Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn và enzyme thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LƢU HÀN LY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LƢU HÀN LY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học TS Đỗ Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Lai Thành Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Lƣu Hàn Ly LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội trang bị kiến thức cho suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Huyền – Viện Công nghệ Sinh học PGS.TS Nguyễn Lai Thành – Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hoàn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Xin cảm ơn đề tài Độc lập cấp nhà nước mã số ĐTĐLCN.15/14: “Nghiên cứu metagenome số hệ sinh thái mini tiềm nhằm khai thác gen mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu lignocellulose" Viện Cơng nghệ sinh học chủ trì, Bộ Khoa học Công nghệ chủ quản hỗ trợ phương diện để thực nghiên cứu Tơi xin cảm ơn cán Phịng Kĩ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh học tạo điều kiện, giúp đỡ cho tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Học viên Lƣu Hàn Ly năm BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA Acid deoxyribonucleic RNA Acid ribonucleic PCR Polymerase chain reaction CBM Carbohydrate binding module GH Glycosyl hydrolase CE Carbohydrate esterase PL Polysaccharide lyase ORF Open reading frame KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes COG Cluster of Orthologous Groups CAZy Carbohydrate-Active enZYmes GO Gene Ontology OTUs Operation taxonomic units i MỤC LỤC BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Lignocellulose hệ enzyme phân giải lignocellulose 1.1.1 Cấu trúc lignocellulose 1.1.1.1 Cellulose 1.1.1.2 Hemicellulose 1.1.1.3 Lignin 1.1.2 Hệ enzyme phân giải lignocellulose 1.2 1.1.2.1 Enzyme tiền xử lý 1.1.2.2 Hemicellulase 1.1.2.3 Cellulase 1.1.2.4 Hoạt động cellulosome Hệ vi sinh vật cỏ dê - nguồn khai thác lignocellulase tiềm 11 1.2.1 Cấu trúc hệ tiêu hóa dê 11 1.2.2 Hệ vi sinh vật cỏ động vật nhai lại 12 1.2.3 Enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật cỏ 16 1.3 Metagenomics 19 1.3.1 Khái quát phương pháp metagenomics 19 1.3.2 Các phương pháp tiếp cận tìm gen Metagenomics 19 1.3.2.1 Phân lập gen từ thư viện DNA metagenome 20 1.3.2.2 Khai thác phân lập gen từ liệu trình tự DNA metagenome 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU-PHƢƠNG PHÁP 22 2.1 Đối tƣợng 22 2.2 Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Thiết bị 22 ii 2.2.2 Dụng cụ vật tư tiêu hao 22 2.2.3 Hóa chất sử dụng 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp tách chiết tinh 23 2.3.1.1 Phương pháp thu mẫu vi khuẩn từ mẫu dịch cỏ dê 23 2.3.1.2 Phương pháp tách chiết tinh DNA metagenome 24 2.3.1.3 Phương pháp kiểm tra chất lượng DNA metagenome 25 2.3.2 Phân tích khai thác liệu DNA metagenome công cụ tin sinh 27 2.3.2.1 Giải mã lắp ráp hệ gen 27 2.3.2.2 Dự đoán chức gen 27 2.3.2.3 Phân tích thống kê 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 29 3.1 Tách chiết tinh DNA metagenome hệ vi sinh vật cỏ dê 29 3.1.1 Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome 29 3.1.2 Tách chiết DNA metagenome 32 3.2 Phân tích liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn cỏ dê 33 3.3 Đa dạng hệ vi khuẩn cỏ dê 36 3.4 Đa dạng hệ enzyme phân giải lignocellulase từ vi khuẩn cỏ dê 43 3.4.1 Đa dạng enzyme tiền xử lý liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 44 3.4.2 Đa dạng enzyme hemicellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 45 3.4.3 Đa dạng enzyme cellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 48 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thành phần cấu trúc lignocellulose [75] Hình 1.2 Cấu trúc phân tử lignin [65] Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống enzyme tham gia thủy phân hemicellulase hoàn toàn Hình 1.4 Sơ đồ hoạt động enzme tham gia thủy phân hồn tồn cellulose Hình 1.5 Cấu trúc cellulosome C thermocellum [1] 10 Hình 1.6 Cấu trúc hệ tiêu hóa dê 12 Hình 3.1 So sánh DNA metagenome thu từ phương pháp tách chiết khác 31 Hình 3.2 Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA mẫu DNA thu từ phương pháp tách chiết khác 31 Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome tách chiết tinh PSP kit 32 Hình 3.4 Thành phần liệu thơ DNA metagenome 34 Hình 3.5 Đồ thị phân bố chiều dài đoạn contig 34 Hình 3.6 