Nghiên cứu đa dạng sinh học của hải miên (porifera) tại đảo cồn cỏ, tỉnh

Tuy nhiên, chỉ có một số ít nghiên cứu về hải miên ở biển ViệtNam liên quan tới thành phần loài và phân bố của hải miên tại các vùng biểnthuộc vịnh Nha Trang và vịnh Hạ Long.. Gần đây, c

Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên (Porifera) tại Đảo Cồn

Cỏ, tỉnh Quảng Trị

LÊ THÀNH LONG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Mỹ Linh, người

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình họctập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phan Minh Tuấn và cáccán bộ Phòng Phát triển Công nghệ y sinh, Trung tâm Phát triển công nghệcao, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã t ận tình giúp đỡ và hỗtrợ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ Phòng tài nguyên sinh vật vàPhòng nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thu thập số liệu

và vật liệu nghiên cứu để thực hiện luận án

Nhân dịp này tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô, bạn bè vàgia đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày tháng 1 năm

2016

Học viên

Lê Thành Long

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI

1.5 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng sinh

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

CTAB Cetyl Trimethyl Amoni Bromid

DNA Deoxyribonucleic acid

rDNA 18S Gen ribosome DNA 18S

ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction fragment length

polymorphism RNA Ribonucleic acid

TAE Tris Acetate EDTA

Taq Thermus

aquaticus

Tm Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperatures)

UV Ultraviolet (light)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: So sánh một số đặc điểm cấu tạo giữa các lớp hải miên

7Bảng 1.2: Số lượng loài hải miên qua các nghiên cứu tại Việt Nam

11Bảng 2.1: Danh sách mẫu hảimiên 16

Bảng 2.2: Danh sách mẫu hảimiên 17Bảng 2.3: Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl

19Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20Bảng 2.5: Danh sách trình tự của một số các loài hải miên lưu trữ trên ngân hàng

Genbank

21Bảng 3.1: Độ tương đồng (%) giữa trình tự nucleoitde của các mẫu hải miên

nghiên cứu và các trình tự tham khảo tương ứng 25

MỞ ĐẦU

Ngành Porifera (được Grant phân loại năm 1836), tên thường gọi làhải miên, là một trong những loài động vật biển có độ đa dạng cao nhất đồngthời đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển Đặc biệt, hải miên đượcđánh giá là nhóm sinh vật biển chứa nhiều hợp chất mới mang các hoạt tínhsinh học liên quan y - dược như chống ung thư, hỗ trợ điều trị thần kinh, tăngkhả năng miễn dịch, giảm đau, kháng virus, kháng vi sinh vật, vi khuẩn lao

Việt Nam có nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú, đặc biệt là cácloài hải miên Tuy nhiên, chỉ có một số ít nghiên cứu về hải miên ở biển ViệtNam liên quan tới thành phần loài và phân bố của hải miên tại các vùng biểnthuộc vịnh Nha Trang và vịnh Hạ Long Gần đây, các nghiên cứu về thành phầnhóa học của một số loài hải miên tại biển Việt Nam đã phân lập được nhiều hợpchất có cấu trúc mới và nhiều hoạt chất có giá trị Mặc dù vậy, hướng nghiêncứu về hải miên còn khá mới mẻ, đáng chú ý là chưa có nghiên cứu nào ở mức

độ sinh học phân tử hay đánh giá đa dạng di truyền đối với hải miên ở biểnViệt Nam Từ trước tới nay, nghiên cứu đa dạng loài hải miên mới dừng ở đadạng hình thái Số lượng loài hải miên tại Việt Nam khá nhiều, nhiều loài cóhình thái tương đối giống nhau; do vậy, các nghiên cứu đánh giá đa dạng hảimiên ở cấp độ sinh học phân tử sẽ góp phần tìm hiểu và phát triển tiềm năngứng dụng của hải miên Do đó, vấn đề cấp thiết hiện nay là phải phát huyđược những giá trị và tiềm năng ứng dụng của hải miên bằng các nghiên cứuthích hợp và có hệ thống

Khu vực nghiên cứu được lựa chọn là Khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ thuộctỉnh Quảng Trị Đây là khu vực biển được đánh giá là một trong những vùng

có mức độ đa dạng sinh học biển khá cao ở Việt Nam, trong đó nhóm hải miênxuất hiện phong phú cả về số lượng và thành phần loài

