13.9 Xác định hoạt lực thuốc kháng sinh phơng pháp thử vi sinh vật Hoạt lực kháng sinh đợc thể khả ức chế loại chủng thị đó, điều kiện thích hợp Sự giảm hoạt tính sinh học kháng sinh đợc thể chủng thị, khó phát phơng pháp phân tích hoá học, phơng pháp vi sinh vật thờng giữ vai trò quan trọng việc đánh giá khả hoạt lực kháng sinh, loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp, thành phần gồm hỗn hợp kháng sinh họ mà mức độ hoạt lực chênh lệch không lớn Phơng pháp vi sinh vật xác định hoạt lực kháng sinh cách so sánh tác động ức chế phát triển loại vi sinh vật (đợc gọi chủng thị) độ pha loãng biết kháng sinh mang thử (cha biết rõ hoạt lực) với tác ®éng øc chÕ bëi nång ®é ®· biÕt cđa kh¸ng sinh đối chiếu (chất chuẩn biết rõ hoạt lực) Thử nghiệm phải dùng phơng pháp phân tích thống kê để đánh giá số liệu thu đợc Nếu áp dụng mô hình đờng thẳng song song, hai đờng log liều đáp ứng chất chuẩn chế phẩm thử phải song song với phải tuyến tính khoảng liều dùng Hai phơng pháp thờng đợc sử dụng kiểm nghiệm phơng pháp khuếch tán dùng môi trờng thạch phơng pháp đo độ đục dùng môi trờng lỏng Phơng pháp thứ dựa vào khuếch tán kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp thạch đặc hộp Petri khay vào khoảng phát triển vi sinh vật tạo vòng ức chế hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh Phơng pháp ống nghiệm dựa vào độ đục canh khuẩn, biết đợc ức chế phát triển vi khuẩn gây loạt dung dịch kháng sinh môi trờng lỏng môi trờng thích hợp phát triển vi sinh vật kháng sinh Phơng tiện dụng cụ Tất dụng cụ phải đợc làm hoàn toàn trớc sau lần thí nghiệm Những dụng cụ thuỷ tinh đồ đựng khác dùng thí nghiệm phải đợc loại hết vi khuẩn chất ảnh hởng Các dụng cụ dùng để giữ chuyển chủng thị cần làm cẩn thận tiệt khuẩn sức nóng khô nớc điều kiện thích hợp Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng thị chế tạo nhũ dịch cấy truyền, cần thực môi trờng đảm bảo nhiệt độ qui định Đối với phơng pháp đo độ đục, cần kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ cho nhiệt độ quanh ống nghiệm phải đồng phải đạt đợc nhiệt độ cần thiết ống nghiệm Nên dùng điều nhiệt nớc luân chuyển tốt điều nhiệt không khí Máy đo quang phổ: Đợc dùng để đo truyền qua hấp thụ khoảng sóng hẹp, cần có máy đo quang thích hợp thay đổi đợc bớc sóng dùng dùng kính lọc 650 nm 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy pha chế dùng kính lọc 530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng phơng pháp ®o ®é ®ơc Dïng canh thang ®· tiÕn hµnh nh mẫu nhng thêm dung dịch formaldehyd để chỉnh máy cho ®é hÊp thơ vỊ ®iĨm “ ” Dơng cụ thí nghiệm: - Phơng pháp khuếch tán: Dùng khay đĩa Petri thuỷ tinh plastic, đạt tiêu chuẩn phẳng Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhá ®êng kÝnh 100 mm, cì lín ®êng kÝnh lín 160 mm Các khay thí nghiệm đợc tiêu chuẩn hoá, kính plastic với kích thớc 25 x 25 cm (loại vuông) 28,8 x 19,8 cm (loại chữ nhật) Có thể sử dụng chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn phẳng ống trụ thép không rỉ, thuỷ tinh, sứ, có kích thớc nh sau: Đờng kính 8,0 mm; đờng kÝnh 6,0 mm; cao 10,0 mm VËt liÖu dïng làm ống trụ phải loại trơ, riêng