Thành phần ngành vi khuẩn liệu DNA metagenome cỏ dê37 Hình 3.7 Thành phần vi khuẩn có khả thủy phân lignocellulose có mặt liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 41 Hình 3.8 Thành phần enzyme lignocellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 44 Hình 3.9 Thành phần họ enzyme tiền xử lý liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 45 Hình 3.10 Thành phần họ enzyme hemicellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 46 Hình 3.11 Thành phần họ enzyme cellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 49 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần số loại phế phẩm phụ lignocellulose [78] Bảng 2.1 Các thiết bị nghiên cứu sử dụng đề tài 22 Bảng 2.2 Các phương pháp tách chiết DNA sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Trình tự mồi 16S rDNA 26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Bảng 3.1 Nồng độ độ tinh DNA metagenome sử dụng phương pháp tách chiết khác 29 Bảng 3.2 Kết đo quang phổ 33 Bảng 3.3 Thành phần hệ vi sinh vật cỏ dê 35 Bảng 3.4 Số lượng ORFs phù hợp với sở liệu khác 35 Bảng 3.5 Đa dạng sinh vật (đã định loại) cỏ dê 36 Bảng 3.6 Các loài vi khuẩn có khả tham gia thủy phân lignocellulose có mặt liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê 39 v MỞ ĐẦU Ngày nay, nhân loại phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch hệ nghiêm trọng việc tích tụ khí thải nhà kính Do đó, việc nghiên cứu sử dụng nguồn lượng carbonhydrate có khả tái tạo cần thiết Một nguồn carbohydrate dồi Trái Đất lignocellulose, tận dụng từ phế thải nông nghiệp cây, rơm rạ, bã mía…Ở Việt Nam, lượng rơm rạ hàng năm đạt khoảng 30-40 triệu lượng nhỏ sử dụng làm phân bón sinh học, sản xuất nấm ăn chủ yếu đốt bỏ cánh đồng gây lãng phí ảnh hưởng xấu đến mơi trường Vì vậy, việc chuyển hóa chúng thành sản phẩm có giá trị khơng giảm thiểu nhiễm mơi trường mà cịn góp phần giải nhu cầu lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập chỗ cho nông dân Tuy việc tận dụng nguồn lignocellulose có nhiều ưu điểm thực tế, việc chuyển hóa lignocellulose cơng nghiệp chủ yếu phương pháp vật lý hóa học phức tạp, có giá thành cao chưa thực hiệu khó xử lý chất thải hóa học Do đó, việc khai thác enzyme phân giải lignocellulose nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Hệ vi sinh vật cỏ động vật nhai lại nguồn khai thác enzyme tiềm Nhiều gen mã hóa cho hệ enzyme tìm thấy nhiều hệ tiêu hóa dê với gen mã cho yếu tố quan trọng cấu thành hệ phân giải cellulosome Từ đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn enzyme thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome vi khuẩn cỏ dê” với mong muốn khai thác enzyme lignocellulose có hiệu phân giải cao 3.4.3 Đa dạng enzyme cellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê Kết phân tích liệu DNA metagenome cho thấy 816 ORFs mã cho enzyme thủy phân cellulose, thuộc 11 họ GHs (Hình 3.11) Các trình tự cellulase tìm thấy chủ yếu thuộc họ GH3 với 400 ORFs, họ GH5 với 189 ORFs Cellulase GH5 xác định họ cellulase phổ biến sản xuất loài vi khuẩn cỏ ni cấy được, ví dụ cellulase GH5 từ F succinogenes chiếm khoảng 50% cellulase tổng số có hệ gen chúng [59], từ vi khuẩn cỏ không nuôi cấy [30] Mặc dù vậy, số lượng cellulase GH5 dự đoán liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê khơng phải nhóm chiếm ưu Điều cho thấy, cellulase từ vi khuẩn cỏ dê có điểm khác biệt với nhóm từ động vật nhai lại khác cần nghiên cứu sâu Cùng đối tượng dê, đối chiếu với nghiên cứu nhóm Hàn Quốc, chúng tơi nhận thấy kết phân tích gen mã cho cellulase hai liệu có số nhóm GH cellulase tương đồng sau: Họ cellulase GH8, GH44 GH48 có mặt hai liệu Đồng thời, số lượng ORFs họ GH tìm thấy liệu nhóm tương đương với Có thể nhóm cellulase ln có mặt ổn định cỏ dê, khơng phụ thuộc vào phân vùng địa lý vật chủ Mặt khác, có nhóm GHs chung hai liệu lại có khác đáng kể số lượng trình tự Có thể kể đến họ cellulase GH9, GH44, GH10 GH5 xuất liệu DNA metagenome dê Việt Nam Hàn Quốc số trình tự cellulase GH9, GH44 GH10 có liệu chúng tơi so với nhóm nghiên cứu nước bạn số lượng GH5 liệu dê Việt Nam có lại cao rõ ràng, gấp 6,4 lần liệu họ 48 Hình 3.11 Thành phần họ enzyme cellulase liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê Trong liệu, enzyme thuộc họ GH5, GH8 GH9 có hoạt tính endoglucanase; GH3 chủ yếu β-glucosidase GH16 có khả phân giải lichenin cắt mạch 1,3-β -D-glucose Dựa theo chức gen, trình tự dự đốn mã cho β-glucosidase