Nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ loài san hô mềm menella woodin ở vùng biển cô tô

viện HàN LÂM khoa học công nghệ việt nam ViƯn c«ng nghƯ sinh häc CHÂU NGỌC ĐIỆP NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ LỒI SAN HƠ MỀM MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN CÔ TÔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Châu Ngọc Điệp NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢU TỪ LỒI SAN HƠ MỀM MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN CƠ TƠ Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hoài Nam Viện Hóa sinh biển PGS.TS Đỗ Thị Thảo Viện Cơng nghệ sinh học Hà Nội, 2019 Lời cảm ơn Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Hoài Nam PGS.TS Đỗ Thị Thảo hai thầy hướng dẫn tận tình, chu đáo, chia sẻ kinh nghiệm quí báu tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Viện Hóa sinh Hữu Thái Bình Dương - Phân Viện Viễn đơng Liên Xơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Liên Bang Nga tạo điều kiện cho tơi làm việc, hồn thành thủ tục giấy tờ học tập phòng thí nghiệm để thực tốt luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể Phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, giúp đỡ tơi hồn thành nghiên cứu hoạt tính sinh học Tôi xin cảm ơn GS.TS Valentin A Stonik cộng Viện Hóa sinh Hữu Thái Bình Dương giúp đỡ tơi thời gian thực tập Viện Tôi xin cảm ơn GS.TS Đỗ Công Thung cán kiêm thợ lặn Viện Tài nguyên Môi trường biển, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi q trình thu mẫu ngồi biển Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sở đào tạọ Viện Công nghệ sinh học ThS Bùi Thị Hải Hà cán phụ trách đào tạo giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2019 Tác giả NCS Châu Ngọc Điệp i Lời cam đoan Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi thực hiện, số kết có cộng tác với cộng khác Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, số kết lần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành có uy tín với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày … tháng … năm 2019 Tác giả NCS Châu Ngọc Điệp ii MỤC LỤC Lời cảm ơn………………………………………………………………………………………… i Lời cam đoan……………………………………………………………………………………… ii MỤC LỤC………………………………………………………………………………………… iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT…………………………… vii DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………………… x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung san hô mềm 1.1.1 Đặc điểm sinh học san hô mềm 1.1.2 Đặc điểm sinh sản 1.1.3 Đặc điểm phân bố 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ giống Menela 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu số lồi san hơ mềm Việt Nam 17 1.3 Giới thiệu lồi san hơ mềm Menella woodin 20 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết 22 2.2.2 Phương pháp phân lập xác định cấu trúc hóa học 25 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 27 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Thu mẫu, xử lý mẫu, tạo dịch chiết 31 3.2 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ mẫu dịch chiết thô 33 3.3 Phân lập hợp chất từ loài Menella woodin 33 iii 3.4 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc 3.4.1 Hợp chất MW1 (Menellsteroid E): 1β,3β,5α,11β tetrahydroxycholestan-6-one (chất mới) 3.4.2 38 Hợp chất MW3 (Menellsteroid G): 24-methylcholest-24(28)-ene-3β, 5α,6β,11β-tetraol (chất mới) 3.4.4 37 Hợp chất MW2 (Menellsteroid F): Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới) 3.4.3 37 39 Hợp chất MW4 (Menellsteroid H): 24-Norcholest-22(E)-ene 3β,5α,6β,11β-tetraol (chất mới) 40 3.4.5 Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol 41 3.4.6 Hợp chất MW6: Menellsteroid B 41 3.4.7 Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22 diene3β,5α,6β,9-tetraol 3.4.8 Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7trien-12,8-olide (chất mới) 3.4.9 42 42 Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian3,5,7-trien-12,8-olide (chất mới) 43 3.4.10 Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới) 44 3.4.11 Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới) 45 3.4.12 Hợp chất MW12: Menverin A 46 3.4.13 Hợp chất MW13: Menverin B 46 3.4.14 Hợp chất MW14: Menverin C 46 3.4.15 Hợp chất MW15: Menverin F 47 3.4.16 Hợp chất MW16: Menelloide B 47 3.4.17 Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol 48 3.5 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hợp chất phân lập đƣợc 48 3.6 Xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS 49 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 iv 4.1 Hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết thô 51 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc 51 4.2.1 Hợp chất MW1: Menellateroid E (1β,3β,5α,11β tetrahydroxycholestan-6-one) (chất mới) 4.2.2 Hợp chất MW2: Menellsteroid F (Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11βtetraol) (chất mới) 4.2.3 53 Hợp chất MW3: Menellsteroid G (24-methylcholest-24 (28)-ene3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới) 4.2.4 51 54 Hợp chất MW4: Menellsteroid H (24-Norcholest-22(E)-ene3β,5α,6β,11β-tetraol) (chất mới) 55 4.2.5 Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol 56 4.2.6 Hợp chất MW6: Menellsteroid B (cholest-22-ene-3β,5α,6β,11βtetraol) 58 4.2.7 Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene3β,5α,6β, 9-tetraol 4.2.8 Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7trien-12,8-olide (chất mới) 4.2.9 59 61 Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3, 5,7-trien-12,8-olide (chất mới) 64 4.2.10 Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới) 67 4.2.11 Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới) 69 4.2.12 Hợp chất MW12: Menverin A 71 4.2.13 Hợp chất MW13: Menverin B 72 4.2.14 Hợp chất MW14: Menverin C 73 4.2.15 Hợp chất MW15: Menverin F 74 4.2.16 Hợp chất MW16: Menelloide B 76 4.2.17 Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol 77 4.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ hợp chất phân lập đƣợc 80 4.4 Hoạt tính ức chế sản sinh ROS 80 v KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 83 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Ac Acethyl CC Column Chromatography Circular Dichroism CD Spectroscopy CH2Cl2 Dichloroform CHCl3 Choloroform 13 C-NMR Phổ nhị sắc tròn Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 Phổ tương tác hai chiều 1 H- H COSY Correlation Spectroscopy Công thức phân tử CTPT DEPT proton Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer Electron Spray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun mù Spectrometry điện tử Et Ethyl C2 H5 EtOAc Ethyl acetate ESI-MS Human hepatocellular Hep-G2 carcinoma Ung thư gan Human promyelocytic HL-60 HMBC H-NMR leukemia Ung thư máu cấp tính Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Correlation nhiều liên kết Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton vii High Performance Liquid HPLC Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Phổ khối phân giải cao ion hóa HR-ESI-MS Spectrometry phun mù điện tử IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại Hằng số tương tác tính J (Hz) Hz KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% Human prostate LNCaP adenocarcinoma Ung thư tiền liệt tuyến Human bronchogenic LU-1 carcinoma Ung thư phổi MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú Me Methyl MeOH Methanol Mp Melting point Điểm chảy Medium Performance Liquid MPLC Chromatography n-Hexane n-Hexane NIH/3T3 Human Normal cell Sắc ký lỏng trung bình Tế bào lành Nuclear Overhauser Effect NOESY Spectroscopy Phổ NOESY OD Optical Density Mật độ quang OMe Methoxy viii Phổ COSY hợp chất MW13 Phổ ROESY hợp chất MW13 54 Phụ lục 14: Dữ kiện phổ hợp chất: Menverin C (MW14) Phổ 1H-NMR hợp chất MW14 Phổ 13C-NMR hợp chất MW14 55 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất MW14 C Cb,c 85,2 85,23 - 34,2 34,26 1,73 m/2,40 m 3, 4, 29,8 29,84 2,47 m/2,59 m 1, 4, 154,2 154,23 42,8 42,84 3,13 m 26,4 26,38 2,73 ddd (3,0, 12,5, 18,5) C a Hb,d (J = Hz) HMBC - 1, 5, 7, 8, 11 2,92 dd (4,0, 18,5) 148,3 147,97 - 149,2 149,26 - 116,3 116,30 5,65 s 10 73,5 73,55 - 11 127,6 127,66 - 12 169,9 169,86 - 13 8,9 8,91 14 107,1 107,14 1,94 s 4,93 dd (2,0, 4,0) 1, 7, 15 7, 11, 12 3, 5,09 dd (2,0, 4,0) 15 26,1 26,14 1,55 s 1, 9, 10 C menverin C (Zhang W, 2004), bđo CDCl3, c125 MHz, d500 MHz a 56 Phổ HSQC hợp chất MW14 Phổ HMBC hợp chất MW14 57 Phụ lục 15: Dữ kiện phổ hợp chất: Menverin F (MW15) Phổ 1H-NMR hợp chất MW15 Phổ 13C-NMR hợp chất MW15 58 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất MW15 C Cb,c 83,7 83,63 - 35,8 35,69 1,96 m/1,99 m 3, 4, 28,3 28,30 2,54e 1, 4, 152,6 151,88 46,8 46,42 2,51e 28,2 21,89 2,21 t (13,0)/2,80 dd (2,5, C a Hb,d (J = Hz) HMBC - 1, 5, 7, 8, 11 13,5) 156,9 157,89 - 105,9 105,25 - 65,4 65,39 3,42 s 10 62,5 62,50 - 11 126,2 125,92 - 12 171,0 171,73 - 13 8,7 8,66 14 107,3 107,08 15 19,7 19,71 1,86 s 4,93 d (2,0)/5,06 dd (2,0, 5,0) 1,50 s 1, 7, 15 7, 11, 12 3, 1, 9, 10 C menverin F (Li L, 2008), bđo CDCl3, c125 MHz, d500 MHz, etín hiệu a bị chồng lấp 59 Phổ HSQC hợp chất MW15 Phổ HMBC hợp chất MW15 60 Phụ lục 16: Dữ kiện phổ hợp chất: Menelloide B (MW16) Phổ 1H-NMR hợp chất MW16 Phổ 13C-NMR hợp chất MW16 61 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất MW16 C Cb,c 49,5 50,95 2,86 m 29,0 30,20 1,79 m/1,94 m 32,2 33,29 2,40 m/2,51 m 155,3 157,04 45,8 47,29 2,70 br dd (10,5, 12,5) 29,0 29,67 2,25 br t (12,5)/2,60 br d C a Hb,d (J = Hz) HMBC (H  C) - 1, 5, 7, 8, 11 (12,5) 161,0 163,18 - 103,6 106,57 - 45,1 45,53 2,44 br d (13,0)/2,93 br d 1, 7, 8, 10, 15 (13,0) 10 142,8 144,24 - 11 123,5 124,24 - 12 171,9 174,64 - 13 8,0 7,88 14 107,2 107,19 5,03/5,05e 3, 4, 15 117,5 117,29 5,04e 1, 9, 10 1,84 s 7, 11, 12 C menelloide B (Kao SY, 2011), bđo CD3OD, c125 MHz, d500 MHz, etín a hiệu bị chồng lấp 62 Phổ HSQC hợp chất MW16 Phổ HMBC hợp chất MW16 63 Phụ lục 17: Dữ kiện phổ hợp chất: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol (MW17) Hình 4.130 Phổ 1H-NMR hợp chất MW17 Hình 4.131 Phổ 13C-NMR hợp chất MW17 64 Bảng số liệu phổ NMR hợp chất MW17 C Cb,c 50,7 50,70 1,88 m 21,5 21,54 1,65 m/1,77 m 40,4 40,48 1,63 m/1,70 m 80,2 80,23 - 50,3 50,33 2,17 m 121,3 121,34 5,50 br d (2,0) 149,6 149,65 - 25,1 25,09 1,94 m/2,19 m 42,6 42,62 1,48 m/1,81 m 10 75,2 75,29 - 11 37,3 37,31 2,24 m 12 21,4 21,39 0,98 d (7,0) 7, 11, 13 13 21,3 21,20 0,98 d (7,0) 7, 11, 12 14 22,5 22,56 1,21 s 3, 4, 15 21,2 21,44 1,29 s 1, 9, 10 C a a Hb,d (J = Hz) HMBC (H  C) 1, 4, 8, 11 1, 7, 8, 10, 15 C 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-guaianediol (Zhang GW, 2006a), bđo in CDCl3, c125 MHz, d500 MHz 65 Phổ HSQC hợp chất MW17 Phổ HMBC hợp chất MW17 66 Phụ lục 18: Một số hình ảnh thu thập mẫu quần đảo Cô Tô (Tháng 04/2014) 67 ... HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Châu Ngọc Điệp NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƢU TỪ LỒI SAN HƠ MỀM MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN CƠ TƠ Chun ngành:... trình nghiên cứu hợp chất thứ cấp từ lồi san hơ mềm mức độ khiêm tốn Do đó, định lựa chọn đề tài khuôn khổ luận án Tiến sỹ: Nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất gây độc tế bào ung thƣ từ loài san hô mềm. .. học hoạt tính gây độc tế bào ung thư số hợp chất phân lập từ lồi san hơ mềm Menella woodin thu thập vùng biển Cô Tô - Quảng Ninh 4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung san hô mềm