Trên cơ sở đó, luận văn “Nghiên cứu đa dạng sinh học của Hải miên

(Porifera) tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị” được thực hiện Luận văn

này có mục tiêu bước đầu nghiên cứu phát triển các chỉ thị sinh học phân tửnhằm đánh giá đa dạng di truyền và đa dạng sinh học, góp phần hỗ trợ choviệc định loài một số mẫu hải miên thu thập được ở tại Đảo Cồn Cỏ, tỉnh QuảngTrị

Nội dung của luận văn gồm:

1 Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu hải miên nghiên cứu

2 Tối ưu hóa các điều kiện PCR để nhân dòng các đoạn DNA chỉ thị

3 Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu hải miên nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về hải miên

Ngành Porifera (được Grant phân loại năm 1836), tên thường được gọi làhải miên hay bọt biển, được tìm thấy trong hầu hết các môi trường nước, tuynhiên, hải miên sinh sống phổ biến và đa dạng nhất trong môi trường biển.Theo Van Soest và cộng sự, 2016, có 8701 loài hải miên được ghi nhận [20],được phân loại thành 4 lớp, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loạinăm 1885) là lớp đa dạng nhất, chiếm 80% số loài hải miên được biết cho tớinay Hải miên được coi là động vật đa bào chưa hoàn thiện (Parazoa) Hảimiên là nhóm động vật sống bám, tuy vậy một số loài có khả năng vận độngnhờ vào tế bào chất hay roi Màu sắc, hình dạng, kích thước cơ thể các loài hảimiên rất đa dạng: loài bé nhất khoảng vài milimét, loài lớn nhất có thể tớihàng mét Hải miên hầu như có mặt trên toàn thế giới, sinh sống trong mộtloạt các môi trường dưới đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới[11] Thường hải miên phân bố ở các vùng yên tĩnh, bởi vì trầm tích khuấyđộng bởi sóng hoặc dòng sẽ chặn các lỗ chân lông, làm cho chúng khó khăntrong việc ăn và thở [7] Phần lớn hải miên thường được tìm thấy trên bề mặtvững chắc như đá, nhưng một số loài có thể gắn vào trầm tích mềm mại [9]

Hải miên dồi dào hơn ở vùng biển ôn đới nhưng ít đa dạng hơn so vớivùng nhiệt đới, có thể vì các sinh vật con mồi của chúng phong phú ở vùngbiển nhiệt đới [11] Hải miên thuộc lớp Hexactinellida (hải miên thủy tinh) làphổ biến nhất ở vùng biển Bắc cực và các khu vực sâu của vùng biển ôn đới

và nhiệt đới cơ thể hải miên thủy tinh rất xốp cho phép trích xuất thực phẩm

từ các vùng biển nghèo thức ăn mà không cần phải hoạt động nhiều Hảimiên thuộc lớp Demospongiae và hải miên lớp Calcarea (hải miên đá vôi)phong phú và đa dạng ở các vùng nước có độ sâu ít hơn [14]

1.2 Đặc điểm cấu tạo và sinh lý

Hải miên được coi là động vật đa bào chưa hoàn thiện (Parazoa) vì cócác đặc điểm sau [3]:

- Cơ thể đa bào nhưng chưa có mô phân hóa Có nhiều lỗ thủng trên thân, trong thân có các khe, rãnh

- Đối xứng phóng xạ hay chưa có kiểu đối xứng ổn định

- Biểu bì có các tế bào gai dẹp, có lớp tế bào cổ áo làm nhiệm vụ dẫn nước

vào và đẩy nước ra

- Tầng trung gian khá dày có các tế bào amip và gai xương Xương là canxi,

silic hay sợi collagen (spongin)

- Chưa có miệng, tiêu hóa nội bào, bài tiết và hô hấp bằng thẩm thấu

- Chưa có tế bào thần kinh, phản ứng với kích thích theo kiểu cảm ứng

- Sinh sản vô tính bằng chồi hay mầm, sinh sản hữu tính bằng trứng và tinh

trùng Phân hóa các lá phôi chưa ổn định, ấu trùng sống tự do

Các loài hải miên có hình dạng rất phong phú, trường hợp đơn giảnnhất là cơ thể có dạng một cái cốc, có đáy bám vào giá thể, đối diện vớiđáy là lỗ thoát nước (osculum) thành cơ thể có nhiều lỗ thủng thông nước(được gọi là ostium) Nước từ ngoài vào xoang cơ thể qua ostium và thoát ratheo osculum Nước vào xoang không chỉ theo một ống thẳng mà có thể điqua nhiều khoang khác nhau có lát cắt tế bào cổ áo Xoang cơ thể còn đượcgọi là xoang trung tâm hay xoang vị giả (pseudogastrula) Tùy theo mức độphức tạp của hệ ống dẫn nước và các phòng roi lát bằng các tế bào cổ áo màchia thành các kiểu cấu tạo cơ thể hải miên khác nhau [3] Có 4 kiểu cấu trúc

cơ thể:

- Kiểu ascon: có rãnh dẫn nước thông trực tiếp với xoang

- Kiểu sycon: nước qua hốc lõm mới vào xoang vị giả

Hình 1.1: Sơ đồ các kiểu cấu tạo cơ thể của hải miên

Các loại tế bào của hải miên bao gồm : Thành cơ thể 2 lớp tế bào,giữa là tầng trung giao (còn gọi là tầng keo – mesohyl) Lớp ngoài là biểu môdẹp, che chở cho cơ thể Lớp tế bào trong là tế bào cổ áo có roi (cổ áo của các

tế bào cổ áo xem dưới kính hiển vi điện tử thấy đó là vành nguyên sinh chấtgồm nhiều que tế bào chất, ken dày với nhau) Roi của tế bào cổ áo hoạt độngliên tục để đưa dòng nước vào cơ thể hải miên Khả năng lọc nước là rất lớn,với 1cm2 có thể lọc được 20 lít nước trong một ngày Tầng trung giao gồmnhiều loại tế bào: hình sao có chức phận liên kết, gai xương có nhiệm vụnâng đỡ, amip làm nhiệm vụ thực vào và hình thành các loại tế bào khác khicần biến đổi Hoạt động sinh lý nhờ vào tế bào cổ áo tạo dòng nước liên tụcmang thức ăn và oxy qua các lỗ và thải ra theo osculum (thức ăn gồm 4/5

là vụn bã hữu cơ, 1/5 là sinh vậy nhỏ) Trong xoang vị giả có các tế bào amipthực bào Ngoài ra có sự trợ giúp của các vi sợi quanh các lỗ [3]

Bộ khung CaCO3 hay SiO2 hoặc chất hữu cơ (sợi spongin) giống tơ tằmvới hàm lượng iôt cao (14%) có thể là nhiều trục hay một trục, xếp riêng lẻ haytừng bó Sợi spongin do nhiều tế bào hình thành, mỗi tế bào là một đoạn, từcác tấm spongin có thể hủy từng đám tế bào để hình thành nên các lưới sợi

1.3 Đặc điểm sinh sản và phát triển

Hải miên có cả 2 hình thức sinh sản vô tính và hữu tính Đối với sinh sản

vô tính, có 3 cách là : phân mảnh, nảy chồi và bằng cách sản xuất gemmules.Những mảnh vỡ của hải miên có thể tách ra bởi các dòng chảy và sóng Chúng

sử dụng các tính di động của pinacocytes, choanocytes và tái định hình củamesohyl lại gắn mình vào một bề mặt phù hợp và sau đó xây dựng lại bảnthân như hải miên nhỏ nhưng diễn ra theo một quá trình trong một vài ngày.Một mảnh hải miên chỉ có thể tái sinh nếu nó chứa cả collencytes để sản xuấtmesohyl và archeocytes để sản xuất tất cả các loại tế bào khác [21] Một sốrất ít loài sinh sản bằng cách nảy chồi [5] Phần lớn hải miên lưỡng tính Tếbào sinh dục được hình thành từ tế bào amip hay tế bào cổ áo Chúng ở trongtầng trung giao và nằm dưới các phòng roi Tinh trùng khi chín sẽ lọt vàophòng roi, theo dòng nước ra ngoài tìm cá thể khác để thụ tinh Sau đó hợp tửphát triển, hình thành phôi nang lưỡng cực (amphiblastula), tức là tế bào phôi

ở hai cực khác nhau [3]

Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống ít nhất trong một vài năm, nhưngmột số loài sống ở vùng nhiệt đới và cũng có thể ở những đại dương sâu có thểsống 200 năm hoặc hơn Một số ít bị vôi hóa chỉ tăng 0.2 mm mỗi năm và nếu

tỉ lệ đó là hằng số thì vật mẫu có kích thước 1 m phải được khoảng 5000 nămtuổi Một số loài hải miên bắt đầu sinh sản hữu tính khi chỉ một vài tuần tuổi,trong khi những loài khác chờ đợi cho đến khi vài năm tuổi [21]