có số lượng nhiều (219 ORFs) Tuy nhiên, enzyme đa dạng số họ enzyme endoglucanse, thuộc họ GHs: GH5, GH8 GH9 Các cellulase sử dụng nhiều công nghiệp thực phẩm Endo- exo-glucanase làm tăng cường q trình dịch hóa chế biến rươu bia endoglucanse GH48 ứng dụng sản xuất bột thực phẩm, tinh chất dầu oliu, nước ép hoa màu thực phẩm [83] Trong sản xuất cồn sinh học, yếu tố hạn chế chuyển hóa cellulose thành glucose ức chế cellulase oligosacchatide thiếu hụt enzyme β-glucosidase từ sinh vật dùng để phân giải sinh khối Do đó, việc nghiên cứu sản xuất enzyme β-glucosidase cần thiết cho hiệu chuyển hóa cao Ngồi ra, có hàng trăm tiền chất mùi vị β-glucosidic thực vật bổ sung β-glucosidase có khả làm tăng hương vị đồ uống thực phẩm làm từ loại thực vật Hơn nữa, β-glucosidase giúp tăng hàm lượng dinh dưỡng thực phẩm sản phẩm trình thủy phân cịn có 49 loại vitamin, chất chống oxy hóa nhiều hợp chất có lợi khác nên cịn dùng để xử lý thức ăn chăn nuôi [11] Như vậy, liệu chúng tơi có đầy đủ enzyme cellulase thường sử dụng công nghiệp nên tiềm ứng dụng enzyme khai thác từ liệu lớn So sánh hai liệu DNA metagenome vi khuẩn dê Việt Nam Hàn Quốc, số họ cellulase có Việt Nam khơng có liệu Hàn Quốc ngược lại Nhóm nghiên cứu Hàn Quốc phân tích liệu phát endoglucanse GH45 cellobiose hydrolase (CHB) Dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê Việt Nam khơng có hai nhóm enzyme có độ đa dạng nhóm endoglucanase, β-glucosidase, 6-phospho-β-glucosidase, βglucosidase-related glycosidase, cellobiose phosphorylase, glucan endo-1,3-β-Dglucosidase licheninase thuộc họ GH1, GH16, GH3, GH64, GH74 với tổng cộng 453 ORFs Một điều đáng ý liệu nhóm Hàn Quốc có kích thước lớn (khoảng 2,4 lần) số lượng ORFs mã cho cellulase thu 749, cao nhóm Hàn Quốc với 687 gen Số lượng độ đa dạng họ gen mã cho cellulase từ hai liệu thực đối tượng tương đối khác biệt củng cố nhận định thành phần số lượng vi khuẩn bị chi phối nhiều yếu tố, từ ảnh hưởng đến hệ enzyme phân giải vi khuẩn 50 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ Kết luận  DNA metagenome tách chiết kit PSP cho sản phẩm DNA có chất lượng đảm bảo cho giải trình tự DNA metagenome hệ thống HiSeq 2000 (Illumina) với số A260/280 1,893; A260/230 1,902 nồng độ cao đạt 195,5 ng/µl.DNA metagenome  Trong liệu DNA metagenome phân tích cỏ dê, 99,8% liệu có nguồn gốc từ vi khuẩn bao gồm 1632 loài thuộc 28 ngành,4 lớp, 95 bộ, 180 họ 569 chi Trong đó, ba ngành chiếm ưu quần xã sinh thái mini Bacteroidetes, Firmicutes Proteobacteria có 32 lồi vi khuẩn nhiều nghiên cứu chứng minh có khả tiết enzyme phân giải lignocellulose  Dữ liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê cho thấy độ phong phú enzyme phân giải lignocellulose với hemicellulase (2252 ORFs), cellulase (821 ORFs) enzyme tiền xử lý (816 ORFs) Đồng thời, liệu bao gồm enzyme tiền xử lý họ CE PL, 20 họ GH hemicellulase cellulase GH1, GH16, GH3, GH64, GH74 không phát liệu dê Hàn Quốc Phát chứng tỏ tính đặc trưng riêng hệ enzyme lignocellulase từ vi khuẩn cỏ dê Việt Nam Kiến nghị  Tiếp tục phân tích sâu tính chất, cấu hình enzyme phân giải lignocellulose Từ lựa chọn gen mã cho enzyme tiềm năng, có tính chất ưu việt để dễ dàng ứng dụng thực tiễn  Tiến hành biểu gen tiềm hệ biểu hiện, đánh giá hoạt tính enzyme chất đặc hiệu 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Akinosho, H., Yee K., Close D., and Ragauskas A (2007), “The emergence of Clostridium thermocellum as a high utility candidate for consolidated bioprocessing applications”, Protein engineering and other bio-synthetic routes for bio-based materials: Current uses and potential applications, pp 92 Alahuhta, M., Chandrayan P., Kataeva I., Adams M.W., Himmel M.E., and Lunin V.V (2011), “A 1.5 Å resolution X-ray structure of the catalytic module of Caldicellulosiruptor bescii family pectate lyase”, Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 67 (12), pp 1498-1500 An, J., Xie Y., et al (2015), “Characterization of a thermostable, specific GH10 xylanase from Caldicellulosiruptor bescii with high catalytic activity”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 117, pp 13-20 Archana, A and Satyanarayana T (1997), “Xylanase production by thermophilic Bacillus licheniformis A99 in solid-state fermentation”, Enzyme and Microbial Technology, 21 (1), pp 12-17 Barros, M and Thomson J (1987), “Cloning and expression in Escherichia coli of a cellulase gene from Ruminococcus flavefaciens”, Journal of bacteriology, 169 (4), pp 1760-1762 Bayer, E.A., Belaich J.