kháng sinh nhạy cảm với ánh sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu Khi dùng phải làm cẩn thận, loại hết cặn, khử khuẩn Đôi phải rửa acid nh dung dịch acid nitric 2M, acid sulfocromic Dụng cụ dùng cho phơng pháp đo độ đục: Dùng ống nghiệm loại 16 x 125 mm hc 18 x 150 mm b»ng thủ tinh cã cïng chiều dài, đờng kính độ dày, bề mặt phải vết xớc, không dây bẩn Khi dùng, ống nghiệm phải hoàn toàn, đảm bảo không vết kháng sinh vết chất tẩy rửa phải tiệt khuẩn trớc dùng Môi trờng, dung môi chất pha loãng Phải dùng chất đạt từ mức tinh khiết hoá học trở lên để pha chế Môi trờng Dới công thức môi trờng cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh Các loại môi trờng đợc thay môi trờng khô tơng ứng loại môi trờng thúc đẩy vi sinh vật phát triển tốt mà cho đờng đáp ứng tơng tự Pha môi trờng cách hoà tan thành phần công thức vào phần nớc, sau thêm nớc vừa đủ lít Dùng dung dịch acid hydrocloric 1N dung dịch natri hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trờng cho sau tiƯt khn ë 121oC 15 cã pH nh ghi công thức Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn kéo dài tới 30 phút môi trờng tích lớn 500 ml M«i trêng sè Pepton kh« 6,0 g Casein pancreatic 4,0 g Cao men bia 3,0 g Dextrose monohydrat 1,0 g Th¹ch 20,0 g Níc cÊt 1000 ml pH: 6,0 đến 7,0 Môi trờng số 2: Pepton khô 6,0 g Cao men bia 3,0 g Cao thÞt 1,5 g Thạch 20,0 g Nớc cất 1000 ml pH: 6,0 đến 7,0 M«i trêng sè 3: Pepton kh« 5,0 g Cao men bia 1,5 g Cao thÞt 1,5 g Dextrose monohydrat 1,0 g Dikali hydrophosphat 3,58 g (K2HPO4) 1.32 g Kali dihydrophosphat 3,5 g (KH2PO4) 1000 ml Natri clorid Níc cÊt pH: 6,0 đến 7,0 Môi trờng số 4: Giống nh môi trờng số nhng có pH 7,0 đến 8,0 M«i trêng sè 5: Gièng nh m«i trêng sè 1, nhng có pH 7,8 đến 8,0 Môi trờng số 6: Casein pancreatic 17,0 g Bột đậu tơng papaic 3,0 g 5,0 g Natri clorid 2,5 g Dextrose monohydrat 2,5 g Dikali hydrophosphat (K2HPO4) 15,0 g Th¹ch 10,0 ml Polysorbat 80 1000 ml Níc cÊt pH : 7,0 ®Õn 7,3 Chú ý: Polysorbat 80 đợc thêm vào lợng dung dịch nóng thành phần khác trớc thêm nớc vừa đủ dung tích cần thiết Môi trờng sè 7: Pepton kh« 9,4 g Cao men bia 4,7 g Cao thÞt 2,4 g Dextrose monohydrat 10,0 g Natri clorid 10,0 g Th¹ch 20,0 g Níc cÊt 1000 ml pH: 6,0 0,2 Dung môi chất pha loãng Dung môi chất pha loãng dùng thí nghiệm phải không ảnh hởng đến phát triển vi sinh vật Chúng đợc dùng để pha dung dịch theo yêu cầu thí nghiệm Các loại dung môi nh nớc vô khuẩn, acid hydrocloric, ethanol, dimethylformamid dung dịch đệm có dải pH khác loại khác tuỳ thuộc vào kháng sinh riêng biệt (bảng 2) Các dung dịch đệm phosphat đợc chế tạo cách hoà tan lợng dikali hydrophosphat kali dihydrophosphat (theo bảng 1) vào nớc vừa đủ để ®ỵc 1000 ml Sau ®ã ®iỊu chØnh víi acid phosphoric 18 N natri hydroxyd 18 N đến pH cần thiết Giá trị pH bảng pH dung dịch sau tiệt khuẩn Bảng Số dun Dikali hydrophosph Kali dihydrophosph pH điều g dịc h ®Ư m at K2HPO4 (g) at KH2PO4 (g) chØnh ®Õn 2,0 16,73 20,0 35,0 13,6 8,0 0,523 13,61 80,0 4,0 6,0 ± 0,1 8,0 ± 0,1 4,5 ± 0,1 6,0 ± 0,1 10,5 ± 0,1 7,0 ± 0,2 ChÊt ®èi chiÕu đơn vị Chất đối chiếu đợc dùng thử nghiệm chất có hoạt lực