1.4 Đa dạng sinh học của hải miên

1.4.1 Hệ thống phân loại hải miên

Hải miên được phân loại theo truyền thống thành ba lớp:lớp Demospongiae, lớp Calcarea (hải miên đá vôi) và lớp Hexactinellida (hảimiên thủy tinh) Các nghiên cứu phát sinh chủng loại gần đây đã chỉ rarằng trong lớp Demospongiae có sự phân biệt về phát sinh loài nên người tachia lớp này thành Demospongiae và Homoscleromorpha Hiện nay,Homoscleromorpha đã được các nhà khoa học công nhận là lớp thứ tư của hảimiên [5] [20]

Trong bảng thống kê hải miên (Catalogue of Life,http://w w w.catalo g ue of l i f e.org/col/brows e /cl a ssi f ication/n a m e/ P ori f er a ) xácđịnh lớp Calcarea có 715 loài (81 giống, 24 họ, 5 bộ); lớp Demospongiae có

7260 loài (916 giống, 99 họ, 23 bộ); lớp Hexactinellida có 618 loài (194 giống,

20 họ, 5 bộ); lớp Homoscleromorpha có 103 loài (8 giống, 2 họ, 1 bộ)

Bảng 1.1: So sánh một số đặc điểm cấu tạo giữa các lớp hải miên

Lớp tế bàongoài là hợpbào

Nhân đơn,màng đơnbênngoài

Nhân đơn, màng

đơnbên ngoài

Gai CaCO3 (Có

1,3 hay 4trục)

Silica(6 tia)

Silica(có 1 hay 4trục)

Silica(4 tia)

Không có Ở một số loài Không có

Hình

dáng

cơ thể

Asconoid,syconoid,leuconoid

Syconoid,Leuconoid Leuconoid

Sylleibid hoặcleuconoid

1.4.2 Tình hình nghiên cứu về đa dạng sinh học và phát sinh chủng loại của hải

miên

 Các nghiên cứu ngoài nước:

Theo World Porifera Database (2016), có hơn 8700 loài hải miên được ghi nhận, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loại năm 1885) là lớp

đa dạng

nhất, chiếm tới 80% số loài hải miên được biết cho tới nay Nhiêu loài hải miêntrên thế giới còn chưa được phát hiện và thống kê do các nghiên cứu hiện naychủ yếu tập trung ở một số vùng biển lớn như khu vực biển Caribbean, ĐịaTrung Hải và Châu Úc trong khi rất nhiều vùng biển khác như khu vực đôngnam Thái Bình Dương, vùng biển Đông Nam Á vẫn chưa được khảo sát đầy

đủ Các công trình mô tả đầu tiên về hải miên ở biển Đông được thực hiện vàonhững năm cuối của thế kỷ 18 và giữa thế kỷ 19 từ các bộ sưu tập của các nhàbuôn châu Âu và một số điều tra khoa học khởi thủy Cho đến gần đây, cókhoảng 1500 loài hải miên đã được xác định ở khu vực biển Đông Tuy nhiên,còn nhiều loài chưa được phát hiện và định loại một cách rõ ràng [21]

Việc đặt Porifera vào đúng vị trí trong cây phát sinh chủng loại của các

cơ thể đa bào nói chung và động vật đa bào nói riêng là quá trình nghiên cứulâu dài và khó khăn Nhóm sinh vật này lúc đầu được xếp vào nhóm thực vật-động vật và sau đó thuộc Zoophyta hoặc Mesozoa và cuối cùng Parazoa Chỉsau khi kỹ thuật sinh học phân tử phát triển thì mới có thể đặt nhóm có đặcđiểm hình thái thuộc nhóm Porifera trở thành một giới duy nhất: Metazoa.Những bằng chứng đầu tiên là việc phát hiện và tách được những phân tử gắnkết tế bào-tế bào và mạng lưới tế bào ở trong hải miên Các phân tử này có độtương đồng cao về trình tự và có chức năng tương tự với các phân tử tươngđương ở metazoan Phần lớn nghiên cứu hải miên dựa vào hệ thống phânloại truyền thống theo đặc điểm hình thái bộ khung (skeleton) của hảimiên trên cơ sở các công trình được xuất bản từ những thế kỷ trước [5] Trongmột số công trình gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã kết hợp cácđặc điểm sinh học khác vào hệ thống phân loại hải miên như các chỉ thị sinhhọc phân tử, hóa sinh…trong đó các chỉ thị phân tử đã có đóng góp quan trọngtrong việc phát hiện những loài mới, loài khó phân biệt về hình thái cũng nhưlàm sáng tỏ mối quan hệ phát sinh chủng loại ở hải miên [20]