-P., Shoham Y., and Lamed R (2004), “The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides”, Annu Rev Microbiol., 58, pp 521-554 Beg, Q., Kapoor M., Mahajan L., and Hoondal G (2001), “Microbial xylanases and their industrial applications: a review”, Applied microbiology and biotechnology, 56 (3-4), pp 326-338 Bekele, A.Z., Koike S., and Kobayashi Y (2010), “Genetic diversity and diet specificity of ruminal Prevotella revealed by 16S rRNA gene-based analysis”, FEMS microbiology letters, 305 (1), pp 49-57 Blumer-Schuette, S.E., Kataeva I., Westpheling J., Adams M.W., and Kelly R.M (2008), “Extremely thermophilic microorganisms for biomass conversion: status and prospects”, Current Opinion in Biotechnology, 19 (3), pp 210-217 10 Breitbart, M., Salamon P., et al (2002), “Genomic analysis of uncultured marine viral communities”, Proc Natl Acad Sci USA, 99 (22), pp 14250-14255 52 11 Cairns, J.R.K and Esen A (2010), “β-Glucosidases”, Cellular and Molecular Life Sciences, 67 (20), pp 3389-3405 12 Carpita, N.C (1996), “Structure and biogenesis of the cell walls of grasses”, Annual review of plant biology, 47 (1), pp 445-476 13 Chassard, C., Goumy V., Leclerc M., Del'homme C., and Bernalier-Donadille A (2007), “Characterization of the xylan-degrading microbial community from human faeces”, FEMS microbiology ecology, 61 (1), pp 121-131 14 Chen, Y.-B., Lan D.-L., Tang C., Yang X.-N., and Li J (2015), “Effect of DNA Extraction Methods on the Apparent Structure of Yak Rumen Microbial Communities as Revealed by 16S rDNA Sequencing”, Polish Journal of Microbiology, 64 (1), pp 29-36 15 Cho, K., Kim S., Woo J., Bok J., and Choi Y (2000), “Molecular cloning and expression of a novel family A endoglucanase gene from Fibrobacter succinogenes S85 in Escherichia coli”, Enzyme and microbial technology, 27 (7), pp 475-481 16 Cunha, I.S., Barreto C.C., et al (2011), “Bacteria and Archaea community structure in the rumen microbiome of goats (Capra hircus) from the semiarid region of Brazil”, Anaerobe, 17 (3), pp 118-124 17 Czerkawski, J.W and Cheng K.J (1988), “Compartmentation in the rumen ”, in The Rumen Microbial Ecosystem, Elsevier Science Publishing, London, pp 361385 18 Dashtban, M., Schraft H., and Qin W (2009), “Fungal bioconversion of lignocellulosic residues; opportunities & perspectives”, International journal of biological sciences, (6), pp 578 19 Davies, G and Henrissat B (1995), “Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases”, Structure, (9), pp 853-859 20 De Souza, W.R (2013), “Microbial degradation of lignocellulosic biomass”, Chandel A, Da Silva, S Sustainable degradation of lignocellulosic biomasstechniques, applications and commercialization Brazil: InTech 21 Ding, S.-Y and Himmel M.E (2006), “The maize primary cell wall microfibril: a new model derived from direct visualization”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (3), pp 597-606 53 22 Dodd, D., Kiyonari S., Mackie R.I., and Cann I.K (2010), “Functional diversity of four glycoside hydrolase family enzymes from the rumen bacterium Prevotella bryantii B14”, Journal of bacteriology, 192 (9), pp 2335-2345 23 Dodd, D., Mackie R.I., and Cann I.K (2011), “Xylan degradation, a metabolic property shared by rumen and human colonic Bacteroidetes”, Molecular microbiology, 79 (2), pp 292-304 24 Dodd, D., Moon Y.-H., Swaminathan K., Mackie R.I., and Cann I.K (2010), “Transcriptomic analyses of xylan degradation by Prevotella bryantii and insights into energy acquisition by xylanolytic bacteroidetes”, Journal of Biological Chemistry, 285 (39), pp 30261-30273 25 Doi, R.H and Kosugi A (2004), “Cellulosomes: plant-cell-wall-degrading enzyme complexes”, Nature Reviews Microbiology, (7), pp 541-551 26 Duan, C.J., Xian L., et al (2009), “Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens”, Journal of applied microbiology, 107 (1), pp 245-256 27 Duncan, S.H., Hold G.L., Barcenilla A., Stewart C.S., and Flint H.J (2002), “Roseburia intestinalis sp nov., a novel saccharolytic, butyrate-producing bacterium from human faeces”, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 52 (5), pp 1615-1620 28 Eriksson, T., Karlsson J., and Tjerneld F (2002), “A model explaining declining rate in hydrolysis of lignocellulose substrates with cellobiohydrolase I (Cel7A) and endoglucanase I (Cel7B) of Trichoderma reesei”, Applied biochemistry and biotechnology, 101 (1), pp 41-60 29 Feng, Y., Duan C.