chiết ADN là giá thành và lượngADN thu được thường thấp hơn so với phương pháp phenol-chloroform [33] Hơnnữa, từng loại mẫu lại có một đặc thù nhất định, do đó thì việc áp dụng một phươngpháp tách chiết ADN cho nhiều loại mẫu chưa hẳn đã đem lại hiệu quả tốt nhất

Trong nghiên cứu metagenome hệ vi sinh vật trong môi trường nước, quátrình tách chiết ADN cũng dựa trên các nguyên lý cơ bản kể trên nhưng được chialàm 3 bước: bước đầu tiên là loại bỏ các chất rắn lơ lửng bằng vải lọc hoặc ly tâm.Sau đó là thu các tế bào vi khuẩn thông qua màng lọc Cuối cùng là tách ADN từmàng lọc khuẩn [83] Khó khăn chính trong quá trình tách chiết ADN từ mẫu nước

là lượng sinh khối vi sinh vật thu được ở màng lọc là rất ít, dẫn đến lượng ADN thuđược thường không cao

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tách chiết Metagenomic ADN hệ visinh vật trong môi trường nước nói chung, cũng như trong môi trường nước ở cácđầm nuôi tôm Một số nghiên cứu có thể kể đến như nghiên cứu của Urakawa vàcộng sự năm 2010, với việc sử dụng 3 phương pháp tách ADN từ nước biển khácnhau gồm 2 phương pháp tách chiết sử dụng kit FastDNA Spin kit for soil (MPBiomedicals); kit UltraClean Soil DNA (MO-BIO) và phương pháp tách chiết cònlại sử dụng Phenol-Chloroform Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp táchchiết sử dụng Phenol-chloroform cho hiệu suất thu hồi ADN, tổng lượng ADN và

số bản sao của gen 16S rARN/ng ADN tổng số là cao hơn so với 2 phương pháp sửdụng kit tách chiết [72]

Trong nghiên cứu của Hwang và cộng sự (2012), các tác giả đã so sánh hiệuquả tách chiết ADN hệ vi sinh vật từ màng sinh học (biofilms) hình thành trong hệthống phân phối nước sinh hoạt (DWDS) phục vụ giải trình tự pyrosequencing, với

5 phương pháp khác nhau gồm: 2 phương pháp sử dụng các bộ kit PowerSoil DNAIsolation (MO-BIO); FastDNA Spin Kit for soil (Qbiogene) và 3 phương pháp kháclần lượt được mô tả bởi Miller và cộng sự (1999); Schmidt và cộng sự (1991); Zhou

và cộng sự (1996) [33], [47], [63], [87] Kết quả cho thấy, phương pháp tách ADN

sử dụng bộ kit FastDNA đem lại hiệu quả tách chiết ADN hơn hẳn so với 4 phươngpháp còn lại, mặc dù lượng ADN thu được thấp nhưng phương pháp này loại bỏđược tạp nhiễm gây ức chế phản ứng PCR là axit humics

Trong nghiên cứu metagenome hệ vi sinh vật đường ruột, mẫu ADN tổng số

có nồng độ và độ tinh sạch cao từ các mẫu đường ruột là yêu cầu bắt buộc Tuy nhiên,

hệ vi sinh đường ruột rất phức tạp và chứa rất nhiều vi sinh vật khó ly giải trong quátrình tách chiết [81] Do đó, đã có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới đã tiến hànhtách chiết ADN tổng số từ các mẫu ruột Các phương pháp không sử dụng kit có thể

kể đến như sử dụng các enzyme dung giải, cơ học sử dụng các hạt bead, và hóa học[16], [21], [46], [82] Hàng loạt các bộ kit thương mại đã được ra đời và sử dụngrộng rãi như QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen, Mỹ), FastDNA SPIN kit(Qbiogene, Mỹ), PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio, Mỹ), ZR Fecal DNAMiniPrep (Zymo, Mỹ), PSP Spin Stool DNA Kit (Stratec, Đức) Tuy nhiên, cácphương pháp này cũng đã cho thấy sự hạn chế về mức độ tinh sạch và lượng ADNtổng số sau khi tách chiết không cao Một số nghiên cứu so sánh giữa các phươngpháp đã được các nhóm tác giả thực hiện qua đó làm sáng tỏ hơn ưu nhược điểm củacác phương pháp [81], [86]