Những công bố khoa học về đa dạng của sinh vật biển trong một vàithập kỷ qua cho thấy đa dạng sinh học biển, trong đó có hải miên chưa đượcđánh giá đúng ở tất cả các cấp độ từ di truyền, loài, hệ sinh thái và quy mô(không gian và thời gian) Hàng loạt các marker phân tử đã được dùng ở cácmức độ khác nhau để giải

quyết quá trình phát sinh chủng loại của Porifera Adams và cộng sự(1999) sử dùng trình tự gen 18S rRNA để nghiên cứu mối quan hệ trong họPorifera và tìm thấy bằng chứng Demospongiae/Hexactinellida hình thành mộtnhóm riêng biệt và Calcarea không thuộc vào nhóm này mà họp thành mộtnhánh với bộ Ctenophora McInerney và cộng sự (1999) xem xét tiềm năngcủa gen 18S và 28S rRNA khi nghiên cứu bộ Astrophorida và phát hiện ra rằngvùng 700 bp ở đầu 5’ của 28S rRNA có tiềm năng phân biệt ở mức độ họ vàloài của nhóm này, trong khi đoạn gen 18S rRNA dài 1300 bp lại có mức độ đadạng thấp Alvarez và cộng sự (2000) phân tích mối quan hệ họ hàng của họAxinellidae sử dụng một phần trình tự gen

28S rRNA và số liệu về hình thái và thấy rằng các loài trong họ Axinellidae đều

có cùng nguồn gốc (monophyly) theo số liệu hình thái và paraphyly theo sốliệu phân tử Borchiellini và cộng sự (2001) đã cố gắng giải quyết trả lời câu hỏi

là Porifera là mono- hay là paraphyly sử dụng trình tự đầy đủ của gen 18SrDNA và chỉ ra rằng Porifera là paraphyly Vùng nối thứ nhất và thứ hai(internal transcribed spacer, ITS-1 và ITS-2) giữa các gen 18S, 5,8 S và 28Sribosome RNA cũng đã được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ trong và giữacác loài [22][6][16] Ở các loài động vật không xương sống khác gen 12S rDNAcũng như 16S rDNA của ty thể đã được sử dụng phân tích đa dạng sinh học vàphát sinh chủng loại [8] Tiểu đơn vị cytochrome c oxidase I (COI) cũng đãđược sử dụng làm marker phân tử cho nhiều loài khác nhau từ động vật bậcthấp đến cao [17]

 Trong nước:

Những nghiên cứu về hải miên ở biển Việt nam còn rất ít Một vài côngtrình được công bố như nghiên cứu của Lindgren, phát hiện của Dawydoff(trích dẫn bởi Azzini và cộng sự, 2007), và những nghiên cứu trên bộ sưu tậphải miên ở Nha Trang của Lévi (1961) và gần đây là công trình về nghiên cứu

về hải miên “boring sponges" [13] Trong bảng thống kê hải miên ở biển Đông,Hooper và cộng sự (2000) [12] xác định có khoảng 176 loài hải miên thuộclớp Demospongiae trong đó có 129 loài (được xác định ở mức độ loài) ở bờbiển của Việt Nam Azzini và cộng sự, (2007) [16] phát hiện tổng số có 63 loàiDemosponge ở các đảo của Vịnh Hạ Long Trong số đó, có 36 loài được xácđịnh loài hoàn chỉnh và 23/36 loài lần

đầu tiên phát hiện có mặt ở bờ biển Việt nam Dựa trên cơ sở các tài liệu đãcông bố từ năm 1952 đến nay, Thái Quang Minh (2013) [18], đã thống kêtổng cộng 299 loài (124 giống, 65 họ, 18 bộ và 4 lớp) được ghi nhận có mặt tạiViệt Nam, chủ yếu khảo sát ở khu vực biển Vịnh Hạ Long và Vịnh Nha Trang.Lớp Demospongiae chiếm 94% với 281 loài (46 họ, 12 bộ) Trong số này, chỉ có

181 loài được xác định tên khoa học đầy đủ, các loài còn lại chỉ được xác định

ở mức độ trên loài (giống, họ), cần có thêm phân tích về hình thái hoặc kếthợp với các chỉ thị khác như hóa học, sinh học phân tử [18] Các loài hải miênthường gặp ở biển Việt Nam thuộc lớp Demospongiae với 12 họ sau:Niphatidae, Halichondriidae, Desmacellidae, Microcionidae, Axinellidae,