-J., et al (2007), “Cloning and identification of novel cellulase genes from uncultured microorganisms in rabbit cecum and characterization of the expressed cellulases”, Applied microbiology and biotechnology, 75 (2), pp 319328 30 Ferrer, M., Golyshina O.V., et al (2005), “Novel hydrolase diversity retrieved from a metagenome library of bovine rumen microflora”, Environmental Microbiology, (12), pp 1996-2010 54 31 Flint, H.J., Mcpherson C.A., and Bisset J (1989), “Molecular cloning of genes from Ruminococcus flavefaciens encoding xylanase and beta (1-3, 1-4) glucanase activities”, Applied and environmental microbiology, 55 (5), pp 1230-1233 32 Fontes, C.M and Gilbert H.J (2010), “Cellulosomes: highly efficient nanomachines designed to deconstruct plant cell wall complex carbohydrates”, Annual review of biochemistry, 79, pp 655-681 33 Forsberg, C.W., Cheng K.-J., and White B.A (1997), “Polysaccharide degradation in the rumen and large intestine”, in Gastrointestinal microbiology, Springer, pp 319-379 34 Gasparic, A., Marinsek-Logar R., Martin J., Wallace R.J., Nekrep F.V., and Flint H.J (1995), “Isolation of genes encoding β-D-xylanase, β-D-xylosidase and α-Larabinofuranosidase activities from the rumen bacterium Prevotella ruminicola B14”, FEMS microbiology letters, 125 (2-3), pp 135-141 35 Gasparic, A., Martin J., Daniel A.S., and Flint H.J (1995), “A xylan hydrolase gene cluster in Prevotella ruminicola B (1)4: sequence relationships, synergistic interactions, and oxygen sensitivity of a novel enzyme with exoxylanase and beta(1,4)-xylosidase activities”, Applied and environmental microbiology, 61 (8), pp 2958-2964 36 Gibbs, M.D., Reeves R.A., Farrington G.K., Anderson P., Williams D.P., and Bergquist P.L (2000), “Multidomain and multifunctional glycosyl hydrolases from the extreme thermophile Caldicellulosiruptor isolate Tok7B 1”, Current microbiology, 40 (5), pp 333-340 37 Glenn, T.C (2011), “Field guide to next-generation DNA sequencers”, Mol Ecol Resour, 11 (5), pp 759-769 38 Goldbeck, R., Damásio A.R., et al (2014), “Development of hemicellulolytic enzyme mixtures for plant biomass deconstruction on target biotechnological applications”, Applied microbiology and biotechnology, 98 (20), pp 8513-8525 39 Gong, X., Gruninger R.J., et al (2012), “Cloning and identification of novel hydrolase genes from a dairy cow rumen metagenomic library and characterization of a cellulase gene”, BMC research notes, (1), pp 40 Handelsman, J (2004), “Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms”, Microbiol Mol Biol Rev, 68 (4), pp 669-685 55 41 Henderson, G., Cox F., et al (2013), “Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communities”, PLoS ONE, (9), pp e74787 42 Hess, M., Sczyrba A., et al (2011), “Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen”, Science, 331 (6016), pp 463-467 43 Himmel, M.E., Xu Q., Luo Y., Ding S.-Y., Lamed R., and Bayer E.A (2010), “Microbial enzyme systems for biomass conversion: emerging paradigms”, Biofuels, (2), pp 323-341 44 Hogan, M., Schulz M., Slaytor M., Czolij R., and O'brien R (1988), “Components of termite and protozoal cellulases from the lower termite, Coptotermes lacteus froggatt”, Insect biochemistry, 18 (1), pp 45-51 45 Hou, P.-B., Li Y.-Z., Wu B.-H., Yan Z.-C., Yan B.-X., and Gao P.-J (2006), “Cellulolytic complex exists in cellulolytic myxobacterium Sorangium”, Enzyme and microbial technology, 38 (1), pp 273-278 46 Huson, D.H., Richter D.C., Mitra S., Auch A.F., and Schuster S.C (2009), “Methods for comparative metagenomics”, BMC Bioinformatics, 10 Suppl 1, pp S12 47 Jami, E., Israel A., Kotser A., and Mizrahi I (2013), “Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood”, The ISME journal, (6), pp 10691079 48 Jenkins, T., Wallace R., Moate P., and Mosley E (2008), “Board-invited review: Recent advances in biohydrogenation of unsaturated fatty acids within the rumen microbial ecosystem”, Journal of animal science, 86 (2), pp 397-412 49 Jensen, N.S and Canale-Parola E (1986), “Bacteroides pectinophilus sp nov and Bacteroides galacturonicus sp nov.: two pectinolytic bacteria from the human intestinal tract”, Applied and environmental microbiology, 52 (4), pp 880-887 50 Jun, H., Qi M., Ha J., and Forsberg C (2007), “Fibrobacter succinogenes, a dominant fibrolytic ruminal bacterium: transition to the post