đợc xác định xác so với chuẩn quốc tế chất đối chiếu quốc tế tơng ứng Hoạt lực kháng sinh đợc thể đơn vị quốc tế Một đơn vị quốc tế hoạt lực đặc biệt chứa lợng (tính theo cân nặng) chuẩn sinh học quốc tế tơng ứng chế phẩm đối chiếu sinh häc qc tÕ Tõng thêi kú, Héi ®ång vỊ chn sinh häc cđa Tỉ chøc y tÕ thÕ giíi có dẫn qui định xác cho chuẩn quốc tế Trong vài trờng hợp, định nghĩa số đơn vị quốc tế bao gồm tổng lợng vài nguyên liệu thực tế khó cân lợng nhỏ dù xác chất chuẩn sinh học quốc tế chất đối chiếu sinh học quốc tế Hoạt lực vài chất kháng sinh đợc biểu thị àg àg hoạt lực không thiết tơng ứng với khối lợng chất kháng sinh bao hàm toàn thực thể hoá học tinh khiết riêng kháng sinh Chủng thị dịch cấy truyền Các chủng thị dùng phải nhạy cảm, phù hợp với kháng sinh, theo qui định bảng Có thể dùng chủng thị khác với chủng thị giới thiệu chuyên luận chủng phải nhạy cảm với kháng sinh cần định lợng Chế tạo dịch cấy truyền Chế tạo nhũ dịch vi khuẩn nha bào Escherichia coli Klebsiella pneumoniae (không tạo vỏ ) Micrococcus luteus Saccharomyces cerevisiae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus faecium Dùng chủng thị phát triển thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền lại lên mặt ống thạch nghiêng khác bề mặt thạch rộng (nh bình Roux) môi trờng sè (Saccharomyces cerevicae dïng m«i trêng sè 8; Streptococcus faecium dïng m«i trêng sè 3) đ ë 32 - 350C 24 (riêng với Klebsiella pneumoniae Streptococcus faecium đ ë 370C) víi Saccharomyces cerevisiae đ ë 300C Thu vi khuẩn phát triển bề mặt môi trêng b»ng níc mi sinh lý, råi hoµ lo·ng víi chất hoà loãng tới độ đục thích hợp để đ- ợc đáp ứng thích hợp phơng pháp đo độ đục, để tạo vùng ức chế rõ ràng, sắc nét thuận lợi đo phơng pháp khuếch tán Thí dụ: Pha loãng hỗn dịch vi khn tíi nång ®é cho ®o ë b ớc sóng 650 nm, cốc đo dày 1cm, độ truyền qua T = 50%, ë bíc sãng 580 nm T = 25%, hay cho vòng vo khuẩn rõ, sắc net có đờng kính 13 mm Nhũ dịch vi khuẩn chế tạo nh đem bảo quản nhiệt độ dới 40C sử dụng tuần Chế tạo nhũ dịch nha bào Bacillus cereus Bacillus pumilus Bacillus subtilis Cho chủng vi khuẩn mọc qua đêm ống thạch nghiêng môi trờng số 370C (riêng với Bacillus cereus nuôi 300C) Thu vi khuẩn phát triển mặt thạch nớc muối sinh lý, chuyển sang bề mặt thạch rộng (nh bình Roux) môi trờng số 1, môi trờng thêm vào dung dịch 0,001% (kl/tt) mangan sulfat (MnSO 4) để giúp thúc đẩy hình thành nha bào Nhũ dịch vi sinh vật đợc trải cho phủ kín bề mặt môi trờng cách cho vào bề mặt thạch vài viên bi thuỷ tinh vô khuẩn Đem đ ë 37 0C (riªng víi Bacillus cereus đ ë 300C) ngày Dùng nớc cất vô khuẩn rửa vi khuẩn mọc (chủ yếu nha bào) đem hoà loãng tới nồng độ thích hợp, thí dụ khoảng 10 - 108 nha bào 1ml, đun cách thủy nhũ dịch nha bào nhiệt độ 70 oC 30 Dïng test phiÕn kÝnh ®Ĩ kiĨm tra khả sống nha bào Xác định lợng nhũ dịch nha bào vào 100 ml môi trờng định lợng tạo đợc vùng ức chế rõ ràng, sắc nét Nhũ dịch nha bào giữ lâu nhiệt độ 0C Các loại thử nghiệm Thử nghiệm hai liều ba liều Phơng pháp khuếch tán Pha dung dịch chuẩn dung dịch thử: Dung dịch chuẩn nồng độ biết dung dịch thử đợc coi nh xấp xỉ nồng độ dung dịch chuẩn Các dung dịch chuẩn thử ban đầu đợc pha vào dung môi thích hợp để đợc dung dịch gốc Sau pha loãng dung dịch gốc dung môi dung dịch đệm vô khuẩn đến nồng độ thích hợp, có pH thích hợp cho loại kháng sinh ( xem bảng 2) Để xác định hiệu lùc cđa kh¸ng sinh, dïng ba liỊu kh¸c cđa chn (S1, S2, S3) mang so s¸nh víi ba liỊu khác thử (U 1, U2, U3) có hoạt lực đợc coi nh dung dịch chuẩn Nồng độ đợc pha theo cấp số nhân, thí dụ pha loạt ®é pha lo·ng theo tû lƯ : hc : Nếu quan hệ logarit nồng độ kháng sinh đờng kính vùng ức chế gần nh thẳng với hệ số dùng dùng định lợng thờng xuyên cách dùng hai nồng độ chuẩn (S1, S2) hai nồng ®é thư (U1, U2) - Thư nghiƯm hai liỊu Trong trờng hợp có tranh chấp bắt buộc phải sử dụng định lợng ba liều Chuẩn bị cấy truyền Các thử nghiệm tiến hành đĩa Petri khay phẳng Đổ vào hộp Petri khay môi trờng thích hợp cấy truyền chủng thị thích hợp cho kháng sinh Lớp môi trờng thờng có độ dày - mm (riêng với amphotericin B nystatin độ dày - mm, bleomycin, mithramycin độ dày - mm) Thạch dinh dỡng đợc đổ thành lớp hai lớp (gồm lớp vi khuẩn lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy vào môi trờng cho tạo đợc vùng ức chế sắc nét tơng ứng với liều lợng kháng sinh Dùng nhũ dịch chủng thị chế tạo nh phần trên, thờng cấy vào môi trờng với nồng độ ml chủng cho 100 ml môi trờng thích hợp Khi nhũ dịch chủng loại nha bào, thờng phải cấy vào môi trờng thạch đun chảy hoàn toàn để nguội đến 45 - 50 0C Trờng hợp nhũ dịch chủng nha bào, nhiệt độ cho phép cấy tối đa 65 - 70 0C Dùng lợng thích hợp môi trờng cấy chủng thị, rót cách vô khuẩn vào đĩa petri khay kính (trên đĩa thạch khay có thạch không tuỳ theo yêu cầu) để đợc lớp môi trờng có độ dày thích hợp, dàn trải nhanh đậy nắp Trong đợi thạch đông đặc, đặt khay kính hộp petri kính để tạo mặt phẳng giúp cho môi trờng khay hộp có độ dày đồng Những môi trờng chuẩn bị đợc để khô nhiệt độ phòng 30 phút trớc sử dụng (riêng colistin colistin sulfomethat natri, đĩa petri khay kính cấy truyền phải để tủ lạnh 0C vài giờ) Tiến hành thử: Đối với thử nghiệm liều, dùng ống trụ vô khuẩn đặt lên mặt thạch cấy trun mét hép petri (víi thư nghiƯm liỊu dùng ống trụ cho hộp) Có thể thay ống trụ cách dùng dụng cụ đục lỗ tiệt khuẩn, đục vào môi trờng thạch để tạo lỗ thạch đờng kính - mm (hoặc thay khoanh giấy tẩm kháng sinh) Phân phối dung dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử hộp Petri hay khay vuông cho phù hợp với kiểu bố trí thí nghiệm chọn (xem phụ lục 13.10) Việc bố trí ống trụ, lỗ khoan, khoanh giấy mặt thạch phải cho vùng ức chế không bị trùm lên Dùng pipet nhỏ vào ống trụ, lỗ thạch lợng dung dịch kháng sinh Nếu dùng khoanh giấy phải tiêu chuẩn hoá trớc thể tích xác chất lỏng cho khoanh giấy Giữ hộp petri khay nhiệt độ phòng khoảng - tuỳ theo đặc tính kháng sinh Đối với kháng sinh nhạy cảm với nhiệt độ, phải đợc giữ nhiệt độ 40C để khuếch tán kháng sinh vào môi trờng xẩy chậm làm giảm đến mức tối thiểu hiệu biến đổi theo thời gian dung dịch khác Đối với colistin colistin sulfomethat natri nên ®Ĩ - giê ë nhiƯt ®é phßng tríc ủ Các hộp Petri khay sau thời gian để khuếch tán, mang ủ nhiệt độ thích hợp cho