15.7 XÁC ĐỊNH TÍNH VƠ KHUẨN CHO VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ Quy định chung: Một thử nghiệm quan trọng Tổ chức Y tế giới (WHO) khuyến cáo để kiểm soát chất lượng vắc xin sinh phẩm y tế thử nghiệm vô trùng Nhằm phát tác nhân ngoại lai vi sinh vật sống nhiễm vào sản phẩm, thử nghiệm vô trùng không thực giai đoạn thành phẩm mà phải thực nhiều giai đoạn trình sản xuất Theo khuyến cáo WHO, thử nghiệm vô trùng phải thực điều kiện hốt Biosafety Cabinet class II đạt cấp độ A, phòng cấp độ B Phòng phải kiểm soát áp xuất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí giám sát vi sinh Nhân viên thực thử nghiệm vô khuẩn phải người đào tạo, có hiểu biết kinh nghiệm thực hành, trang bị phương tiện bảo hộ vô trùng tuân thủ quy trình vào khu vực Môi trường dùng cho thử nghiệm vô khuẩn: Gồm loại môi trường Thioglycolat Soybean Casein Digest (SCD) dạng nước Môi trường Thioglycolat dùng để phát vi khuẩn hiếu khí kỵ khí Mơi trường Soybean Casein Digest (SCD) dùng để phát vi khuẩn hiếu khí nấm Có thể dùng mơi trường khác thay môi trường thẩm định Lấy mẫu: Mẫu để thử vơ trùng phải mang tính đại diện cho tồn lơ sản xuất bao gồm mẫu lấy phần có nguy bị nhiễm cao Ít giai đoạn bán thành phẩm cuối thành phẩm phải lấy mẫu để kiểm tra vô trùng Phương pháp cấy trực tiếp để phát nhiễm vi khuẩn nấm: Trước kiểm tra vô trùng cần phải xác định xem vắc xin, sinh phẩm có chứa hay khơng chứa chất bảo quản có khả diệt ức chế phát triển vi sinh vật Nếu có, cần phải áp dụng biện pháp thích hợp chẳng hạn tăng thể tích môi trường nuôi cấy lọc qua màng lọc Mẫu thử cần khử trùng sơ bên xịt ethanol 70 0C lọc vô trùng, trước chuyển vào phòng Ngay trước thực thao tác cấy vô trùng, mẫu thử cần khử trùng lại Với vắc xin sinh phẩm đóng ống, phải dùng cưa, gạc vô trùng để cưa bẻ ống mẫu thử Với vắc xin, sinh phẩm vắc xin đông khô phải hồi chỉnh với dung dịch kèm trước cấy vào môi trường Riêng mẫu vắc xin BCG đông khô (dạng ampoule) trước khử trùng sơ bộ, cần kiểm tra độ chân không để loại bỏ ống không đạt tiêu chuẩn Với sinh phẩm vắc xin phối hợp gồm nhiều thành phần (ví dụ: DTP- HB- IPV DTP- HBIPV – Hib) để kiểm tra tính vơ khuẩn sinh phẩm phải hỗn hợp thành phần vắc xin lại với trước cấy vào môi trường Với sản phẩm bột khơ đóng dạng viên nén trước cấy phải hòa tan mẫu thử vào nước muối sinh lý nước cất vơ khuẩn Sau cấy sang môi trường Thioglycolat Soybean – Casein Digest Lượng môi trường đóng ống định quan kiểm định quốc gia, sau qua thử nghiệm thẩm định Số lượng mẫu cấy, nhiệt độ thời gian theo dõi tương tự với vắc xin sinh phẩm dạng nước Sau cấy, cần kiểm chứng lại dung dịch nước muối sinh lý nước cất cách lấy ml, cấy ml vào ống thioglycolat ống SCD Các ống Thioglycolat kiểm chứng ủ nhiệt độ 30 0C – 35 oC, ống SCD ủ nhiệt độ 20 – 25 0C với môi trường cấy mẫu kiểm tra Cách cấy: Lắc kỹ mẫu thử trước cấy vào môi trường, dùng bóp cao su pipet aid có cắm pipét Pasteur vơ trùng để hút mẫu thử Đẩy hết khí thừa đầu pipét Đưa pipét xuống tận đáy ống môi trường, vừa phối hợp động tác bơm mẫu thử vừa kéo pipet khỏi môi trường thử Với vắc xin, sinh phẩm đóng sẵn bơm tiêm bơm trực tiếp sản phẩm vào mơi trường ni cấy Mỗi loạt môi trường pha chế dùng thử nghiệm vơ khuẩn phải kiểm tra chất lượng tính vơ trùng, tính tăng sinh, khả trung hòa chất ức chế Kiểm tra vô khuẩn bán thành phẩm cuối Mỗi mẫu bán thành phẩm lấy 10 ml, cấy vào hai loại môỉ trường Thioglycolat SCD, ống môi trường 1ml hết Sau cấy xong