genomic era”, ASIAN AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES, 20 (5), pp 802 51 Kamra, D (2005), “Rumen microbial ecosystem”, Current science, 89 (1), pp 124135 56 52 Kawai, S., Honda H., Tanase T., Taya M., Iijima S., and Kobayashi T (1987), “Molecular cloning of Ruminococcus albus cellulase gene”, Agricultural and biological chemistry, 51 (1), pp 59-63 53 Khan, A (1980), “Cellulolytic enzyme system of Acetivibrio cellulolyticus, a newly isolated anaerobe”, Microbiology, 121 (2), pp 499-502 54 Kim, M., Morrison M., and Yu Z (2011), “Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes”, FEMS microbiology ecology, 76 (1), pp 49-63 55 Kocherginskaya, S.A., Aminov R.I., and White B.A (2001), “Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis, random sequencing, and statistical ecology approaches”, Anaerobe, (3), pp 119-134 56 Koike, S and Kobayashi Y (2009), “Fibrolytic rumen bacteria: their ecology and functions”, Asian-Aust J Anim Sci, 22, pp 131-138 57 Kontanis, E.J and Reed F.A (2006), “Evaluation of Real‐Time PCR Amplification Efficiencies to Detect PCR Inhibitors”, Journal of forensic sciences, 51 (4), pp 795-804 58 Krause, D., Nagaraja T., Wright A., and Callaway T (2013), “Board-invited review: Rumen microbiology: Leading the way in microbial ecology”, Journal of animal science, 91 (1), pp 331-341 59 Krause, D.O., Denman S.E., et al (2003), “Opportunities to improve fiber degradation in the rumen: microbiology, ecology, and genomics”, FEMS microbiology reviews, 27 (5), pp 663-693 60 Kuhad, R.C., Singh A., and Eriksson K.-E.L (1997), “Microorganisms and enzymes involved in the degradation of plant fiber cell walls”, in Biotechnology in the pulp and paper industry, Springer, pp 45-125 61 Kurakake, M., Ide N., and Komaki T (2007), “Biological pretreatment with two bacterial strains for enzymatic hydrolysis of office paper”, Current microbiology, 54 (6), pp 424-428 62 Lamed, R., Setter E., and Bayer E.A (1983), “Characterization of a cellulosebinding, cellulase-containing complex in Clostridium thermocellum”, Journal of Bacteriology, 156 (2), pp 828-836 57 63 Lee, H., Hamid S., and Zain S (2014), “Conversion of lignocellulosic biomass to nanocellulose: structure and chemical process”, The Scientific World Journal, 2014 64 Leibovitz, E and Beguin P (1996), “A new type of cohesin domain that specifically binds the dockerin domain of the Clostridium thermocellum cellulosome-integrating protein CipA”, Journal of bacteriology, 178 (11), pp 3077-3084 65 Liggenstoffer, A.S., Youssef N.H., Couger M., and Elshahed M.S (2010), “Phylogenetic diversity and community structure of anaerobic gut fungi (phylum Neocallimastigomycota) in ruminant and non-ruminant herbivores”, The ISME journal, (10), pp 1225-1235 66 Lim, S., Seo J., et al (2013), “Metagenome analysis of protein domain collocation within cellulase genes of goat rumen microbes”, Asian-Australasian journal of animal sciences, 26 (8), pp 1144 67 Lynd, L.R., Weimer P.J., Van Zyl W.H., and Pretorius I.S (2002), “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology”, Microbiology and molecular biology reviews, 66 (3), pp 506-577 68 Mai, V., Wiegel J., and Lorenz W.W (2000), “Cloning, sequencing, and characterization of the bifunctional xylosidase–arabinosidase from the anaerobic thermophile Thermoanaerobacter ethanolicus”, Gene, 247 (1), pp 137-143 69 Mcallister, T., Bae H., Jones G., and Cheng K (1994), “Microbial attachment and feed digestion in the rumen”, Journal of animal science, 72 (11), pp 3004-3018 70 Mcgavin, M., Forsberg C., Crosby B., Bell A., Dignard D., and Thomas D (1989), “Structure of the cel-3 gene from Fibrobacter succinogenes S85 and characteristics of the encoded gene product, endoglucanase 3”, Journal of bacteriology, 171 (10), pp 5587-5595 71 Minato, H., Mitsumori M., and Cheng K.