Chalinidae, Ianthellidae, Irciniidae, Mycalidae, Petrosiidae, Spongiidae,

Thorectidae Đáng chú ý là các công bố về hải miên ở Việt Nam đều tập trungvào hải miên thu thập ở các rạn san hô và đảo thuộc vịnh Nha Trang (miềnNam Việt Nam) và vịnh Hạ Long (miền Bắc Việt Nam) mà chưa có công bốmang tính hệ thống về thành phần các loài hải miên ở khu vực biển miềnTrung Việt Nam Trên thực tế, các nhà khoa học ước tính còn nhiều loài hảimiên ở Việt Nam chưa được phát hiện và định loại một cách rõ ràng

Các đợt điều tra khảo sát sinh vật biển trong những năm gần đây củacác nhà khoa học thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển và Viện Hảidương học tại một số vùng biển như đảo Cát Bà, Côn Đảo, Trường Sa, vịnh HạLong ) cho thấy hải miên xuất hiện khá đa dạng về thành phần loài và có trữ

lượng lớn Chẳng hạn như, 6 loài hải miên (Gellius varius, Dysidea cinerea, Haliclona subarmigera, Mycale plumosa, Ircinia echinata, Amorphinopsis excavans) được phát hiện ở khu vực đông nam đảo Cát Bà; 5 loài (Clathria vulpine, Petrosia nigricans, Xestospongia testudinaria, Stylissa flabelliformis, Gellius var fibrosa) được xác định ở vùng biển quanh đảo Côn Đảo và 3 loài (Petrosia nigricans, Ianthella basta, Xestospongia testudinaria) ở vùng biển

đảo Trường Sa Các loài này thường phân bố chủ yếu trong các rạn san hô,vùng ven biển và xung quanh các đảo vùng biển Việt Nam

Bảng 1.2: Số lượng loài hải miên qua các nghiên cứu tại Việt Nam

(được thống kê)

Loài(được mô tả cụthể)Lindgren (1898) Nha Trang 20

Tran Ngoc Loi,

Tran Dinh Nam

63 (demosponge) 23*/36

Thái Quang Minh

(2013)

Chú thích: * : Loài lần đầu tiên phát hiện ở Việt Nam

1.4.3 Giới thiệu về Khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ.

Đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị là Khu bảo tồn biển thứ 4 của Việt Nam,

có tổng diện tích 4.532 ha, được chia thành 3 phân khu: phân khu bảo vệnghiêm ngặt, phân khu phục hồi sinh thái và phân khu phát triển Toàn bộ khuvực này có hệ sinh vật biển vô cùng phong phú, dồi dào cả về trữ lượng vàthành phần loài sinh vật, đặc biệt là các loài hải miên Các nghiên cứu về hảimiên ở Đảo Cồn Cỏ bước đầu đã thu thập được một số mẫu hải miên như:

Xestospongia testudinaria, Niphates

quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các

sp., Spongia sp., Stylissa flabelliformis … Việc nghiên cứu tính đa dạng sinh

học và đánh giá đa dạng di truyền của các loài hải miên thuộc Khu bảo tồnbiển Đảo Cồn Cỏ có ý nghĩa quan trọng, sẽ góp phần nâng cao giá trị đadạng sinh học của

các loài hải miên ở Việt

Nam

Hình 1.2: Sơ đồ Khu vực nghiên cứu tại Đảo Cồn Cỏ

1.5 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học là thuật ngữ thể hiện tính đa dạng của các thể sống,loài và quần thể, tính biến động di truyền giữa chúng trong các quần xã và hệsinh thái Đa dạng sinh học được thể hiện ở ba cấp độ: đa dạng di truyền, đadạng về loài và đa dạng về hệ sinh thái [1] Đa dạng di truyền được cho là

sự khác biệt của các đặc tính di truyền giữa các quần thể và giữa các cá thểtrong một loài hay một quần thể Đa dạng loài chỉ mức độ phong phú về sốlượng loài hoặc loài phụ trên quả đất, ở một vùng địa lý, trong một quốc giahay trong một sinh cảnh nào đó [1]

Đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa hết sức quan trọng đối với

quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các

nghiên

cứu sinh học và phát triển bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên Từ nhữngkết

nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ quá trình chọn tạogiống Nghiên cứu đa dạng sinh học đã được thực hiện từ khá lâu với nhiềucách tiếp cận khác nhau chẳng hạn như thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉthị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khácbiệt (đa hình) trong DNA (chỉ thị DNA) Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu -nhược điểm , lựa chọn chỉ thị đánh giá phụ thuộc vào mục đích của từngnghiên cứu.