ống môi trường thioglycolat chia để ủ nhiệt độ 30 – 35 0C 20 – 25 0C, ống SCD ủ 20 – 25 C thời gian 14 ngày Kiểm tra vơ trùng thành phẩm: Lượng VX-SP có lọ Lượng VX- SP lấy để cấy Lượng VX- SP cấy vào ống MT Ít ml Toàn Toàn Từ ml đến < ml 1ml 1ml Từ ml đến < ml ½ thể tích 1ml Từ ≥ ml đến < 20 ml ml 1ml Từ ≥ 20 ml đến ≤ 100ml 10% thể tích 1ml >100ml 10% 50 ml 1ml Lưu ý: Thể tích mơi trường phải phù hợp để đảm bảo có mặt mẫu thử không ảnh hưởng đến dinh dưỡng môi trường Cấy chuyển Đối với sản phẩm không làm đục môi trường (globulin miễn dịch, dị nguyên gây bệnh không gây bệnh, kháng nguyên, dung dịch hồi chỉnh v.v.), ống môi trường theo dõi hàng ngày vòng 14 ngày Đối với sản phẩm làm đục môi trường nuôi cấy (những sản phẩm có chất hấp phụ, sinh khối chứa tế bào não) sau cấy -7 ngày phải cấy chuyển ml sang ống môi trường tương ứng theo thứ tự ủ tiếp nhiệt độ quy định Hàng ngày theo dõi ghi chép Đọc kết cuối vào ngày thứ 14 Lưu ý: Đối với vắc xin vi rút sản xuất ni tế bào mơ động vật thí nghiệm, ngồi thử nghiệm vô trùng để phát nhiễm vi khuẩn nấm nêu cần phải áp dụng phương pháp kiểm tra đặc biệt để phát có mặt Mycoplasma virus ngoại lai Phương pháp kiểm tra quan Kiểm định quốc gia quy định Đối với vắc xin bất hoạt cần kiểm tra bất hoạt hoàn toàn vi sinh vật có mặt vi sinh vật ngoại lai theo phương pháp đặc biệt theo tiêu chuẩn riêng cho loại chế phẩm Đọc kết cuối cách quan sát đại thể, trường hợp có nhiễm khuẩn phải kiểm tra vi thể tồn ni cấy 14 ngày theo dõi Đánh giá Sản phẩm coi vơ trùng khơng có ống môi trường bị nhiễm Trường hợp bị nhiễm phải làm đồ phiến nhuộm Gram soi kính hiển vi để phát vi khuẩn Gram (+), Gram (-) nấm nhắc lại thử nghiệm với mẫu lưu Nếu không bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai sản phẩm coi vô trùng Nếu bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai, dù ống có loại vi sinh vật lần thứ loạt sản phẩm khơng đạt u cầu vơ trùng, phải huỷ bỏ Nếu kết nhuộm soi lần kiểm tra thứ thứ không loại vi sinh vật, phải tiến hành kiểm tra lần thứ Nếu lần kiểm tra thứ kết không bị nhiễm, chế phẩm coi vô trùng Nếu lần thử thứ bị nhiễm dù ống, cho dù loại vi sinh vật sản phẩm coi khơng đạt u cầu vô trùng Lập hồ sơ Người thực phải ghi chép đầy đủ, xác tồn q trình tiến hành thử nghiệm bao gồm: Giám sát môi trường làm việc: Áp suất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí giám sát vi sinh Mẫu thử: Tên, số loạt, ngày sản xuất, hạn dùng, tên nhà sản xuất Môi trường nuôi cấy: Tên, số loạt, ngày pha chế, số lượng ống sử dụng, thể tích mơi trường ống Tên người thực hiện, ngày bắt đầu thử nghiệm, lượng mẫu thử cấy vào ống môi trường, theo dõi giám sát: nhiệt độ, thời gian suốt trình thử nghiệm, ngày kết thúc (ngày đọc kết ), kết luận Những số liệu phải lưu giữ hết hạn sử dụng loạt sản phẩm phải sẵn sàng cung cấp đầy đủ cho quan Kiểm định quốc gia cần tra ... ống SCD ủ 20 – 25 C thời gian 14 ngày Kiểm tra vơ trùng thành phẩm: Lượng VX- SP có lọ Lượng VX- SP lấy để cấy Lượng VX- SP cấy vào ống MT Ít ml Toàn Toàn Từ ml đến < ml 1ml 1ml Từ ml đến < ml... vắc xin bất hoạt cần kiểm tra bất hoạt hoàn toàn vi sinh vật có mặt vi sinh vật ngoại lai theo phương pháp đặc biệt theo tiêu chuẩn riêng cho loại chế phẩm Đọc kết cuối cách quan sát đại thể,... ngày Đối với sản phẩm làm đục mơi trường ni cấy (những sản phẩm có chất hấp phụ, sinh khối chứa tế bào não) sau cấy -7 ngày phải cấy chuyển ml sang ống môi trường tương ứng theo thứ tự ủ tiếp nhiệt