-J (1993), “Attachment of microorganisms to solid substrate in the rumen”, in Genetics, Biochemistry and Ecology of Lignocellulose Degradation, K Shimada, S Hoshino, K Ohmiya, K Sakka, Y.Kobayashi, and S Karita, Editors, Uni Publishers, Tokyo, pp 139-145 72 Morrison, M., Nelson K., et al The Fibrobacter succinogenes strain S85 genome sequencing project in Abstr 3rd ASM-TIGR Conf Microb Genomes 2003 58 73 Mussatto, S.I and Teixeira J (2010), “Lignocellulose as raw material in fermentation processes”, Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology (Méndez-Vilas, A., Ed.), 2, pp 897-907 74 Natesh, R., Manikandan K., Bhanumoorthy P., Viswamitra M., and Ramakumar S (2003), “Thermostable xylanase from Thermoascus aurantiacus at ultrahigh resolution (0.89 Å) at 100 K and atomic resolution (1.11 Å) at 293 K refined anisotropically to small-molecule accuracy”, Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 59 (1), pp 105-117 75 Nguyen, N.H., Maruset L., et al (2012), “Identification and characterization of a cellulase-encoding gene from the buffalo rumen metagenomic library”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 76 (6), pp 1075-1084 76 Nigam Ps, G.N., Anthwal A (2009), “Pre-treatment of agro-industrial residues”, in Biotechnology for agro-industrial residues utilization, P.S.n Nigam and A Pandey, Editors, Springer, Netherland, pp 13-33 77 O, M.a.a.G.F (2010), “Metagenome Analysis Introduction to Marine Genomics Advances in Marine Genomics”, in Metagenome Analysis Introduction to Marine Genomics Advances in Marine Genomics, K.T.-R J M Cock, C Boyen and F Viard Editor, Springer Netherlands, Netherlands, pp 33-71 78 Pages, S., Belaich A., et al (1997), “Species-specificity of the cohesin-dockerin interaction between Clostridium thermocellum and Clostridium cellulolyticum: prediction of specificity determinants of the dockerin domain”, Proteins Structure Function and Genetics, 29 (4), pp 517-527 79 Porebski, S., Bailey L.G., and Baum B.R (1997), “Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components”, Plant molecular biology reporter, 15 (1), pp 8-15 80 Ragauskas, A.J., Williams C.K., et al (2006), “The path forward for biofuels and biomaterials”, science, 311 (5760), pp 484-489 81 Rashamuse, K., Visser D., et al (2013), “Characterisation of two bifunctional cellulase–xylanase enzymes isolated from a bovine rumen metagenome library”, Current microbiology, 66 (2), pp 145-151 59 82 Rincon, M.T., Čepeljnik T., et al (2005), “Unconventional mode of attachment of the Ruminococcus flavefaciens cellulosome to the cell surface”, Journal of bacteriology, 187 (22), pp 7569-7578 83 Sathya, T and Khan M (2014), “Diversity of glycosyl hydrolase enzymes from metagenome and their application in food industry”, Journal of food science, 79 (11), pp R2149-R2156 84 Scheller, H.V and Ulvskov P (2010), “Hemicelluloses”, Plant Biology, 61 (1), pp 263 85 Schloss, P.D and Handelsman J (2003), “Biotechnological prospects from metagenomics”, Curr Opin Biotechnol, 14 (3), pp 303-310 86 Shallom, D and Shoham Y (2003), “Microbial hemicellulases”, Current opinion in microbiology, (3), pp 219-228 87 Sheng, T., Zhao L., et al (2016), “Lignocellulosic saccharification by a newly isolated bacterium, Ruminiclostridium thermocellum M3 and cellular cellulase activities for high ratio of glucose to cellobiose”, Biotechnology for Biofuels, (1), pp 172 88 Singh, J., Behal A., et al (2009), “Metagenomics: Concept, methodology, ecological inference and recent advances”, Biotechnology journal, (4), pp 480494 89 Sipat, A., Taylor K., Lo R., Forsberg C., and Krell P (1987), “Molecular cloning of a xylanase gene from Bacteroides succinogenes and its expression in Escherichia coli”, Applied and environmental microbiology, 53 (3), pp 477-481 90 Song, J.-M and Wei D.-Z (2010), “Production and characterization of cellulases and xylanases of Cellulosimicrobium cellulans grown in pretreated and extracted bagasse and minimal nutrient medium M9”, Biomass and bioenergy, 34 (12), pp 1930-1934 91 Sørensen, H.R., Pedersen S., Viksø-Nielsen A., and Meyer A.S (2005), “Efficiencies of designed enzyme combinations in releasing arabinose and xylose from wheat arabinoxylan in an industrial ethanol fermentation residue”, Enzyme and Microbial Technology, 36 (5), pp 773-784 92 Stevenson, D.M and Weimer P.J (2007), “Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by 60 relative quantification real-time PCR”, Applied Microbiology and Biotechnology, 75 (1), pp 165-174 93 Streit, W.R and Schmitz R.A (2004), “Metagenomics the key to the uncultured microbes”, Curr Opin Microbiol, (5), pp 492-498 94 Su, X., Mackie R.I., and Cann I.K (2012), “Biochemical and mutational analyses of a multidomain cellulase/mannanase from Caldicellulosiruptor bescii”, Applied and environmental microbiology, 78 (7), pp 2230-2240 95 Sweeney, M.D and Xu F (2012), “Biomass converting enzymes as industrial biocatalysts for fuels and chemicals: recent