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu nước, mẫu ruột tôm thẻ chân trắng thu tại các đầm nuôi bán thâmcanh tôm thẻ chân trắng tại Sóc Trăng được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất phục vụ nghiên cứu

Các hóa chất dùng để tách chiết ADN, ARN và đọc trình tự là: PowerSoil®DNA Isolation Kit - Mo Bio (Mỹ), QIAamp DNA Mini Kit (Đức), agarose, ethanol,chloroform, isopropanol, RevertAid First strand cDNA (Thermo Fisher ScientificInc Singapore), TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit

2.1.3 Thiết bị phục vụ nghiên cứu

Các thiết bị và dụng cụ nghiên cứu được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific, Mỹ), Agilent Bioanalyzer 2100system (Agilent, Mỹ), Máy li tâm Sorvall RT 1900 W (Đức); Nồi khử trùng (NhậtBản); pH kế Melter Toledo (Đức); Máy chạy PCR PTS – 100 (do hãng Nyxtechnik,

Mỹ sản xuất) và PCR – 9700 do hãng Applied Bio system – Mỹ sản xuất;Pipetteman các loại (Đức); Màng lọc polycarbonate membranes 0,8 và 0,22 μm(Millipore, Ireland), Bể ổn nhiệt và một số dụng cụ thông thường của phòng thínghiệm

Máy đọc trình tự Illumina HiSeq (Illumina, San Diego, California, USA);Máy chủ tính toán hiệu năng cao với bộ vi xử lý gồm 24 CPU Intel(R)Xeon(R) CPU X5650 @ 2.67GHz, dung lượng RAM là 188GB, dung lượng lưu trữ

là 8TB và được cấu hình trên hệ điều hành Ubuntu phiên bản 15.04 Vivid với cácphần mềm tin sinh học và thống kê mới nhất

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Phương pháp thu mẫu tôm

Các mẫu tôm được thu ở đầm nuôi tôm bán thâm canh tại các tỉnh Sóc Trăngtrong khoảng thời gian tháng 10-11/2015, bao gồm: đầm nuôi bị bệnh chưa rõnguyên nhân (ST2), và đầm nuôi tôm khoẻ mạnh (ST1) Các đầm nuôi tôm có diệntích trung bình 1 ha và được nuôi với thức ăn thương mại của hãng GroBest (ViệtNam) với thành phần chứa 40% protein, 5% carbohydrate và 3% lipit Các mẫuđược phân loại thành mẫu bệnh và không bệnh dựa trên đặc điểm bệnh dịch bênngoài của tôm như chuyển động chậm và không có thức ăn trong ruột

Phương pháp thu mẫu nước

Nước ở các đầm nuôi tôm được thu ở 5 điểm khác nhau trong đầm bằng cannhựa 10 lít, sau đó được bảo quản với đá lạnh trong quá trình đưa về phòng thínghiệm Các mẫu nước được lọc sơ bộ qua vải lọc kích thước 45 μm để loại bỏ tảo

và các vật chất có kích thước lớn, sau đó tiếp tục được lọc qua các màngpolycarbonate kích thước 0,8 và 0,22 μm (Millipore, Ireland)

2.2.2 Các phương pháp phân tích mẫu nước

Các chỉ tiêu TAN, TSS, NO-3, TN,… thu trong chai nhựa Mẫu được thu tại 3

vị trí theo đường chéo của ao Các chỉ tiêu H2S, DO thu vào chai nút mài nâu và DOđược cố định tại hiện trường bằng 1ml KI – NaOH và 1 ml MnSO4 Tất cả các mẫuđều được ghi chú cẩn thận và được trữ lạnh (<4C) trong suốt quá trình vận chuyển

và phân tích

Tất cả các chỉ tiêu môi trường được phân tích theo phương pháp chuẩn(Andrew, 1995), đang được áp dụng tại phòng phân tích chất lượng nước, khoaThủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