 Chỉ thị hình thái:

Nghiên cứu đa dạng sinh học dựa trên chỉ thị hình thái là phương phápđánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặcđiểm các bộ phận) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bịđắt tiền cũng như quy trình phức tạp Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái

có những hạn chế như số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, sự tác động củamôi trường, phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; mangtính chất thống kê nên cần thực hiện với số lượng lớn, có nhiều tính trạng do

đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình để cóthể đánh giá được [2]

 Chỉ thị sinh hóa:

Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểuhiện gen ở sinh vật Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sảnphẩm này có thể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các

cá thể và loài khác nhau Bush và cộng sự, (1978) khẳng định điện di protein

là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài vàphân loại sinh vật

Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉthị isozyme và các loại protein dự trữ Chỉ thị protein và chỉ thị enzymethuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và

sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cáthể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế [2]

 Chỉ thị phân tử DNA

Từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước, các kỹ thuật chỉ thị DNA được bắt đầu

và phát triển nhanh chóng trở thành lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân

tử Các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chọn lọc Cácchỉ thị DNA được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA cho nghiên cứu đadạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác định gen

Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu,

có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xáccao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường Các chỉ thị này

đã được ứng dụng và mang lại những kết quả đáng tin cậy, có giá trị khôngchỉ với nghiên cứu đa dạng di truyền mà còn với nhiều lĩnh vực công nghệ sinhhọc khác

Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính: i) Chỉ thị dựa trên cơ sởnguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP và ii) Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng

kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR, )

1.6 Các chỉ thị DNA trong đánh giá đa dạng sinh học hải miên

Porifera là một trong số những động vật nguyên sinh khó xác định Hầuhết các loài hải miên không có cuống, phát triển trên nền cứng và sống ở đótrong suốt cuộc đời, điều này lý giải tại sao các nhà nghiên cứu lúc đầu xemhải miên giống thực vật hơn so với động vật Mặc dù cấu trúc đơn giản nhưnghải miên rất đa dạng về hình dạng và kích thước, tùy thuộc vào hình dạng vàthành phần của bộ khung (skeleton) tạo thành từ các tế bào và mạng lướicollagen Hiện nay, nhiều vấn đề về sinh học của hải miên vẫn chưa được tìmhiểu rõ, như sự phát sinh chủng loại và tiến hóa, quá trình phát triển và sinhsản, cơ chế phân tử của quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, đáp ứngvới biến đổi của môi trường

Nhiều chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) đã được sử dụng ở các mức độkhác nhau để tìm hiểu quá trình phát sinh chủng loại của hải miên, nghiên cứumối quan hệ trong và giữa các loài hay [19][15] [10] Có thể liệt kê 3 nhómchỉ thị phân tử như sau:

- Trình tự trên ribosome DNA: 18S, 28S, vùng nối thứ nhất và thứ hai: ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer) giữa các gen 18S; 5,8S và 28S rRNA.

- Trình tự DNA ty thể gồm gen COI (cytochrome oxidase subunit I) và toàn bộ hệ gen ti thể

- Trình tự các gen giữ nhà (nuclear housekeeping genes)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1: Danh sách mẫu hải

miên

1 CC12 Mycale laevis 17o09’07’’N-107o119’35’’E

2 CC13 Biemna sp. 17o09’29’’N-107o20’53’’E

3 CC34 Hyrtios eretus 17o09’04’’N-107o20’39’’E

4 CC40 Dictyonella pelligera 17o09’04’’N-107o20’39’’E

5 CC46 Niphates sp. 17o09’04’’N-107o20’39’’E

6 CC48 Erylus formolus 17o09’07’’N-107o119’35’’E

2.1.2 Hóa chất

Agarose (Sigma)

Bộ kit tinh sạch DNA tổng số (Fermentas)

Dung dịch: Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol

(25:24:1) Dung dịch : Chloroform: Isoamyl alcohol

Ly tâm Centrifuge 5415R Eppendorf CHLB Đức

Pipetman 10µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl,

PCR PCR 9700 (Applied, Biosystem).

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu

Mẫu hải miên được xử lý theo trình tự như sau:

- Chuẩn bị các ống nhựa 50 ml (ống corning) được ghi kí hiệu thứ tự tươngứng với các mẫu Rửa sạch các mẫu bằng nước sạch rồi cho vào các ốngcorning tương ứng

- Rót nước biển vào các ống corning sao cho ngập mẫu Để ngâm mẫu ítnhất 3 giờ tại nhiệt độ phòng

- Đổ nước biển, rửa lại mẫu nhiều lần dưới vòi nước chảy

- Phơi khô mẫu ở nhiệt độ phòng trên giấy thấm

- Các mẫu khô được bảo quản trong ống corning sạch có silicagel hút ẩm

2.2.2 Phương pháp tách DNA tổng số từ hải miên

+ Dùng chày cối sứ đã khử trùng nghiền 1 mảnh mẫu có kích thước 2 cm3 trong nitơ lỏng cho tới khi thành bột mịn, sau đó chuyển sang ống eppendorf 2 ml

+ Rửa lại 2 lần với dung dịch rửa(100 mM Tris HCl, pH 8.0; 300 mM Sorbital,

5 mM EDTA, pH 8.0; 0.5% NaH2PO4)

+ Sau đó thêm 1ml lysis bufer (2% CTAB; 100 mM Tris HCl, pH 8.0; 1.5 MNaCl; 20 mM EDTA, pH 8.0; 0.1% β-mercaptorthanol) và 40 µl Proteinase K(20 mg/ml) Sau đó ủ ở bể ủ nhiệt 65oC trong 1 giờ.

+ Sau đó DNA tổng số sẽ được tủa với isopropanol, rửa lại với cồn 70% và hòalại

DNA bằng nước tinh khiết khử ion vô trùng

tố về độ đặc hiệu của mồi nhân, thành phần phản ứng, chu trình nhiệt, nồng độ

và độ tinh sạch của DNA khuôn đóng vai trò quyết định sự thành công củaphản ứng PCR Sản phẩm DNA tổng số tách chiết ở quy trình trên được tinhsạch bằng kit tinh sạch Wizard SV Gel and PCR clean-up System (Promega) đểđảm bảo độ tinh sạch cho phản ứng PCR Nồng độ DNA tổng số sau khi đượcxác định bằng máy Nanodrop (Thermo), được pha loãng bằng nước cất vôtrùng tới nồng độ 50 ng/µl Thành phần phản ứng và chu trình chạy PCR đượcthể hiện ở Bảng 2.3 và 2.4

Mồi xuôi (F) 10 pmol/µl 0.2 pmol/µl 0.5 µl

Mồi ngược(R) 10 pmol/µl 0.2 pmol/µl 0.5 µl

Dream Taq DNA-

polymerase

DNA khuôn 100 ng/ µl 10 ng/ µl 1 µl

H2O 17.5 µl

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Các bước của phản ứng PCR Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

30

2.2.4 Phương pháp điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm PCR và DNA tổng số được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel

agarose 1 % Thành phần gel agarose 1 %: Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris pH=8,

20mM acetic axit, 1 mM EDTA): 100 ml và Agarose: 1 g

Chạy điện di ở 100V/ 250mA/ 30-40p trong bể điện di có dung dịch TAE1X, nhuộm gel bằng Ethidium Bromide trong 10 phút Đọc kết quả trên máysoi UV, chụp ảnh lưu kết quả

2.2.5 Phương pháp xử lý trình tự nucleotide

Sử dụng một số phần mềm

sau:

- Phần mềm BioEdit và phần mềm DNASTAR, trong đó bao gồm phần

Editseq và Megalign trong việc xử lý kết quả, so sánh trình tự và vẽ cây phân loại

- Công cụ Blast trên NCBI để thu thập trình tự của các loài hải miên đã được lưu trữ trên ngân hàng Genbank (h ttp:// w ww ncbi.n l m n ih.gov / )

- Xác định mức độ tương đồng (%) bằng phần mềm Lasergene 7.0 và

DNAMAN 4.1.5 (Lynnon BioSoft, Mỹ)

Bảng 2.5: Danh sách trình tự của một số các loài hải miên lưu trữ

trên ngân hàng Genbank

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

Tách chiết DNA tổng số là một bước quan trọng nhằm tạo nguyên liệu

để tiến hành tiếp các thí nghiệm sinh học phân tử Nhờ tiến bộ và sự đổimới công nghệ mà tách chiết DNA ngày nay đã trở nên đơn giản Hiện nay córất nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số, tùy từng đối tượng nghiên cứucần lựa chọn và tối ưu quy trình cho phù hợp Do đó, việc lựa chọn và cải tiếnphương pháp cho phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quantrọng

Hình 3.1: minh họa kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1%ở