developments”, Catalysts, (2), pp 244-263 96 Taherzadeh, M.J and Karimi K (2008), “Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review”, International journal of molecular sciences, (9), pp 1621-1651 97 Talebnia, F., Karakashev D., and Angelidaki I (2010), “Production of bioethanol from wheat straw: an overview on pretreatment, hydrolysis and fermentation”, Bioresource Technology, 101 (13), pp 4744-4753 98 Taniguchi, M., Suzuki H., Watanabe D., Sakai K., Hoshino K., and Tanaka T (2005), “Evaluation of pretreatment with Pleurotus ostreatus for enzymatic hydrolysis of rice straw”, Journal of bioscience and bioengineering, 100 (6), pp 637-643 99 Thomas, T., Gilbert J., and Meyer F (2012), “Metagenomics - a guide from sampling to data analysis”, Microb Inform Exp, (1), pp 100 Touzel, J.P., O'donohue M., Debeire P., Samain E., and Breton C (2000), “Thermobacillus xylanilyticus gen nov., sp nov., a new aerobic thermophilic xylan-degrading bacterium isolated from farm soil”, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 50 (1), pp 315-320 101 Toyoda, A and Minato H (2002), “Cloning, nucleotide sequence and expression of the gene encoding the cellulose-binding protein A (CBPA) of Eubacterium cellulosolvens 5”, FEMS microbiology letters, 207 (2), pp 141-146 102 Ueki, A., Akasaka H., Satoh A., Suzuki D., and Ueki K (2007), “Prevotella paludivivens sp nov., a novel strictly anaerobic, Gram-negative, hemicellulosedecomposing bacterium isolated from plant residue and rice roots in irrigated ricefield soil”, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 57 (8), pp 1803-1809 61 103 Valenzuela, L., Chi A., et al (2006), “Genomics, metagenomics and proteomics in biomining microorganisms”, Biotechnol Adv, 24 (2), pp 197-211 104 Varel, V.H and Dehority B.A (1989), “Ruminal cellulolytic bacteria and protozoa from bison, cattle-bison hybrids, and cattle fed three alfalfa-corn diets”, Applied and environmental microbiology, 55 (1), pp 148-153 105 Venter, J.C., Remington K., et al (2004), “Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea”, Science, 304 (5667), pp 66-74 106 Wei, H., Xu Q., Taylor L.E., Baker J.O., Tucker M.P., and Ding S.-Y (2009), “Natural paradigms of plant cell wall degradation”, Current Opinion in Biotechnology, 20 (3), pp 330-338 107 Weon, H.-Y., Yoo S.-H., et al (2009), “Rudaea cellulosilytica gen nov., sp nov., isolated from soil”, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 59 (9), pp 2308-2312 108 Xu, Y., Duan C., Zhou Q., Tang J., and Feng J (2006), “Cloning and identification of cellulase genes from uncultured microorganisms in pulp sediments from paper mill effluent”, Wei sheng wu xue bao= Acta microbiologica Sinica, 46 (5), pp 783788 109 Xu, Z., Hansen M.A., Hansen L.H., Jacquiod S., and Sorensen S.J (2014), “Bioinformatic approaches reveal metagenomic characterization of soil microbial community”, PLoS ONE, (4), pp e93445 110 Yoda, K., Toyoda A., Mukoyama Y., Nakamura Y., and Minato H (2005), “Cloning, sequencing, and expression of a Eubacterium cellulosolvens gene encoding an endoglucanase (Cel5A) with novel carbohydrate-binding modules, and properties of Cel5A”, Applied and environmental microbiology, 71 (10), pp 57875793 111 Yu, Z and Morrison M (2004), “Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples”, Biotechniques, 36 (5), pp 808-813 112 Zhang, X.Z and Zhang Y.H.P (2013), “Cellulases: characteristics, sources, production, and applications”, Bioprocessing Technologies in Biorefinery for Sustainable Production of Fuels, Chemicals, and Polymers, 1, pp 131-146 113 Zhao, X., Zhang L., and Liu D (2012), “Biomass recalcitrance Part I: the chemical compositions and physical structures affecting the enzymatic hydrolysis of lignocellulose”, Biofuels, Bioproducts and Biorefining, (4), pp 465-482 62 ... dê 33 3.3 Đa dạng hệ vi khuẩn cỏ dê 36 3.4 Đa dạng hệ enzyme phân giải lignocellulase từ vi khuẩn cỏ dê 43 3.4.1 Đa dạng enzyme tiền xử lý liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê ... KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LƢU HÀN LY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME CỦA VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã... cellulosome Từ đó, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu đa dạng hệ vi khuẩn enzyme thủy phân lignocellulose từ liệu metagenome vi khuẩn cỏ dê? ?? với mong muốn khai thác enzyme lignocellulose có hiệu phân giải