2.2.3 Phương pháp tách ADN

2.2.3.1 Tách metagenomic ADN từ các mẫu ruột

Mẫu ruột được tách bằng ba phương pháp khác nhau nhằm tối ưu hóa quá trình

tách ADN phục vụ giải trình tự metagenome trên các hệ máy giải trình tự thế hệ mới

Phương pháp 1: Sử dụng Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol

Quy trình thực hiện:

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorf

- Hòa tan mẫu trong dung dịch đệm tách chiết (Extract Buffer) với tỉ lệ 100 mgmô/1,2 ml dung dịch đệm.Thành phần dung dịch đệm như sau:

15 phút ở 4oC Chuyến dịch phía trên sang ống Eppendorf mới

- Thêm vào dung dịch mẫu một lượng tương đương về thể tích hỗn hợp dungdịch Phenol: Chloroform : Isoamyl alcohol (25: 24 :1), lắc mạnh, sau đó lytâm ở 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC Hút dịch pha trên (pha nước có chứaADN tổng số) chuyển sang ống Eppendorf mới

- Tiếp tục thêm vào dung dịch một lượng tương đương về thể tích dung dịchChloroform : Isoamyl Alcohol (24 :1), lắc mạnh, sau đó ly tâm ở 14000 v/ptrong 15 phút ở 4oC Hút dịch pha trên (pha nước có chứa ADN tổng số)chuyển sang ống Eppendorf mới

- Tủa ADN bằng Ethanol 100% (cồn tuyệt đối) Bổ sung cồn tuyệt đối với tỉ lệthể tích cồn: mẫu (2:1) Ủ ở -20oC qua đêm Ly tâm 14000 v/p trong 15 phút

ở 4oC Loại bỏ dịch, thu lấy tủa

- Rửa tủa bằng cồn 70% Ly tâm 14000 v/p trong 15 phút ở 4oC Loại bỏ dịch,thu lấy tủa

- Làm khô tủa ADN bằng máy SpeedVac trong 5 phút Sau đó hòa tan lại tủatrong 100 µl H2O tinh sạch Bảo quản ADN ở -20oC Kiểm tra ADN bằngđiện di trên gel agarose 0,8 %

Phương pháp 2: Sử dụng Kit PowerSoil ® DNA Isolation

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống PowerBead

- Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu

- Kiểm tra dung dịch C1 Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trước khi sử dụng

- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn

- Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl

- Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây Ủ ở 4 C trong 5 phút

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l

- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn Ủ ở 4 C trong 5 phút

- Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l

- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex

5 trong giây

- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ởmỗi mẫu

- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột

- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch

- Thêm 100 l đệm C6

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

ADN sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy Nanodrop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC

Phương pháp 3: Kết hợp giữa phương pháp tách tay và sử dụng bộ Kit thương mại

- Dùng dao tách 200 mg - 300 mg phần ruột tôm chuyển sang ống Eppendorfsạch.

- Dẫn dung dịch PBS 1X vào mỗi ống tới 2 ml

- Ly tâm 700 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ cặn lắng Dùng pipet nhẹ nhànghút phần dịch sang ống eppendorf mới Lặp lại 1-2 lần cho tới khi không thấycặn tủa

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu tủa

- Kiểm tra dung dịch C1 Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60C cho đến khi tan trướckhi sử dụng

- Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn

- Vortex 5-10 phút ở tốc độ tối đa

- Ly tâm 10.000 x g trong 1 phút ở nhiệt độ phòng

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml với thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl

- Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây Ủ ở 4  C trong 5 phút

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

- Chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không vượt quá 600 l

- Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn Ủ ở 4  C trong 5 phút

- Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

- Chuyển dich nổi vào ống 2 ml không vượt quá 750 l

- Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex

5 trong giây

- Chuyển lần lượt 675 l lên cột tách và ly tâm tại 10.000 x g trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch chảy qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch ởmỗi mẫu

- Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột

- Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.

- Chuyển cột tách sang ống 2 ml sạch

- Thêm 100 l đệm C6

- Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút tại 10.000 x g.