kháng sinh riêng (bảng 2) Nhiệt độ ủ phải đợc kiểm tra để khoảng nhiệt độ chênh lệch so với quy định khoảng 0,50C Thời gian đ thêng kÐo dµi 16 - 18 giê Dïng dụng cụ đo có độ xác tối thiểu 0,1mm, đo đờng kính vùng ức chế tạo nồng độ khác chuẩn thử Kiểm tra tính có giá trị định lợng, tính hoạt lực giới hạn tin cậy hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phơng pháp đo độ đục Pha dung dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử Dung dịch dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử đợc pha dung môi thích hợp đợc pha loãng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho kháng sinh theo dẫn bảng Để đảm bảo giá trị hiệu lực phép thử, làm thử nghiệm liều thích hợp Pha song song độ hoà loãng gồm liều chuẩn (S1, S2, S3) liều thử (U1, U2, U3) Chế tạo canh thang để cấy truyền Để có đợc độ đục thích hợp dùng đợc dịch cấy truyền, pha dịch cấy truyền nh mô tả phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền dùng Chủng thị điều kiện thử nghiệm kháng sinh sử dụng phơng pháp đợc ghi bảng Tiến hành Các ống nghiệm đợc xếp thành nhóm, nhóm - ống, thêm vào ống ml dung dịch độ pha loãng dung dịch chuẩn mẫu thử Đặt ống nghiệm vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối theo hình vuông latinh Trong giá có ống dùng kiểm tra không thêm kháng sinh, ống chứa ml dịch pha loãng, ống chứa ml dịch pha loãng 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) Thêm vào ống ml canh thang cấy truyền Đặt giá chuẩn bị xong vào tủ ấm cách thuỷ, giữ nhiệt độ thích hợp, khống chế nhiệt độ ë møc sai sè ± 0,50C so víi nhiƯt ®é cần ủ (theo bảng 2) - Sau ủ, làm ngừng phát triển vi khuẩn cách thêm vào ống 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) trừ ống kiểm tra thêm formaldehyd 12% trớc nhúng giá có ống nghiệm ủ vào nớc sôi Lấy giá ống nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền qua độ hấp thụ dung dịch máy đo quang 530 nm Kiểm tra tính có giá trị định lợng, tính hoạt lực giới hạn tin cậy hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phơng pháp đờng chuẩn Hoà tan lợng cân xác chất đối chiếu chất chuẩn sinh học kháng sinh cho dung môi thích hợp, phải làm khô trớc Pha loãng với dung môi qui định để đợc dãy chuẩn có nồng độ Tỷ lệ tăng nông độ nên 1: 1,25 (xem hớng dẫn bảng 2) Tiến hành Khi tiến hành xây dựng đờng chuẩn, khảo sát 12 hộp Petri Khi xác định hàm lợng cđa mét kh¸ng sinh dïng Ýt nhÊt hép Petri Đổ vào hộp Petri 21 ml môi trờng đun chảy, đợi thạch đông cứng lại tạo thành lớp có độ dày đồng bề mặt phẳng để làm (Riêng với amphotericin B, nystatin không dùng lớp nền) Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin mytomycin dùng 10 ml làm lớp Lớp nuôi cấy dùng ml cho hộp, đợc đổ láng sau lớp đông cứng, đặt lên mặt thạch đĩa ống trụ thép không rỉ ống chất liệu khác nh quy định phần dụng cụ Các ống trụ tạo thành hình lục giác cách tâm khoảng 2,8 cm Chia 12 hộp Petri để xây dựng đờng chuẩn thành nhóm, nhóm hộp Dung dịch có nồng độ trung gian đợc lấy làm nồng độ kiểm tra dùng hiệu chỉnh giá trị đo đợc nhóm Đổ đầy dung dịch kiểm tra vào ống trụ, bố trí xen kẽ hộp Petri Các ống trụ lại đợc đổ đầy dung dịch có nồng độ nhóm Sau ủ hộp nhiệt độ thích hợp 32 - 35 0C (theo chØ dÉn b¶ng 2) kho¶ng 16 - 18 giê đo đợc giá trị đờng kính vòng vô khn cđa nång ®é kiĨm tra theo nhãm Tỉng sè nhóm đo đợc 36 giá trị đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ kiểm tra Độ xác kết đo 0,1 mm Cách tính Giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ a, b, d, e; giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm hộp (9 kết quả) Ca, Cb, Cd, Ce giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ kiểm tra tất 12 hộp (ký hiệu C), gồm 36 kết So sánh giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm với giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ kiểm tra 12 hép(C) HiƯu cđa chóng (C - C a; v v ) số hiệu chỉnh dùng để điều chỉnh giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ nhóm Cộng đại số giá trị hiệu chỉnh đạt đợc vào giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ nhóm ta đợc giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn hiệu chỉnh nồng độ a, b, d, e Thí dụ: Giá trị trung bình đờng kính 36 vòng vô khuẩn nồng độ kiểm tra tính đợc 19,2 mm; giá trị trung bình đờng kính vòng vô khn ë nång ®é kiĨm tra cđa nhãm nång ®é a lµ Ca = 19,0 mm Sè hiƯu chØnh lµ 19,2 - 19,0 = 0,2 mm Giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ nhóm 17,9 mm Vậy giá trị trung bình đờng kính vòng vô khuẩn nồng độ nhóm sau hiệu chỉnh a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đờng chuẩn qua điểm giá trị trung bình hiệu chỉnh Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh àg đơn vị hoạt lực ml Trên trục hoành (chia theo thang số học) lấy giá trị đờng kính vòng ức chế Nh đờng chuẩn đợc vẽ qua điểm tơng ứng với giá trị đờng kính vòng ức chế cao thấp tính đợc phơng trình sau: L = 3a + 2b + C -e H = 3e + 2d + C -a L: §êng kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ thấp đờng chuẩn H: Đờng kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ cao đờng chuẩn C: Đờng kính trung bình 36 kết nồng độ kiểm tra a, b, d, e: Những giá trị ®êng kÝnh trung b×nh ®· hiƯu chØnh cho tõng dung dịch lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thÊp nhÊt tíi nång ®é cao nhÊt Ba hép Petri dùng cho mẫu thử nghiệm đợc tiến hành đồng thời xây dựng đờng chuẩn Trong ba hộp nhỏ xen kẽ nồng độ trung gian dung dịch chuẩn với nồng độ mẫu thử pha loãng với dung dịch đệm thích hợp để có nồng độ giả định tơng đơng nồng độ trung gian chuẩn Sau đo đờng kính vòng vô khuẩn mẫu thử, tính trung bình hiệu chỉnh theo giá trị đờng kính nồng độ trung gian đợc đờng kính chế phẩm thử Trên trục hoành ứng với giá trị đờng kính vừa tìm đợc mẫu thử, kẻ đờng vuông góc với trục hoành cắt đờng đờng chuẩn vừa vẽ đợc điểm từ điểm đờng chuẩn hạ vuông góc với trục tung tìm đợc giá trị nồng độ ứng với đờng kính mẫu thử Hoạt lực chế phẩm đợc tính phần trăm so với chuẩn theo công thức sau: = Hoạt lực tìm thấy chế R% phẩm ì 100 Hoạt lực tìm thấy nồng độ trung gian ... - mm (riêng với amphotericin B nystatin độ dày - mm, bleomycin, mithramycin độ dày - mm) Thạch dinh dỡng đợc đổ thành lớp hai lớp (gồm lớp vi khuẩn lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy